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通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

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DOI：

10.3791/60960

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2020年4月29日

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Universitat Pompeu Fabra, 3Vall d'Hebron Institute of Oncology

本文内容

摘要

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。

摘要

在哺乳动物发育过程中，细胞命运的决定依赖于调控网络的建立，这些网络定义了基因表达的特异性、时间和空间模式。由多能干细胞衍生的拟胚体（embryoid bodies, EBs）已成为研究三大胚层分化以及细胞命运决定过程中调控回路的常用模型。尽管已知组织特异性增强子通过与启动子相互作用在这些网络中发挥重要作用，但将增强子准确分配到其对应的靶基因仍具有挑战性。为实现这一目标，需要采用定量方法来研究发育过程中增强子-启动子之间的相互作用及其动态变化。本文中，我们改进了一种4C技术，用于在EB分化模型中鉴定增强子及其与对应启动子的相互联系。该方法采用高频切割的限制性内切酶、超声破碎，以及一种可与商业化DNA文库构建试剂盒兼容的嵌套连接介导PCR流程。随后，对4C文库进行高通量测序并进行生物信息学分析，从而检测和量化所有与选定启动子存在相互作用的序列。所获得的测序数据还可用于获取分化过程中增强子-启动子相互作用动态变化的信息。本研究所描述的EB分化模型中的技术易于实施。

引言

在小鼠中，3.5天龄胚胎的内细胞团（ICM）含有胚胎多能干细胞。ICM在第4.5天进一步发育为上胚层，产生外胚层、中胚层和内胚层细胞，即胚胎中的三个主要胚层。尽管ICM中的多能细胞在体内仅短暂存在，但可通过建立小鼠胚胎干细胞（mESCs）在体外培养中被捕获1,2,3。mESCs能够保持未分化状态并无限增殖，但在内在和外在刺激下，也可退出多能性状态，分化为三个发育胚层的细胞2,4。有趣的是，当在悬浮的小液滴中培养时，mESCs会形成三维聚集体（即拟胚体，EBs），并进一步分化为所有三个胚层的细胞5。拟胚体形成实验是研究早期谱系特化过程的重要工具。

在谱系特化过程中，各胚层的细胞会获得特定的基因表达程序4。基因的精确时空表达受到多种顺式调控元件的调控，包括核心启动子、增强子、沉默子和绝缘子6,7,8,9。增强子是一类通常跨越数百个碱基对的调控性DNA片段，可协调组织特异性的基因表达8。转录因子及其共因子通过结合增强子并调控局部染色质结构，从而激活或沉默增强子功能8,10。目前常用的鉴定潜在增强子的技术包括全基因组染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）以及利用测序技术检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）。因此，活性增强子通常具有特定的活性组蛋白修饰标记以及局部DNA可及性的增加11,12,13,14。此外，发育相关增强子被认为需要与其对应的启动子发生物理相互作用8,9。事实上，已有研究表明，破坏增强子-启动子相互作用的增强子变异或缺失可导致发育畸形15。因此，亟需开发新的技术，以提供额外信息用于识别调控发育过程中基因表达的功能性增强子。

自从染色体构象捕获（3C）技术16发展以来，染色体相互作用位点的图谱绘制已被广泛用于评估调控元件之间的物理距离。重要的是，近年来已开发出多种高通量版本的3C技术，提供了针对染色质片段间交联、消化、连接和相互作用回收的不同策略17。其中，原位Hi-C技术已成为一种流行方法，可实现全基因组范围内3C连接产物的测序18。然而，要达到适合分析增强子-启动子相互作用的分辨率，所需测序成本较高，使得该技术在特定基因座研究中难以应用。因此，研究人员开发了其他替代方法，以更高分辨率分析靶向基因座19,20,21,22。其中一种方法称为4C，即“一个对所有”策略，能够检测与选定视角位点发生相互作用的所有序列。然而，标准4C技术的一个缺点是需要进行反向PCR，该过程会扩增不同大小的片段，倾向于扩增较小产物，从而在高通量测序后的定量分析中引入偏差。最近，一种名为UMI-4C的新版4C技术被开发出来，该方法利用唯一分子标识符（UMI），实现了定量且靶向的染色体相互作用分析，克服了上述问题23。该方法采用高频切割酶、超声破碎以及嵌套连接介导的PCR流程，从而扩增出长度分布相对均一的DNA片段。这种均一性减少了PCR扩增过程中对较短序列的偏好性偏差，并有助于高效回收空间上相连的分子/片段，实现精确计数。

本文介绍了一种改进的UMI-4C技术方案，用于在拟胚体分化过程中识别并定量谱系指导性转录因子的启动子与增强子之间的染色质互作。

方案

1. 小鼠胚胎干细胞生成拟胚体

  1. 准备小鼠胚胎干细胞（mESC）无血清培养基：将DMEM/F12与神经基础培养基按1:1比例混合。培养基中添加MEM非必需氨基酸溶液（1x）、丙酮酸钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-巯基乙醇（50 µM）、N2和B27补充剂（1x）、PD0325901（1 µM）、CHIR99021（3 µM）以及白血病抑制因子（LIF）（1,000 U/mL）。
  2. 准备拟胚体（EB）分化培养基：DMEM中添加10%胎牛血清（FBS）、MEM非必需氨基酸（1x）、丙酮酸钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素-链霉素（100 U/mL）、β-巯基乙醇（50 µM）。
  3. 将mESC接种于预先用0.1%（w/v）明胶包被的10 cm塑料培养皿中，使用mESC无血清培养基进行培养。
  4. 当mESC达到60%融合度时，吸除培养基，并用2 mL无菌PBS轻轻洗涤1次。
  5. 完全吸除PBS，加入2 mL细胞解离培养基，在37 °C孵育5分钟。
  6. 向培养皿中加入8 mL EB分化培养基以终止反应。
  7. 通过移液器上下吹打15–20次，使mESC集落解离成单细胞悬液。
  8. 在室温（RT）下以300 × g离心5分钟，小心吸除上清液。
  9. 对细胞进行计数（例如使用血细胞计数板）。
  10. 用EB分化培养基重悬细胞沉淀，并调整细胞浓度至2 × 104 个细胞/mL。
  11. 将15 cm培养皿的皿盖翻转，在其表面使用200 µL多通道移液器滴加20 µL重悬细胞液（约400个细胞/滴）。
  12. 小心将皿盖翻转后扣于培养皿底部，形成悬滴，于37 °C、5% CO2、95%湿度条件下孵育3天。
  13. 用10 mL PBS轻轻冲洗皿盖以收集拟胚体（EBs），并将含有EB的悬液转移至50 mL塑料离心管中。
  14. 将离心管置于室温（RT）静置30分钟，使EB依靠重力沉降至管底，小心吸除上清液。
  15. 用10 mL新鲜EB分化培养基轻柔重悬EB，转移至10 cm细菌培养用培养皿中。
  16. 3–6天后使用倒置显微镜检查EB形成情况。所生成的EB应呈圆形且大小均一。
  17. 继续在37 °C、5% CO2、95%湿度条件下培养。EB将持续分化为三个胚层，可在不同时间点收集用于分析。

2. 胚状体的解离

  1. 从两个至三个10 cm培养皿中收集拟胚体（EBs）至一个50 mL塑料离心管中。在室温下以300 × g 离心5分钟，然后小心移除上清液。
  2. 用10 mL PBS重悬拟胚体（EBs）。在室温下以300 × g 离心3分钟，随后移除上清液。
  3. 向沉淀中加入2 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA，将离心管置于37 °C孵育15分钟。每隔3分钟用移液器吹打数次，以获得单细胞悬液。
  4. 加入8 mL拟胚体（EB）分化培养基以终止胰蛋白酶反应。在显微镜下检查拟胚体（EB）的解离情况，并进行细胞计数。

3. 固定

  1. 将细胞重悬于新鲜的EB培养基中，浓度为1 × 106 个细胞/mL。对于50 mL离心管，使用最多4.5 × 107 个细胞，加入45 mL培养基。
  2. 从37%的储存液（使用期限不超过6个月）中加入多聚甲醛，使其终浓度为1%。
    注意：操作多聚甲醛时应遵循适当的安全与健康规范，因其为有害化学品。
  3. 在室温下旋转孵育10分钟。
  4. 加入甘氨酸至终浓度0.125 M，以淬灭甲醛反应。
  5. 在室温下旋转孵育5分钟。
  6. 将固定后的细胞转移至冰上，此后始终保持低温（4 °C）。
  7. 在预冷的离心机中以300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。
  8. 弃去上清液，将沉淀用预冷的PBS重悬（每5 × 106 个细胞使用1 mL），然后转移至1.5 mL防漏离心管中。
  9. 在4 °C下以300 × g 离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀在液氮中迅速冷冻。可于-80 °C保存，或继续进行以下实验步骤。

4. 细胞裂解与限制性内切酶消化

  1. 每 2–5 × 106 个细胞，用 0.25 mL 新鲜配制的冰上预冷裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH = 8.0，10 mM NaCl，0.2% Igepal CA630 和 1× 蛋白酶抑制剂）轻轻重悬细胞沉淀。配制 5 mL 裂解缓冲液的方法见表 1。
  2. 将细胞在冰上孵育 15 分钟。
  3. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，保留含有细胞核的沉淀。
  4. 用 500 µL 冷裂解缓冲液洗涤沉淀的细胞核。
  5. 在 1.5 mL 离心管中，用 50 µL 含 0.5% SDS 的 1× 缓冲液 2 轻轻重悬沉淀，然后将离心管置于 62 °C 加热块中孵育 10 分钟。
  6. 从加热块中取出离心管，加入 170 µL 消化缓冲液（含 25 µL 10% Triton X-100）以淬灭 SDS。用移液器轻轻混匀，避免产生过多泡沫。
  7. 在 37 °C 下孵育 15 分钟。
  8. 加入 25 µL 消化缓冲液，通过倒置混匀，并取 8 µL 作为未消化对照样品。将未消化对照样品保存在 -20 °C。向剩余的细胞核中加入 100 U MboI 限制性内切酶（4 µL 的 25 U/µL 储液），在 37 °C 下旋转消化染色质 2 小时。再加入 100 U MboI，继续孵育 2 小时。
  9. 再加入 100 U MboI，在 37 °C 下旋转孵育过夜。
  10. 次日，再次加入 100 U MboI，在 37 °C 下旋转孵育 3 小时。
  11. 取 8 µL 作为已消化对照样品。通过加入 80 µL TE 缓冲液（10 mM Tris pH = 8，1 mM EDTA）和 10 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL），对已消化对照样品和步骤 4.8 中的未消化对照样品进行解交联。在 65 °C 下孵育 1 小时。
  12. 取 20 µL 样品在 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳，以检测消化效率。成功的消化应主要产生大小在 3.0–0.5 kb 范围内的片段。

5. 邻近连接与交联逆转

  1. 将经 MboI 消化的样品置于加热块中，在 65 °C 下孵育 20 分钟以灭活 MboI，然后冷却至室温。
  2. 在室温下以 1,000 × g 离心试管 5 分钟，移除上清液，并将沉淀溶解于 200 µL 新鲜连接酶缓冲液中。
  3. 向每个样品中加入 1,000 µL 连接反应主混合液。配制 1,000 µL 连接反应主混合液的方法见表 2。
  4. 通过倒置混匀，并在室温下缓慢旋转（9 rpm）过夜孵育。
  5. 加入 100 µL 蛋白酶 K（10 mg/mL）和 10 µL 核糖核酸酶 A（10 mg/mL），以去除 RNA 和蛋白质残留。将样品在 55 °C 下孵育 45–60 分钟。
  6. 继续在 65 °C 下孵育样品额外 4 小时。

6. DNA 打断与片段大小筛选

  1. 将离心管冷却至室温。
  2. 离心5分钟，1,000 x g 4℃ °C.
  3. 将样品均分为三份，每份400 µ将 L 分装至 2 mL 管中，并加入 2 µ20 mg/m 的糖原溶液 40 L µL 3 M 醋酸钠（pH = 5.2）和 2.5 倍体积（1 mL）的 100% 乙醇加入各管中。通过倒置混匀，于 -80 ℃ 孵育 °C，45-60 分钟。
  4. 16,000 x g 离心 g 4℃时 °25分钟内离心。离心后立即将离心管置于冰上，并用移液器小心吸除上清液。
  5. 用800 μL溶液重悬DNA沉淀进行洗涤 µ70% 乙醇中离心，16,000 x g 4℃下 °5分钟，4℃
  6. 移除上清液，并用800 μL PBS再洗涤一次 µ70%乙醇的L
  7. 将沉淀溶解于130 µL 的 1× Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）中，并在 37 °C 下孵育 °15分钟内充分溶解DNA。如有必要，可用移液法重悬任何沉淀物。
  8. 测量DNA产量；2.5–5 µ1 x 10 的染色质可预期获得 g6 细胞。通过电泳检测连接效果 ± 0.6% 琼脂糖凝胶上电泳 200 ng 的 3C 产物。成功的连接反应主要显示 DNA 片段 > 3 kb。将样品储存在 -20 °C.
  9. 将样品稀释至适合超声处理的0.65 mL离心管中，浓度为10 ng/μLµL 在 100 µL 的 1× Tris 缓冲液体积（1 µ每管克数）。文库制备的标准用量为 3 µg，如有必要，可分三个独立的试管进行超声处理。
  10. 使用超声破碎仪将DNA剪切至150-700 bp（平均400-500 bp），参数设置为：循环6-8次，每次20秒开启，60秒关闭。所得DNA片段适用于采用Illumina测序仪进行高通量测序文库构建。
  11. 将剪切后的DNA转移至一个新的普通安全盖离心管中。合并同一样本的多次超声处理产物。
  12. 将一瓶DNA纯化磁珠在室温下预热。从此步骤开始，使用低吸附枪头。
  13. 向DNA管中加入1.8倍体积的磁珠并轻轻重悬。
  14. 室温孵育5分钟。
  15. 使用磁力架收集磁珠。将磁珠在磁力架上用1 mL新配制的80%乙醇洗涤2次。
    注意：去除所有乙醇，包括残留液滴。
  16. 在室温下短暂风干磁珠（2-3 分钟）。
    注意：切勿将磁珠干燥超过5分钟，否则会降低DNA得率。
  17. 用 90 微升缓冲液重悬珠子 µL 的 1× Tris 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）用于洗脱 DNA。
  18. 测量 DNA 产量并分析 5 µ将等份样品在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。与超声处理前的产量相比，损失应极小。

7. 测序文库制备

  1. 从文库制备试剂盒中加入15 µL主混合液。为修复剪切后DNA的末端，将10 µL 10x末端修复反应缓冲液与5 µL末端修复酶混合液混合。
  2. 在室温下孵育30分钟。
  3. 加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。
  4. 在室温下孵育5分钟。
  5. 使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。去除乙醇。
  6. 在室温下将磁珠干燥2-3分钟。加入42 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。
  7. 向每个样品中加入8 µL dA加尾主混合液。配制dA加尾主混合液时，将5 µL 10x dA加尾反应缓冲液与3 µL Klenow片段（exo minus）混合。
  8. 在37 °C下孵育30分钟。
  9. 加入2 µL小牛肠碱性磷酸酶（CIP）以去磷酸化DNA。
  10. 在37 °C下孵育30分钟，随后在50 °C下孵育60分钟。
  11. 加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。
  12. 在室温下孵育5分钟。
  13. 使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。
  14. 在室温下短暂干燥磁珠（2-3分钟）。加入35 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。
  15. 进行接头连接反应。接头/连接酶的浓度应降低，具体如表3所述。
  16. 在20 °C下孵育15分钟。
  17. 加入3 µL尿嘧啶DNA糖基酶与DNA糖基酶-裂解酶内切酶VII（例如USER）酶的混合液，用移液器混匀，然后在37 °C下孵育15分钟。
  18. 加水至总体积为100 µL，在96 °C下煮沸5分钟，然后将样品置于冰上冷却。
  19. 加入1.1倍体积的DNA纯化磁珠，并轻轻重悬。
  20. 在室温下孵育5分钟。
  21. 使用磁力架收集磁珠。在保持离心管处于磁力架上的同时，用1 mL新配制的80%乙醇洗涤磁珠两次。
  22. 在室温下将磁珠干燥2-3分钟。加入50 µL 1x Tris缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH = 8）重悬磁珠，以洗脱DNA。

8. 4C 染色质相互作用文库的扩增与纯化

  1. 使用10 µL文库进行第一轮PCR以扩增4C文库 。PCR反应体系和程序见表4。
  2. 进行巢式PCR。巢式PCR反应体系和程序见表5。
  3. 合并每个文库的PCR产物，并用1.1倍体积的DNA纯化磁珠进行纯化。
  4. 测定DNA产量，并取5 µL上样于1.5%琼脂糖凝胶进行分析。
  5. 调整文库浓度后进行测序。若文库带有索引序列，可在测序前混合多个文库。

结果

在悬浮液滴中诱导胚胎干细胞分化后的第六天，我们获得了均一的拟胚体群体，用于后续分析（图1）。我们改进了UMI-4C方法23，以定量拟胚体中谱系特异性基因启动子区域的特定染色质相互作用24。该实验流程的示意图及各步骤代表性质量控制凝胶图谱如图2A所示。第一次质量控制用于检测MboI限制性内切酶消化效率，高效消化应产生小于3 kbp的片段（图2B）。值得注意的是，小鼠胚胎干细胞和拟胚体的染色质消化较为困难，有时会残留未完全消化的染色质。第二次质量控制在连接反应后进行，以确认大部分片段大小现已> 3 kbp（图2B）。随后，通过凝胶电泳分析超声处理后获得的染色质片段，预期片段大小为400–500 bp（图2B）。

去磷酸化并连接单端接头后，进行两轮PCR以扩增目标片段。采用巢式策略为每个位点设计一对两种引物，以提高特异性。每个目标片段分别使用两对不同的引物进行扩增，以优化PCR条件（例如，Pou5f1 位点使用引物对A和B，T 位点使用引物对C和D），扩增产物在约400 bp处呈现DNA弥散条带（图2C）。 alternatively，采用多重PCR同时扩增目标A和C（图2D），纯化后获得相似大小的片段（图2D）。用于4C文库构建的引物（针对 Pou5f1 和 T 位点）见 表6。

数据分析时，首先将原始测序读段比对至参考小鼠基因组（mm10），去除所有重复及低质量（< 20）的读段。针对每个诱饵序列，通过计算读段片段的数量获得每个限制性酶切片段的信息，从而得到原始接触图谱。随后，将感兴趣区域定义为距离诱饵序列2 kbp至250 kbp范围内的所有限制性酶切片段。为平滑图谱，通过依次合并相邻的限制性酶切片段，逐步增加每个片段的大小，直至感兴趣区域内原始接触总数达到5%的阈值。为确保生物学重复间的整合及不同条件间的比较，我们在限制性酶切片段水平上同时纳入了斜率和随机截距。每种条件下的平均图谱及其之间的倍数变化如图3所示。在拟胚体分化过程中，多能性基因Pou5f1的增强子与启动子之间的相互作用减少，而中胚层-内胚层谱系决定性转录因子T的增强子-启动子相互作用则增加（图3），这些结果为理解这些发育相关增强子的功能提供了重要线索。

类胚体形成，第0天小鼠胚胎干细胞至第6天类胚体，显微镜图像，细胞分化过程。
图1：小鼠胚胎干细胞及其衍生类胚体的代表性图像。 在无血清条件下培养的第0天小鼠胚胎干细胞（左侧）和均一的第6天类胚体（右侧），通过倒置显微镜观察。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

DNA邻近连接过程，MboI消化至巢式PCR；电泳结果；分子分析。
图2：4C实验流程及本方案主要步骤的代表性图像。（A）定量4C的示意图。RS = 限制性酶切位点；US = 上游；DS = 下游；UP = 通用引物；D = RS与DS之间的距离理想情况下应为5-15 bp。（B）MboI消化后的染色质（I）、细胞核内连接的染色质（II）以及超声处理后的染色质（III）的示例。左侧数字表示通过每个样品的DNA ladder测定的DNA大小。（C）在两个位点进行PCR扩增的示例：Pou5f1（引物A和B）和T（引物C和D）。（D）使用引物A和C在Pou5f1和T位点进行多重PCR扩增的示例。ES = 胚胎干细胞；EB = 胚状体。请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析，log2倍数变化图，Pou5f1和T位点，基因组位置作图。
图3：4C分析谱图示例。 在mESC和第6天EB中检测的位于Pou5f1和T基因启动子区域的诱饵所获得的定量4C谱图。上图显示了来自两个独立生物学重复实验的平均互作信号图谱；下图显示第6天EB相对于mESC的平均互作信号倍数变化（两个重复实验的平均值）。浅蓝色方框表示在分化过程中发生动态变化的增强子位置。该图改编自Tian等人的研究24。请点击此处查看该图的放大版本。

5 mL 用量
1 M Tris-HCl, pH 8.050 µL
5 M NaCl10 µL
10% Igepal CA630100 µL
50x Roche complete protease inhibitors100 µL
MilliQ 水4.74 mL

表1：裂解缓冲液。

1000µL用量
MilliQ水869 µL
10X NEB T4 DNA连接酶缓冲液120 µL
20mg/mL 牛血清白蛋白6 µL
2000 U/µL T4 DNA连接酶5 µL

表2：连接反应主混合液的配制。

15 µL 体系
5X Quick Ligation Reaction Buffer10 µL
NEBNext Adaptor3 µL
Quick T4 DNA ligase2 µL

表3：接头连接反应。

PCR 反应体系设置
接头连接的文库（library-on-deads）10 µL
PCR 级水20.25 µL
10 µM 目标特异性引物3.75 µL
10 µM NEB Index 引物3.75 µL
Herculase II 5X 缓冲液10 µL
10 mM dNTPs1.25 µL
Herculase II 聚合酶1 µL
总体积50 µL
PCR 程序
步骤 1：98 °C – 2 分钟
步骤 2：98 °C – 20 秒
步骤 3：65 °C – 30 秒
步骤 4：72 °C – 45 秒
步骤 5：返回步骤 2，共循环 15–18 次
步骤 6：72 °C – 3 分钟
步骤 7：4 °C – 保存

表4：4C染色质相互作用文库扩增，第一轮PCR。

巢式PCR反应体系配置
第一次PCR所得DNA片段10 µL
PCR级水20.25 µL
10 µM 特异性引物+P5 Illumina引物3.75 µL
10 µM P7 Illumina引物3.75 µL
Herculase II 5X缓冲液10 µL
10 Mm dNTPs1.25 µL
Herculase II聚合酶1 µL
总体积50 µL
巢式PCR程序
步骤1：98 °C - 2分钟
步骤2：98 °C - 20秒
步骤3：65 °C - 30秒
步骤4：72 °C - 45秒
步骤5：返回步骤2，共循环15-18次
步骤6：72 °C - 3分钟
步骤7：4 °C – 保温

表5：4C染色质相互作用文库扩增，巢式PCR。

名称序列 (5'-3')
DS-Oct4-AAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCCAG
US-Oct4-ATCTCTTGCAAAGATAACTAAGCACCAGGCC
DS-Oct4-BAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCT
US-Oct4-BACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCT
DS-T-CAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTCCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAAAGGAGC
US-T-CGATTACACCTGGGTCCCTGCACATTCGCCAA
DS-T-DAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCTGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACCCGGGAG
US-T-DGCTGAGGCTTTGGAGAGGTCAAGGAGACC
UP-4CCAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adap-i1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATC
Adap-i2CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATC
Adap-i3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATC
Adap-i4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGA
CGTGTGCTCTTCCGATC

表6：用于4C文库构建的引物。

讨论

悬滴培养法无需额外添加生长因子或细胞因子，即可从预定数量的mESCs reproducibly生成均一的拟胚体（EB）群体5。本文描述了一种定量4C技术的实验方案，该方法改编自UMI-4C方法，用于在EB分化模型中定量分析谱系特异性转录因子的增强子-启动子相互作用。我们鉴定了在EB分化过程中以动态方式与Pou5f1和T基因启动子发生接触的染色质区域。Pou5f1在EB分化过程中表达下调，其启动子与远端增强子之间的接触频率也随之降低。相反，T基因在EB分化过程中表达上调，我们鉴定了三个增强子，其与启动子的接触频率在分化过程中下降（图3）。为验证上述结果，可进行活性组蛋白标记H3K27ac的染色质免疫沉淀（ChIP）实验24，因为该组蛋白修饰已被证实与增强子的激活相关，且在增强子失活过程中会丢失这一修饰标记11。

标准的4C技术已被广泛用于研究特定基因组位点的染色质互作谱25。然而，即使经过广泛的标准化处理，该方法仍难以进行定量解释26,27,28，原因在于PCR片段大小的异质性引入了偏差，且无法区分PCR重复序列。我们的定量4C方法在很大程度上与UMI-4C技术相似，后者通过超声破碎和嵌套连接介导的PCR步骤实现对单个分子的定量，从而克服经典4C方法的局限性23。然而，与使用唯一分子标识符（UMI）的UMI-4C不同，我们的定量4C方案基于超声破碎步骤产生的特异性DNA断裂来实现单分子定量。这使得我们的方案可与商业化的DNA文库构建试剂盒兼容，无需使用带有唯一分子标识符的引物。

本方案包含若干需要考虑的关键步骤。与经典的 4C 方法28类似，本方案的关键因素在于 3C 分子制备过程中消化和连接的效率。消化/连接效率低下会显著降低与目标片段相互作用的复杂性，从而导致分辨率下降。如前所述23，本方案的另一个关键步骤是文库扩增所用引物的设计。第二轮 PCR 反应的引物应位于被检测限制性酶切位点上游 5–15 nt 处。在 75 nt 的测序读长中，这可为捕获序列留下至少 40 nt 的长度用于比对。第一轮 PCR 反应所用引物应设计在第二轮引物的上游，且两者之间无重叠，同时均需具备足够的特异性以确保高效的 DNA 扩增。对于多重检测，引物应独立设计，目标熔解温度（Tm）为 60–65 °C。此外，与其他 3C 技术类似，定量 4C 方法的分辨率取决于本方案中所使用的限制性内切酶25。本方案采用识别 4 bp 序列的限制性内切酶 MboI。使用该酶所能达到的最大分辨率为约 500 bp，但此值高度依赖于基因座位置，且极少能够实现。另一项局限性在于，位于同一限制性酶切片段内的元件之间的相互作用无法被检测。此外，相距一个限制性酶切位点的相互作用无法与未消化的背景信号相区分。在连接前采用补平步骤可能有助于检测此类相互作用。

定量 4C 技术非常适合研究靶向基因座的染色质相互作用。然而，特异性 PCR 扩增步骤限制了可同时检测的基因座数量。增加靶向基因座数量的一种方法是采用多重 PCR，以同时扩增多个目标片段，但这需要所用引物之间的兼容性，并在实施前对每对引物进行测试。如果希望研究启动子区域染色质结构的全局性变化，则更适合采用全基因组范围的方法，例如 Hi-C、PC Hi-C 或 HiChIP29,30,31。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 F. Le Dily、R. Stadhouders 以及 Graf 实验室成员提供的建议和讨论。G.S. 获得玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者基金（H2020-MSCA-IF-2016，miRStem）资助，T.V.T. 获得胡安·德·拉·谢尔瓦博士后基金（MINECO，FJCI-2014-22946）资助。本研究获得欧洲研究理事会第七框架计划下的支持th 欧盟第七框架计划（ERC Synergy Grant 4D-Genome，协议号 609989，授予 T.G.），西班牙经济、工业与竞争力部（MEIC）对 EMBL 合作关系的支持，塞韦罗·奥乔亚卓越中心（2013–2017），以及加泰罗尼亚自治区政府 CERCA 计划。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1% EmbryoMax 明胶EMD MilliporeES-006-B细胞培养
0.25% 胰蛋白酶-EDTA25200072
AMPure XPBeckman Coulter101362244C/DNA 纯化
B27 添加剂Gibco17504044细胞培养
β-巯基乙醇Gibco31350010细胞培养
Bioruptor PicoDiagencodeB010600104C/超声处理
BSANEBB9000S4C
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263细胞培养
CIPNEBM02124C
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物Roche46931160014C
DMEM/F12 培养基Gibco11320033细胞培养
dNTPNEBN0447S4C
ESGRO 白血病抑制因子 (LIF)EMD MilliporeESG1107细胞培养
甲醛溶液 (37%)Sigma252549-25ML4C
甘氨酸SigmaGE17-1323-014C
糖原ThermoFischerR05514C
Herculase II Fusion DNA 聚合酶Agilent6006754C
IGEPAL CA-630SigmaI3021-50ML4C
Knockout DMEM10829018
L-谷氨酰胺Gibco25030081细胞培养
MboINEBR0147M4C
MEM 非必需氨基酸Gibco11140050细胞培养
N2 添加剂GibcoA1370701细胞培养
NEBNext DNA 文库构建试剂盒NEBE60404C
NEBuffer 2.1NEBB7202S4C/消化
Neurobasal 培养基Gibco21103049细胞培养
PD0325901Selleck ChemicalsS1036细胞培养
青霉素-链霉素Gibco15140122细胞培养
蛋白酶 KNEBP8107S4C
Qubit 4 荧光仪ThermoFischerQ332384C
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒ThermoFischerQ328514C
RNase AThermoFischerEN05314C
丙酮酸钠溶液Gibco11360070细胞培养
StemPro Accutase 细胞解离试剂GibcoA1110501细胞培养
T4 DNA 连接酶反应缓冲液NEBB0202S4C
T4 DNA 连接酶反应缓冲液NEBM0202M4C

参考文献

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4C DNA PCR Pou5f1 T
通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用
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