本实验方案的目的是通过活细胞和固定细胞显微镜技术，对完整组织中的细胞分裂进行分析 黑腹果蝇 减数分裂的精母细胞。该方案展示了如何从完整的睾丸中分离出完整且未受损的睾丸组织 果蝇 幼虫和早期蛹的处理及显微镜载片制备方法
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摘要
摘要
对活体完整组织和器官中细胞分裂进行实验分析，对于理解细胞分裂如何与发育、组织稳态及疾病过程相整合至关重要。Drosophila 精母细胞在减数分裂过程中的研究非常适合此类分析，原因如下：（1）含有精母细胞的完整 Drosophila 睾丸相对容易制备用于显微观察；（2）精母细胞体积较大，适合高分辨率成像；（3）可将强大的 Drosophila 遗传工具与体内分析相结合。本文提供了一种简便易行的实验方案，用于制备 Drosophila 三龄幼虫和早期蛹的完整睾丸。我们描述了如何在制备好的完整睾丸中识别减数分裂期的精母细胞，以及如何通过延时显微镜对它们进行活体成像。同时提供了睾丸整体固定和免疫染色的实验方案。与使用成虫睾丸进行精母细胞分析的现有方案相比，使用幼虫睾丸具有多项优势。最重要的是，幼虫睾丸比成虫睾丸更小，细胞密度更低，这极大地方便了对精母细胞的高分辨率成像。为展示这些优势及本方案的应用，我们展示了通过延时共聚焦显微镜观察单个精母细胞分裂过程中内质网相对于纺锤体微管重新分布的结果。该方案可与任意数量的荧光标记蛋白或细胞器标记物的表达、基因突变及其他遗传工具联合使用，使该方法在完整组织和器官生理背景下研究细胞分裂机制时尤为强大。
引言
细胞分裂的研究通常使用在培养条件下生长的细胞系进行1。尽管这些研究使我们获得了大量关于基本机制的宝贵见解和深入理解2，但在培养条件下生长的细胞无法完全再现完整活体组织中细胞分裂的生理状态。例如，在完整的组织和器官中，细胞必须在正确的时间和正确的位置进行分裂，以确保子代细胞被恰当地安置于组织内，能够经历适当的分化或功能程序，并且细胞增殖能与组织生长或稳态保持恰当协调3。相比之下，在培养基中生长的细胞，其细胞分裂通常由培养基中的生长因子调控4，因此我们无法通过这些细胞了解体内环境因素（如组织结构或发育信号）如何影响分裂过程。还需要注意的是，许多用于研究细胞分裂的细胞系（如 HeLa 和 U2OS 细胞）来源于转移性肿瘤5。因此，与健康细胞相比，这些癌细胞的基本生理特征（如细胞周期调控机制和染色体稳定性）可能已经发生了改变。因此，要全面理解细胞分裂的生理机制，必须依赖于在能够维持生理性调控机制和组织结构的原生体内环境中对分裂中的细胞进行研究。
在完整组织和器官中，细胞分裂机制的研究进展受到体内或离体分析固有困难的限制。首先，在大型器官或厚组织内部，可能难以甚至无法获取正在进行分裂的细胞以进行显微观察。其次，体内单个细胞的分裂时机往往难以预测。第三....
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方案
1. 准备用于解剖的动物、工具和培养基
- 将雄性和雌性果蝇杂交以获得所需基因型的子代。用于鉴定和分期减数分裂精母细胞的有用转基因标记包括 GFP-微管蛋白（用于标记减数分裂纺锤体）和 RFP-组蛋白2A（用于标记染色体）8。每次杂交使用五到十只雌蝇，并将杂交管置于25 °C培养箱中，使用标准果蝇培养基饲养，直至三龄幼虫开始沿管壁爬行（4–5天）。一天后将开始形成早期白色蛹。
- 准备两对尖端平直的精细镊子。确保镊子尖端锋利、长度一致且平直（图1A）。仅将这些镊子用于解剖操作，不使用时用10 μL移液器吸头套住尖端进行保护。
- 制备手术刀工具。
- 将黑色阳极氧化钢质昆虫针的钝端插入针 holder 中，并拧紧 holder 的螺丝以固定昆虫针。在解剖显微镜下，使用一对镊子夹住昆虫针的中部，将其弯曲成135°的内角（图1B）。针的尖端用于切割组织，而边缘则用于在不同液滴间转移睾丸。
- 不使用时用1,000 μL移液器吸头套住进行保护。
- 在组织培养超净台内操作，分装5 mL Schneider’s培养基，于4 °C保存至使用前。准备开始解剖时，将一份5 mL培养基恢复至室温。随后将预温的解剖培养....
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结果
当本实验方案成功执行后，睾丸将保持完整，可用于共聚焦显微镜或其他荧光显微镜成像。如图3A所示，睾丸的细胞结构得以保留，从睾丸一端到另一端的细胞分化过程清晰可见，包括精原细胞、初级精母细胞以及单倍体的精子细胞。GFP-微管蛋白是识别分裂期精母细胞以及活体成像减数分裂进程的有用标记物。如图3B所示，即将进入减数分裂的精母细胞可通过其两个明显的微管星状体结构进行识别。至中期时，大型的减数分裂纺锤体被GFP-微管蛋白清晰标记（图3C）。
果蝇 精母细胞体积较大，且减数分裂进程相对较慢，因此非常适合用于分析细胞分裂过程中细胞质细胞器等细胞组分的动态变化与重组。8,11,21.
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讨论
我们描述了一种用于制备幼虫或早期蛹期 Drosophila 睾丸的实验方案，该方案经过优化，适用于对精母细胞分裂进行长期活体成像。这是一种在完整组织的生理环境中分析细胞分裂的强有力方法。当该方法与 Drosophila 遗传工具相结合时，其优势进一步扩大，例如特定基因突变、组织特异性RNA干扰介导的基因抑制，以及荧光标记的蛋白质和细胞器标记物。此外，由于幼虫和蛹期睾丸体积较小，且分裂中的细胞可紧贴玻璃盖玻片进行成像，该方法非常适用于高分辨率成像，包括超分辨率成像技术。通过代表性结果展示细胞分裂过程中内质网动态重组的研究，体现了该实验系统的多功能性。Drosophila 精母细胞因其细胞体积较大且减数分裂进程相对较慢，特别适用于细胞分裂期间细胞器动态变化的分析。此外，同一细胞还可用于减数分裂后的成像，以探究细胞器动态或细胞分裂机制的变化如何影响后续的精子发生事件。因此，该实验方法在更广泛的组织发育和细胞分化背景下研究细胞分裂生理学方面具有巨大潜力，而这些研究目标是培养细胞体系所无法实现的。
该方案包含多个有助于睾丸长期体外培养（最.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国防部向 J.T.S. 提供的启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5" 解剖探针 | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" 玻璃巴斯德吸管 | Fisher | 13-678-20A | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具公司（Fine Science Tools） | 11252-20 | 直头镊子，尖端精细 |
| 磨砂载玻片 | Fisher | 12-544-2 | 用于固定组织封片的载玻片，带磨砂书写面 |
| 卤碳油 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox 培养皿 50 | Sarstedt | SAR946077410 | 透气性组织培养皿 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher | 12-541-B | 22 mm × 22 mm，#1.5 玻璃盖玻片 |
| 微型细针（Minutien Pins） | 精细科学工具公司（Fine Science Tools） | 26002-15 | 用于制作手术刀工具的昆虫针 |
| 镀镍针持 | 精细科学工具公司（Fine Science Tools） | 26018-17 | |
| 32% 多聚甲醛溶液，电镜级 | 电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences） | 15714 | |
| 平面斜边载玻片 | Fisher | 12-549-5 | 用于解剖的载玻片 |
| PYREX 点滴板 | Fisher | 13-748B | 9 孔玻璃解剖皿 |
| Schneider's Drosophila 培养基 | Fisher | 21720-024 | |
| 注射器滤器，0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | 显微镜封片介质 |
参考文献
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), San Diego, Calif. 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (....
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重印与许可
