我们报道了一种通过在脂质双层中掺杂铜(II) 2,9,16,23-四-叔丁基-29H,31H-酞菁（CuPc）分子，在水/空气界面制备杂化脂质膜的方案。所得的杂化脂质膜具有脂质/CuPc/脂质的三明治结构。该方案也可用于其他功能纳米材料的构建。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由于具有独特的性质，包括超薄厚度（3-4 nm）、极高的电阻率、流动性以及自组装能力，脂质双层易于功能化，已被广泛应用于生物传感器和生物器件等领域。在本研究中，我们引入了一种平面有机分子：铜(II) 2,9,16,23-四-叔丁基-29H,31H-酞菁（CuPc），用于掺杂脂质膜。该CuPc/脂质杂化膜通过自组装在水/空气界面形成。在此膜结构中，疏水性的CuPc分子位于脂质分子的疏水尾部之间，形成脂质/CuPc/脂质的三明治结构。有趣的是，通过将该杂化膜转移至硅基底上，可轻易构建出一种在空气中稳定的杂化脂质双层膜。我们报道了一种将纳米材料整合入脂质双层系统的简便方法，这为生物传感器和生物器件的制备提供了一种新的技术路径。
引言
作为细胞膜的基本结构框架，细胞内部与外部环境由脂质双分子层系统分隔开来。该系统由两亲性磷脂分子构成，这些磷脂分子包含亲水性的磷酸酯“头部”和疏水性的脂肪酸“尾部”。由于脂质双分子层在水环境中具有显著的流动性与自组装能力1,2，因此可通过简单方法构建人工脂质双分子层3,4。多种类型的膜蛋白，如离子通道、膜受体和酶，已被整合至人工脂质双分子层中，以模拟并研究细胞膜的功能5,6。近年来，脂质双分子层还被掺杂纳米材料（例如金属纳米颗粒、石墨烯和碳纳米管），以形成具有特定功能的杂化膜7,8,9,10,11,12,13。目前构建此类杂化膜的常用方法是先制备掺杂脂质体，即在脂质体中包载疏水性材料，如修饰后的金纳米颗粒7或碳纳米管11，随后将这些脂质体融合形成平面支撑脂质双分子层。然而，该方法过程复杂且耗时，限制了此类杂化膜的广泛应用潜力。
本研究中，通过将有机分子掺杂到脂质膜中，自组装形成水/空气界面的杂化脂质膜。该方案包括三个步骤：混合溶液的制备、在水/空气界面形成杂化膜，以及将膜转移至硅基底上。与此前报道的其他方法相比，本方法更为简便，且无需复杂的仪器设备。利用该方法可在更短时间内制备出面积更大、在空气中稳定的杂化脂质膜。本研究所用的纳米材料为一种半导体性有机分子——铜(II) 2,9,16,23-四-叔丁基-29H,31H-酞菁（CuPc），该分子广泛应用于太阳能电池、光电探测器、气体传感器及催化等领域14,15。CuPc是一种具有平面结构的小分子有机物，因其疏水特性，易与磷脂分子的“尾部”相互作用。已有研究报道，CuPc分子可在单晶表面自组装形成高度有序的结构16,17。因此，CuPc分子极有可能通过自组装方式嵌入脂质双层结构中。
我们详细描述了形成膜所采用的步骤，并提供了一些顺利实施该方法的建议。此外，我们展示了杂化脂质膜的一些代表性结果，并讨论了该方法的潜在应用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 杂交溶液的制备
- 将四个 4 mL 的一次性玻璃小瓶及带聚四氟乙烯（PTFE）涂层密封垫的螺旋盖依次在蒸馏水（经过滤系统纯化）、乙醇和氯仿中各超声清洗 10 分钟。然后用氮气流吹干玻璃小瓶和瓶盖。
- 在厌氧手套箱中，将粉末状 CuPc 溶于氯仿，于已清洗的玻璃小瓶中配制浓度为 10 mg/mL 的 CuPc 储备液。
- 用 0.2 µm 聚四氟乙烯（PTFE）膜过滤 CuPc 溶液。
- 将过滤后的溶液储存于已清洗并充满氮气的玻璃小瓶中，并用封口膜密封小瓶。
- 从 -80 °C 冰箱中取出购买的 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DPhPC）氯仿溶液（25 mg/mL），使其恢复至室温。
- 使用涡旋混合器以 2300 rpm 转速搅拌 DPhPC 溶液 10 秒。
- 用氯仿冲洗玻璃微量注射器 5 次。
- 使用已清洗的注射器将 200 µL DPhPC 氯仿溶液转移至预清洗过的玻璃小瓶中，并用温和的氮气流蒸发小瓶中的溶剂。
- 用氯仿冲洗玻璃微量注射器 5 次。
- 使用洁净的注射器向含 DPhPC 的玻璃小瓶中加入 202.6 µL 氯仿。
- 向 DPhPC 溶液中加入 47.4 µL 过滤后的 10 mg/mL CuPc 溶液。DPhPC 与 CuPc 的摩尔比应为 10:1。
- 用氯仿冲洗玻璃微量注射器 5 次。
- 使用注射器向溶液中加入 250 µL 正己烷。最终溶液浓度应为 10 mg/mL。
- 使用涡旋混合器以 2300 rpm 转速混合溶液 10 秒。
- 用 0.2 µm 聚四氟乙烯（PTFE）膜过滤 CuPc 溶液。
- 用封口膜密封玻璃小瓶，将其放入充满氮气的自封袋中，并将自封袋置于 -20 °C 冰箱中保存。
注意：在步骤 1.13 之后，DPhPC 与 CuPc 已溶解于氯仿与正己烷（体积比 1:1）的混合溶剂中。此外，DPhPC 与 CuPc 的摩尔比不限于 10:1；在脂质浓度保持恒定（10 mg/mL）的条件下，可采用不同的摩尔比。根据先前实验结果，摩尔比在 10:1 至 3:1 范围内更有利于形成高质量的杂化脂质膜。
2. 在水/空气界面形成杂化膜
- 从硅晶圆上切割出 3 cm × 3 cm 的硅基底。
- 将 3 cm × 3 cm 的硅基底依次在超声波清洗仪中用纯水清洗 10 分钟，随后用乙醇和氯仿各清洗一次。再用 O2 等离子体处理硅基底 5 分钟，以去除表面吸附的有机物并提高其亲水性。
- 用流动的纯水冲洗内径为 7.5 cm 的聚四氟乙烯烧杯 3 分钟。
- 将清洗后的硅基底放入已清洗的 PTFE 烧杯中，使基底与水平面成 30° 倾斜角。
- 向聚四氟乙烯烧杯中加入足量的纯水，直至完全浸没硅基底。
- 从冰箱中取出预先配制的杂化溶液，使其恢复至室温。
- 使用涡旋混合器以 2300 rpm 的速度搅拌杂化溶液 15 秒。
- 用氯仿冲洗玻璃微量注射器（50 µL）5 次。
- 用注射器将 3–5 µL 杂化溶液滴加到水面上，形成漂浮的杂化脂质膜。
注意：滴加溶液时，应使液滴尽可能靠近水面（距离小于 1 cm）。需注意的是，单层杂化膜肉眼不可见，而多层杂化膜则呈现为薄而蓝色的膜状物。为将多层杂化膜转移至硅基底上，滴加混合溶液时应尽可能靠近硅基底。
3. 将膜转移至硅基底上
- 有机溶剂挥发后（耗时少于2秒），通过蠕动泵驱动的橡胶管以3 mm/min的速率抽出水，降低水位，将漂浮的杂化膜转移至Si基底上。
- 转移过程完成后（约5分钟），将Si基底置于洁净室擦拭纸上，使残留的水分完全蒸发。
注意：以如此低的速率降低水位可最大限度减少水的湍流，从而保护薄膜。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
由于含有CuPc分子，所形成的膜呈均匀的浅蓝色。有色膜的面积通常为数平方厘米。在图1A和图1B中，我们展示了在Si基底上形成的杂化脂质膜的显微图像以及原子力显微镜（AFM）图像（包括高度轮廓图）。在AFM图像中，左上方的膜较厚，厚度为79.4 nm，而右下方的膜较薄，厚度为4.9 nm。薄膜的表面粗糙度为Ra = 0.4 nm，接近于经清洗后的Si基底的粗糙度。此外，基于多次测量结果，膜厚度呈现出以5 nm为增量的离散分布18。由于文献报道的DPhPC脂质双层膜厚度约为4 nm19，因此可以推断，5 nm厚的薄膜为掺杂CuPc的脂质双层膜，而较厚的膜则由多层掺杂脂质双层堆叠而成。
采用能量色散X射线（EDX）分析进一步研究了Si基底上杂化膜的组成。根据图2所示数据计算，代表性元素Cu、P、N和C的原子比例分别为...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在杂化膜的前驱体溶液中，使用混合有机溶剂（氯仿和正己烷）而非纯氯仿来溶解脂质和CuPc。如果使用纯氯仿，前驱体溶液的密度将高于水，因此该溶液极有可能沉入水底，而不是在水面上铺展。加入低密度溶剂正己烷可确保溶液浮在水面上，并在溶剂蒸发后形成均匀的杂化膜。还应注意的是，溶液一旦接触水面，总会观察到轻微的表面波动，这可能是由于膜和有机溶剂的铺展改变了水的表面张力所致。由于杂化膜极薄且脆弱，微小的扰动就会破坏膜的完整性，导致出现可见裂纹。因此，为防止进一步损伤，在杂化膜形成后，必须尽量减少膜周围的气流，并避免水的任何振动。如果条件允许，应将聚四氟乙烯烧杯放置在隔振台上。
成熟的朗缪尔-布洛杰特（Langmuir−Blodgett, LB）方法被广泛用于在水/空气界面形成脂质单层膜，其中脂质分子的亲水头部朝向水相，疏水尾部朝向空气。与LB方法不同，通过掺杂CuPc分子，我们的方法能够在水/空气界面一步形成具有双层结构的杂化膜。在该杂化膜中，推测疏水性的CuPc分子位于脂质分子疏水“尾部”之间，形成一种独特的脂质/CuPc/脂质三明治结构。我们通过荧光共振能量转移（FRET）测量实验验证了这一...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本科学技术振兴机构（CREST项目，编号JPMJCR14F3）以及日本促进科学基金（编号19H00846和18K14120）的资助。本研究部分在东北大学电气通信研究所纳米电子学与自旋电子学实验室完成。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯仿 | Wako Chemicals | 033-08631 | |
| CuPc | Sigma-Aldrich | 423165 | |
| DPhPc | Avanti Polar Lipids | 850356C | |
| 带螺口盖的玻璃小瓶 | Nichiden-Rike Glass Co., Ltd | 6-29801 | |
| 正己烷 | Wako Chemicals | 084-03421 | |
| 膜过滤器 | Merck Millipore Ltd. | R8CA42836 | |
| 微量注射器 | Hamilton | 80530 | |
| 蠕动泵 | Tokyo Rikakikai Co., Ltd. | 11914199 | |
| 涡旋混合器 | Scientific Industries, Inc. | SI-0286 |
参考文献
- Israelachvili, J. N., Mitchell, D. J., Ninham, B. W. Theory of self-assembly of lipid bilayers and vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes. 470 (2), 185-201 (1977).
- Venable, R. M., Zhang, Y., Hardy, B. J., Pastor, R. W. Molecular dynamics simulations of a lipid bilayer and of hexadecane: an investigation of membrane fluidity. Science. 262 (5131), 223-226 (1993).
- Ide, T., Ichikawa, T. A novel method for artificial lipid-bilayer formation. Biosensors and Bioelectronics. 21 (4), 672-677 (2005).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
- Demarche, S., Sugihara, K., Zambelli, T., Tiefenauer, L., Voros, J. Techniques for recording reconstituted ion channels. Analyst. 136 (6), 1077-1089 (2011).
- Sakaguchi, N., Kimura, Y., Hirano-Iwata, A., Ogino, T. Fabrication of Au-nanoparticle-embedded lipid bilayer membranes supported on solid substrates. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (17), 4474-4481 (2017).
- Schulz, M., Olubummo, A., Binder, W. H. Beyond the lipid bilayer: interaction of polymers and nanoparticles with membranes. Soft Matter. 8 (18), 4849-4864 (2012).
- Wang, J., Wei, Y., Shi, X., Gao, H. Cellular entry of graphene nanosheets: the role of thickness, oxidation and surface adsorption. RSC Advances. 3 (36), 15776-15782 (2013).
- Vögele, M., Köfinger, J., Hummer, G. Molecular dynamics simulations of carbon nanotube porins in lipid bilayers. Faraday Discussions. 209, 341-358 (2018).
- Kanomata, K., Deguchi, T., Ma, T., Haseyama, T., Miura, M., Yamaura, D., Tadaki, D., Niwano, M., Hirano-Iwata, A., Hirose, F. Photomodulation of electrical conductivity of a PCBM-doped free-standing lipid bilayer in buffer solution. Journal of Electroanalytical Chemistry. 832, 55-58 (2019).
- Barnoud, J., Rossi, G., Monticelli, L. Lipid Membranes as Solvents for Carbon Nanoparticles. Physical Review Letters. 112, 068102(2014).
- Dichello, G. A., et al. Preparation of liposomes containing small gold nanoparticles using electrostatic interactions. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 105, 55-63 (2017).
- Sullivan, P., Heutz, S., Schultes, S. M., Jones, T. S. Influence of codeposition on the performance of CuPc−C60 heterojunction photovoltaic devices. Applied Physics Letters. 84 (7), 1210-1212 (2004).
- Miyata, T., Kawaguchi, S., Ishii, M., Minami, T. High sensitivity chlorine gas sensors using Cu−phthalocyanine thin films. Thin Solid Films. 425 (1-2), 255-259 (2003).
- Barrena, E., de Oteyza, D. G., Dosch, H., Wakayama, Y. 2D supramolecular self-assembly of binary organic monolayers. ChemPhysChem. 8 (13), 1915-1918 (2007).
- Xiao, K., et al. Surface-induced orientation control of CuPc molecules for the epitaxial growth of highly ordered organic crystals on graphene. Journal of the American Chemical Society. 135 (9), 3680-3687 (2013).
- Feng, X., Ma, T., Yamaura, D., Tadaki, D., Hirano-Iwata, A. Formation and characterization of air-stable lipid bilayer membranes incorporated with phthalocyanine molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6515-6520 (2019).
- Wu, Y., He, K., Ludtke, S. J., Huang, H. W. X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophysical Journal. 68 (6), 2361-2369 (1995).
- Zaitseva, S. V., Bettini, S., Valli, L., Kolker, A. M., Borovkov, N. Y. Atypical film-forming behavior of soluble tetra-3-nitro-substituted copper phthalocyanine. ChemPhysChem. 20 (3), 422-428 (2019).
- Ghani, F., Gojzewski, H., Riegler, H. Nucleation and growth of copper phthalocyanine aggregates deposited from solution on planar surfaces. Applied Surface Science. 351, 969-976 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
