样品制备 果蝇 用于活体完整组织中细胞分裂分析的幼虫与蛹期睾丸

摘要

本实验方案的目的是通过活细胞和固定细胞显微镜技术，对完整组织中的细胞分裂进行分析 黑腹果蝇 减数分裂的精母细胞。该方案展示了如何从完整的睾丸中分离出完整且未受损的睾丸组织 果蝇 幼虫和早期蛹的处理及显微镜载片制备方法

摘要

对活体完整组织和器官中细胞分裂进行实验分析，对于理解细胞分裂如何与发育、组织稳态及疾病过程相整合至关重要。Drosophila 精母细胞在减数分裂过程中的研究非常适合此类分析，原因如下：（1）含有精母细胞的完整 Drosophila 睾丸相对容易制备用于显微观察；（2）精母细胞体积较大，适合高分辨率成像；（3）可将强大的 Drosophila 遗传工具与体内分析相结合。本文提供了一种简便易行的实验方案，用于制备 Drosophila 三龄幼虫和早期蛹的完整睾丸。我们描述了如何在制备好的完整睾丸中识别减数分裂期的精母细胞，以及如何通过延时显微镜对它们进行活体成像。同时提供了睾丸整体固定和免疫染色的实验方案。与使用成虫睾丸进行精母细胞分析的现有方案相比，使用幼虫睾丸具有多项优势。最重要的是，幼虫睾丸比成虫睾丸更小，细胞密度更低，这极大地方便了对精母细胞的高分辨率成像。为展示这些优势及本方案的应用，我们展示了通过延时共聚焦显微镜观察单个精母细胞分裂过程中内质网相对于纺锤体微管重新分布的结果。该方案可与任意数量的荧光标记蛋白或细胞器标记物的表达、基因突变及其他遗传工具联合使用，使该方法在完整组织和器官生理背景下研究细胞分裂机制时尤为强大。

引言

细胞分裂的研究通常使用在培养条件下生长的细胞系进行¹。尽管这些研究使我们获得了大量关于基本机制的宝贵见解和深入理解²，但在培养条件下生长的细胞无法完全再现完整活体组织中细胞分裂的生理状态。例如，在完整的组织和器官中，细胞必须在正确的时间和正确的位置进行分裂，以确保子代细胞被恰当地安置于组织内，能够经历适当的分化或功能程序，并且细胞增殖能与组织生长或稳态保持恰当协调³。相比之下，在培养基中生长的细胞，其细胞分裂通常由培养基中的生长因子调控⁴，因此我们无法通过这些细胞了解体内环境因素（如组织结构或发育信号）如何影响分裂过程。还需要注意的是，许多用于研究细胞分裂的细胞系（如 HeLa 和 U2OS 细胞）来源于转移性肿瘤⁵。因此，与健康细胞相比，这些癌细胞的基本生理特征（如细胞周期调控机制和染色体稳定性）可能已经发生了改变。因此，要全面理解细胞分裂的生理机制，必须依赖于在能够维持生理性调控机制和组织结构的原生体内环境中对分裂中的细胞进行研究。

在完整组织和器官中，细胞分裂机制的研究进展受到体内或离体分析固有困难的限制。首先，在大型器官或厚组织内部，可能难以甚至无法获取正在进行分裂的细胞以进行显微观察。其次，体内单个细胞的分裂时机往往难以预测。第三，组织生理状态在离体培养过程中可能迅速恶化。在本方案中，我们描述了可用于活体及固定样本分析的简便易行的方法 黑腹果蝇 精母细胞在完整睾丸内进行减数分裂的过程。这些细胞非常适合活体离体分析，因为它们可通过共聚焦显微镜等常规光学方法轻松观察，分裂时间和位置可预测，且完整睾丸可在离体培养条件下维持长达约24小时。此外， 果蝇 精母细胞是较大的圆形细胞（直径约20–30 µm），分裂时形态不变，因此非常适合对纺锤体装置和细胞质细胞器等细胞组分进行高分辨率、活细胞延时成像。尽管这些细胞经历的是减数分裂而非有丝分裂，但这两种细胞分裂机制中的许多基本细胞分裂过程非常相似。⁶这些优势，结合强大的 果蝇 遗传工具，已使得 果蝇 精母细胞是广泛用于体外分析细胞分裂关键过程的模型，包括纺锤体形成与调控、胞质分裂以及细胞器的重塑与分配^7,8,9,10,11.

精母细胞是处于精子发生过程中减数分裂阶段的细胞。在Drosophila中，精子发生始于一群位于睾丸一极一个小区域（即“干细胞微环境”或“hub”）的生殖系干细胞^12,13。这些细胞通过不对称有丝分裂产生一个分化的精原细胞。随后，精原细胞经历四次同步的有丝分裂，形成由16个细胞组成的细胞群，这些细胞在同一个囊泡内保持紧密连接。在此阶段，细胞从有丝分裂周期转变为减数分裂周期，并被称为精母细胞。精母细胞在细胞周期的G2期会停留约两到三天，在此期间细胞体积显著增大，并发生细胞学上的变化，为随后的两次减数分裂及精子形成期做准备^13,14。同一个囊泡内的16个精母细胞随后同时进入第一次减数分裂。因此，可以在细胞分裂过程中同时对多个处于减数分裂期的精母细胞进行成像观察。第一次减数分裂持续约1.5小时，紧接着迅速进入第二次减数分裂，最终产生共64个精子细胞，这些精子细胞将进一步分化为成熟的精子。

利用精母细胞在活体完整组织中研究细胞分裂的一个独特优势在于，成群或成囊的细胞会持续经历精子发生的不同阶段，通常在任一睾丸中均可识别出处于精子发生各阶段的细胞（见图3A）。因此，在完整的睾丸中相对容易找到减数分裂细胞。我们的分析通常集中于第一次减数分裂而非第二次减数分裂，因为第一次减数分裂的细胞体积更大，更适用于高分辨率成像，但包含两次减数分裂的整个过程均可成功成像。还应注意，睾丸制备与培养的一般实验方案也可用于分析精子发生的其他过程，例如早期的有丝分裂干细胞或精原细胞分裂，以及精子细胞成熟为精子过程中发生的细胞学变化¹⁵。果蝇（Drosophila）与人类在精子发生的许多方面具有高度保守性¹⁶。

Drosophila 精母细胞在 Drosophila 发育的三龄幼虫阶段即开始进入精子发生过程中的减数分裂阶段¹³。因此，可从三龄幼虫开始，包括蛹期和成虫期在内的各个生命周期阶段中分离睾丸，用于分析正在进行分裂的精母细胞。目前已有多种优秀的实验方案可用于从成年雄性果蝇中提取睾丸，以进行活体或固定后的精子发生分析^17,18,19。若研究目标为精子发生的晚期阶段，或必须使用仅在成虫中可见的遗传标记，则这些方案可能更为合适。本实验方案则侧重于从幼虫和早期蛹中制备睾丸，因为这些发育阶段的睾丸具有若干特别适用于高分辨率、延时显微成像进行细胞分裂分析的优势。首先，幼虫和蛹期的睾丸比成虫的小，器官内的细胞密度较低。因此，分裂中的精母细胞通常位于幼虫睾丸的外表面附近，无需穿透多层产生光散射的组织即可成像。其次，成虫睾丸会因附着的附属器官节律性收缩而移动，这种运动使得对单个细胞进行延时成像变得困难。第三，当研究导致蛹期或成虫致死的基因突变时，使用幼虫睾丸尤为有利。我们的方法已优化为可在显微镜载物台上对睾丸进行长期培养，从而能够在同一标本中对多轮细胞分裂过程或单个细胞经历精子发生多个阶段的动态进程进行成像观察。我们还描述了一种对完整睾丸进行固定和免疫染色的实验方案。总体而言，本系列方案特别适用于希望在完整组织环境中研究细胞分裂的研究人员，而将精母细胞分析与高度可操作的 Drosophila 遗传工具相结合，使该方法成为一种极为强大的研究策略。

方案

1. 准备用于解剖的动物、工具和培养基

1. 将雄性和雌性果蝇杂交以获得所需基因型的子代。用于鉴定和分期减数分裂精母细胞的有用转基因标记包括 GFP-微管蛋白（用于标记减数分裂纺锤体）和 RFP-组蛋白2A（用于标记染色体）⁸。每次杂交使用五到十只雌蝇，并将杂交管置于25 °C培养箱中，使用标准果蝇培养基饲养，直至三龄幼虫开始沿管壁爬行（4–5天）。一天后将开始形成早期白色蛹。
2. 准备两对尖端平直的精细镊子。确保镊子尖端锋利、长度一致且平直（图1A）。仅将这些镊子用于解剖操作，不使用时用10 μL移液器吸头套住尖端进行保护。
3. 制备手术刀工具。
   1. 将黑色阳极氧化钢质昆虫针的钝端插入针 holder 中，并拧紧 holder 的螺丝以固定昆虫针。在解剖显微镜下，使用一对镊子夹住昆虫针的中部，将其弯曲成135°的内角（图1B）。针的尖端用于切割组织，而边缘则用于在不同液滴间转移睾丸。
   2. 不使用时用1,000 μL移液器吸头套住进行保护。
4. 在组织培养超净台内操作，分装5 mL Schneider’s培养基，于4 °C保存至使用前。准备开始解剖时，将一份5 mL培养基恢复至室温。随后将预温的解剖培养基转移至10 mL注射器中，并连接0.22 µm注射式滤器。

2. 幼虫和早期蛹精巢的解剖

1. 使用装有培养基的滤器注射器，在玻片的顶部、中部和底部各排出三滴培养基（每滴 50 µL）。
2. 用解剖针将五到十只三龄幼虫或早期蛹（仍为白色或黄色的蛹）转移至顶部的液滴中。用解剖针在培养基中轻轻搅动幼虫和蛹，以去除任何食物残渣或杂质。
3. 在解剖显微镜下，用解剖针将单个幼虫或蛹侧放，以识别是否存在成对的睾丸；若存在，睾丸表现为体后三分之一区域内的椭圆形透明结构（图 2A, B）。无睾丸的个体为雌性，应予以弃去。
4. 当找到一只干净的雄性幼虫或蛹后，将其转移至第二滴培养基中。重复此步骤，直至有 3 至 4 只雄性幼虫和/或蛹被转移至第二滴培养基中。
5. 在第二滴培养基中操作，用一对镊子夹住单只雄性幼虫或蛹的中段（位于睾丸前方），再用另一对镊子轻轻将虫体撕成两半。
6. 用镊子将幼虫或蛹的后端固定在玻片上。从镊子旁边开始，用解剖刀的边缘向下压外骨骼，并将刀片向虫体切断端移动，从而挤出内部器官，包括肠道、脂肪体和睾丸。
7. 用工具轻轻将睾丸与其他器官分离。睾丸为透明、椭圆形的器官，嵌在条带状的脂肪体中（图 2C）。
8. 将睾丸逐个转移至第三滴培养基中。操作时，将解剖刀边缘插入脂肪体下方，将组织从培养基中提起，并迅速移至第三滴培养基中。
9. 或者，如果附着在睾丸上的脂肪体不足以成功提起组织，可使用预先用解剖培养基润湿的玻璃巴斯德吸管轻轻转移组织。
10. 用解剖刀的尖端轻轻切除睾丸上多余的脂肪体，仅保留边缘的一小圈脂肪体（图 2C）。无需完全去除所有脂肪体，试图彻底清除反而可能导致睾丸受损或破裂。
11. 对玻片上所有雄性幼虫重复上述步骤。
12. 随后进入步骤 3 或步骤 5。

3. 活体显微成像用睾丸的制备

注意：本封片步骤改编自近期发表的果蝇（Drosophila）幼虫脑神经母细胞成像实验方案²⁰，更多细节可参考该文献。

1. 使用滤器注射器将一滴 Schneider 培养基（约 30 µL）滴加到 50 mm 透气培养皿的中央。
2. 用预先润湿的巴斯德吸管将制备好的睾丸转移至透气培养皿中的液滴上。睾丸通常会漂浮在液滴表面。
3. 使用手术刀工具轻轻将睾丸推压至透气膜表面。注意避免用手术刀尖端刺破透气膜。将所有睾丸推至液滴中央。
4. 用装有卤代烃油的 1 mL 注射器在透气膜上滴加四滴油，每滴约 30 μL，将油滴均匀分布在含有睾丸的培养基液滴周围，对应于 22 mm 玻璃盖玻片的四个角的位置。
5. 将 22 mm 玻璃盖玻片的四个角对准四滴卤代烃油，轻轻将盖玻片放下，覆盖在培养基和油滴上。让盖玻片自然沉降，使含睾丸的培养基在油滴之间铺展。
6. 去除多余培养基，使盖玻片能够沉降至睾丸表面。在体视显微镜下观察睾丸时，将一块精细擦拭纸的一角插入盖玻片下的培养基中，吸走少量液体。吸除足够量的培养基，直至玻璃盖玻片刚好接触到最大睾丸的表面为止。切勿去除过多培养基或将盖玻片压得过低，否则会对睾丸施加压力，导致其破裂（见 图 5）。

4. 减数分裂精母细胞的活体成像

注意：可使用激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜对精母细胞进行成像。显微系统必须具备足够的速度和灵敏度，以避免荧光蛋白发生光漂白或组织遭受光损伤。

1. 在睾丸上方的玻璃盖玻片上滴一滴镜油。将培养皿翻转后置于显微镜载物台上，将显微镜物镜（40倍或60倍）浸入镜油中，直至位于睾丸下方。使用透射光找到单个睾丸，并调至清晰对焦。
2. 在使用共聚焦显微镜快速成像时，移动睾丸以观察细胞的排列结构。睾丸的一端可见大量体积较小、紧密排列的细胞，此区域包含生殖系干细胞和精原细胞。沿器官向另一端移动，可观察到逐渐增大的细胞，这些细胞形成界限清晰的簇状或囊状结构，即为初级精母细胞。图3A).
3. 若对GFP-微管蛋白进行成像，可通过细胞皮层处存在两个明亮的微管星状体（即中心粒）来识别将在30–60分钟内启动减数分裂的精母细胞（图3B，C).
4. 一旦确定了减数分裂期的精母细胞囊，即可设置采集参数，以随时间连续获取z轴方向的图像堆栈。通常，在z轴方向上以1.5 μm间隔采集15–20幅图像，足以覆盖同一细胞囊内多个精母细胞的完整体积。
5. 每2分钟获取一次完整的z轴层扫图像，适用于对整个第一次减数分裂过程（约持续1.5小时）进行成像。若仅需分析减数分裂中的特定事件，可采用更快的采集速率。然而，需注意避免因激光激发对样品进行反复照射而引起光漂白或光损伤。
6. 使用连续的自动对焦控制系统，以防止在长时间采集过程中出现焦平面漂移。假设室温约为22–23 °C，则通常无需对显微镜载物台上的样品进行温度控制。若具备温度控制条件，应将样品在显微镜载物台上的温度维持在25 °C。
7. 若未发现减数分裂期的精母细胞，将样品在25 °C培养箱中保存数小时或过夜，然后再次成像。

5. 固定与免疫染色

1. 从上述步骤 2.10 开始，使用玻璃巴斯德吸管将睾丸转移至一个 9 孔玻璃解剖皿中的孔内，孔中预先加入 0.5 mL 含 0.3% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液（PBSTx）配制的 8% 多聚甲醛溶液。确保睾丸沉降至皿底。
   注意：多聚甲醛具有毒性，操作时应在通风橱中佩戴手套进行。
2. 在室温下固定睾丸 20 分钟。
3. 将睾丸转移至另一个含有 0.5 mL PBSTx 的孔中，轻轻振荡洗涤 5 分钟。更换新孔中的新鲜 PBSTx，重复洗涤步骤两次。
4. 将一抗用含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 0.5 mL PBSTx 稀释至所需浓度，加入 1.5 mL 微量离心管中。将睾丸从 9 孔玻璃解剖皿转移至含稀释一抗的离心管中，于 4 °C 轻柔振荡或旋转孵育过夜。
5. 将睾丸转移至 9 孔玻璃解剖皿的一个孔中，用 0.5 mL PBSTx 洗涤 5 分钟。更换新鲜 PBSTx，重复洗涤步骤两次。
6. 将二抗用含 5% BSA 的 250 μL PBSTx 稀释，加入 9 孔玻璃解剖皿的洁净孔中。如需染色 DNA，可加入 DAPI。将睾丸转移至含二抗的孔中，用塑料封口膜覆盖，于室温避光、轻柔振荡条件下孵育 4 小时。
7. 将睾丸转移至一个装有 0.5 mL PBSTx 的洁净孔中，用新鲜 PBSTx 洗涤两次，每次 5 分钟，第三次洗涤 30 分钟。

6. 固定睾丸的封片

1. 使用巴斯德移液管将最后一次洗涤后的睾丸转移至玻璃显微镜载玻片上。如有必要，可用手术刀工具的边缘将睾丸轻轻压向载玻片表面。
2. 使用精细擦拭纸的一角吸去睾丸表面多余的液体，尽可能去除所有液体。
3. 向睾丸上加入30–50 µL的显微镜封片介质液滴。
4. 将22 mm的盖玻片覆盖在封片介质液滴上，让盖玻片自然沉降，使封片介质在盖玻片下均匀展开。如有必要，可轻轻按压盖玻片，挤出多余的封片介质，并使盖玻片直接贴附在睾丸表面。
5. 使用指甲油密封盖玻片的边缘。

结果

当本实验方案成功执行后，睾丸将保持完整，可用于共聚焦显微镜或其他荧光显微镜成像。如图3A所示，睾丸的细胞结构得以保留，从睾丸一端到另一端的细胞分化过程清晰可见，包括精原细胞、初级精母细胞以及单倍体的精子细胞。GFP-微管蛋白是识别分裂期精母细胞以及活体成像减数分裂进程的有用标记物。如图3B所示，即将进入减数分裂的精母细胞可通过其两个明显的微管星状体结构进行识别。至中期时，大型的减数分裂纺锤体被GFP-微管蛋白清晰标记（图3C）。

果蝇 精母细胞体积较大，且减数分裂进程相对较慢，因此非常适合用于分析细胞分裂过程中细胞质细胞器等细胞组分的动态变化与重组。^8,11,21.

讨论

我们描述了一种用于制备幼虫或早期蛹期 Drosophila 睾丸的实验方案，该方案经过优化，适用于对精母细胞分裂进行长期活体成像。这是一种在完整组织的生理环境中分析细胞分裂的强有力方法。当该方法与 Drosophila 遗传工具相结合时，其优势进一步扩大，例如特定基因突变、组织特异性RNA干扰介导的基因抑制，以及荧光标记的蛋白质和细胞器标记物。此外，由于幼虫和蛹期睾丸体积较小，且分裂中的细胞可紧贴玻璃盖玻片进行成像，该方法非常适用于高分辨率成像，包括超分辨率成像技术。通过代表性结果展示细胞分裂过程中内质网动态重组的研究，体现了该实验系统的多功能性。Drosophila 精母细胞因其细胞体积较大且减数分裂进程相对较慢，特别适用于细胞分裂期间细胞器动态变化的分析。此外，同一细胞还可用于减数分裂后的成像，以探究细胞器动态或细胞分裂机制的变化如何影响后续的精子发生事件。因此，该实验方法在更广泛的组织发育和细胞分化背景下研究细胞分裂生理学方面具有巨大潜力，而这些研究目标是培养细胞体系所无法实现的。

该方案包含多个有助于睾丸长期体外培养（最...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5" 解剖探针	Fisher	08-965-A
5.75" 玻璃巴斯德吸管	Fisher	13-678-20A
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 镊子	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	11252-20	直头镊子，尖端精细
磨砂载玻片	Fisher	12-544-2	用于固定组织封片的载玻片，带磨砂书写面
卤碳油 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox 培养皿 50	Sarstedt	SAR946077410	透气性组织培养皿
显微镜盖玻片	Fisher	12-541-B	22 mm × 22 mm，#1.5 玻璃盖玻片
微型细针（Minutien Pins）	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	26002-15	用于制作手术刀工具的昆虫针
镀镍针持	精细科学工具公司（Fine Science Tools）	26018-17
32% 多聚甲醛溶液，电镜级	电子显微镜科学公司（Electron Microscopy Sciences）	15714
平面斜边载玻片	Fisher	12-549-5	用于解剖的载玻片
PYREX 点滴板	Fisher	13-748B	9 孔玻璃解剖皿
Schneider's Drosophila 培养基	Fisher	21720-024
注射器滤器，0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	显微镜封片介质