通过絮凝法从水样中捕获环境DNA（eDNA）

摘要

环境DNA（eDNA）通常通过酒精沉淀、过滤或絮凝法从水样中捕获。本文介绍一种替代性方案，利用氯化镧从含有真核细胞、原核细胞和病毒的水样中富集溶解态及颗粒物结合态的核酸。

摘要

环境DNA（eDNA）分析已成为物种管理中解决问题的常用方法。其目标是检测隐存物种，包括入侵物种和（或）濒危物种，通常通过检测水体和沉积物中是否存在特征性DNA标记来实现。需要可靠且高效的eDNA捕获方法，特别是那些可由受训有限的工作人员和公民科学家在野外轻松操作的方法。目前，膜过滤法被广泛用于eDNA的捕获。但该方法存在一些固有缺陷，包括滤膜材料和孔径的选择、滤膜污染以及现场操作所需时间较长等问题。絮凝法提供了一种替代方案，易于实施，适用于在有限时间内覆盖广阔区域的采样方案。

引言

21世纪初之前，“环境DNA”这一术语通常用于指代从水体和土壤微生物中获得的DNA，尽管当时已开始出现一些用于人类和动物DNA检测的应用，例如粪便来源追踪或非本地物种检测^1,2,3。目前，环境DNA通常用来描述从真核生物脱落的细胞中提取的DNA，对这类DNA的分析已成为一种广泛应用的管理工具。其主要目标是检测隐存物种，包括入侵物种或濒危物种，通常通过检测水体或沉积物中是否存在目标物种特有的DNA特征序列来实现。研究可针对单一关注物种，使用特异性的PCR检测方法（主动采样），也可通过宏条形码技术和高通量并行测序，同时检测多个物种。

在过去的二十年中，环境DNA（eDNA）研究相关的样本采集、样本处理和数据分析已取得诸多改进。早期研究采用乙醇沉淀法从水样中富集DNA³。尽管该方法经过验证且可靠，但为了提高检测灵敏度需分析大量水样，而每份水样通常需要两倍体积的乙醇，这使得该方法缺乏吸引力。

后续研究通常采用膜过滤法，理由是环境DNA（eDNA）以从细胞结合态到游离溶解态的连续状态存在，但溶解态DNA易发生快速降解，因此细胞结合态DNA代表了最主要的组分。滤膜材料与孔径大小的优化被广泛讨论和争议，同时对于如何从滤膜上提取捕获的eDNA，其最佳方法也存在诸多讨论^4,5,6。

环境DNA捕获的第三种方法是絮凝法，该方法已有数百年历史，常用于澄清液体，包括水、啤酒和葡萄酒。已有若干研究采用絮凝法从天然水体或饮用水源中捕获病毒^7,8,9,10,11。这些研究通常使用预絮凝脱脂牛奶或氯化铁作为捕获试剂。使用氯化铁的方法通常会导致下游分子分析问题，原因是抑制PCR反应^12,13。而使用预絮凝脱脂牛奶的方法则需要预先制备絮凝剂并控制pH值，迄今为止仅被应用于病毒的捕获^7,8,9。

近年来，基于氯化镧（III）的细菌和病毒絮凝捕获技术已被研究^12,13,14,15。研究者证明，该方法可在低浓度（0.2 mM）下有效结合，从而收集具有活性的病原体。此外，与氯化铁不同，氯化镧的絮凝过程可通过温和条件下的螯合反应实现可逆。

因此，使用氯化镧进行絮凝以捕获生物颗粒物具有吸引力，因为仅需添加少量浓缩絮凝剂，无需严格控制pH值，且样品体积可从毫升级扩展至加仑级。该方法应用于环境DNA（eDNA）的捕获时，可有效回收溶解态DNA以及细胞、亚细胞结构（如线粒体和叶绿体）中的DNA。细菌和病毒可被同时富集，从而能够利用单个水样开展病原体检测和（或）进一步的生态学研究。本文介绍了一种使用氯化镧的絮凝方案，可用于从水样中富集溶解态及颗粒物结合态的核酸。

方案

1. 设备去污与絮凝试剂配制

1. 用洗洁精和热水彻底清洗所有瓶子、管路及其他先前使用过的设备。
2. 用6%柠檬酸溶液喷洒所有瓶子、管路及其他先前使用过的设备，以去除矿物质沉积物，静置20分钟，然后用自来水冲洗。
3. 向所有瓶子中加入10倍稀释的家庭用漂白剂溶液（次氯酸钠终浓度为0.5–0.6%），加入量约为容器体积的10%，摇匀，静置至少1小时，然后排空并用自来水冲洗至无任何漂白剂残留痕迹，再用去离子水冲洗一次。
4. 将所有瓶子干燥。
5. 将所有采集瓶及瓶盖放入生物安全柜中，使用紫外杀菌灯照射2小时，并每隔半小时将每个瓶子和瓶盖旋转四分之一圈。
6. 将瓶盖盖在瓶子上并轻轻拧紧。称量每个瓶子的重量，并在瓶身记录其空瓶重量。
7. 通过将3.71 g七水合氯化镧(III)溶于100 mL去离子水中，配制100 mM的氯化镧溶液。为尽量减少化学试剂接触空气（因氯化镧具有吸湿性），每次使用后应以胶带密封瓶口。
   警告：氯化镧带有“警告”信号词及以下危险说明：H315引起皮肤刺激；H319引起严重眼刺激；H335可能引起呼吸道刺激。使用个人防护装备。详见该物质的安全数据表（SDS）。
8. 通过将84.01 g碳酸氢钠溶于1 L去离子水中，配制1 M的碳酸氢钠溶液。经滤膜除菌后室温保存。

2. 样品采集与絮凝

1. 使用适当大小的瓶子从每个采样点采集样品，并额外采集一个现场空白样（即在现场装入饮用水的样品，用于监控污染情况）。根据实验设计和预期用途调整采样数量。若样品需冷冻保存，切勿将瓶子装满至瓶肩以上，应留出空间以容纳液体膨胀。
2. 记录相关元数据，包括日期、时间和GPS位置。对样品容器进行标记。
3. 向每个样品和现场空白样中加入1 M碳酸氢钠溶液。每500 mL样品加入10 mL。
4. 盖紧瓶盖并混匀。
5. 向每个样品和现场空白样中加入100 mM氯化镧溶液。每500 mL样品加入1 mL。
6. 盖紧瓶盖并充分混匀。使用电工胶带固定瓶盖。
7. 将样品置于冰上保存，直至返回野外实验室。随后，样品可选择在冷藏条件下直立放置过夜，使絮状物沉降至容器底部；或在-20 °C下冷冻，以便运输至第二个实验室进行后续处理。冷冻时必须将容器直立放置，以容纳液体膨胀并防止容器破裂。

3. 絮凝体的处理

1. 将冷冻样品置于冷却器中于室温下解冻，或将未冷冻的样品转移至配备蠕动泵及管路装置的合适工作台区域，用于吸取样品上清液。确保穿过蠕动泵的管路排放端通向地面的一个大桶中，进样端应配备一根洁净的塑料吸管以控制进样。
2. 使用蠕动泵，通过吸管将吸力作用于液面稍下方，并随着液面下降同步下移吸管进样端，以去除上清液。当上清液即将吸尽时，小心地将进样端移至瓶底凸起的点状结构（瓶底中央略微隆起的小圆点，称为“ pontil ”）处，使其贴附其上。这样可在絮状物聚集于容器边缘的同时实现最大程度的液体去除（见图1）。

图1：在单位重力下收集沉降的絮体。含有细胞物质和环境DNA（eDNA）的絮体沉降至样品瓶底部，待去除上清液后即可回收。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 连接一根干净的饮用吸管，并对每个样品重复上清液的移除操作。
4. 使用一根干净的 20 mL 移液管和移液控制器，将絮状物悬浮液完全转移至一个 50 mL 离心管中。用少量去离子水（约 5 mL）冲洗，确保从样品瓶中回收所有残留的絮状物。
5. 用去离子水将所有 50 mL 离心管中的体积调至相等，并在 2,500 x g 条件下离心 20 分钟，以收集絮状物。
6. 倾去上清液，将离心管倒置放在干净的纸巾上沥干。
7. 加入 1 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0），通过涡旋振荡重悬絮状物，然后加入 4 mL 1x TE 溶液（pH 8.0）并再次混匀。将重悬的絮状物转移至一个 15 mL 圆锥形离心管中，加入 50 µL 10% 线性聚丙烯酰胺并涡旋振荡。加入 5 mL 100% 异丙醇，混匀后冰上静置 20 分钟。
8. 在 6,000 x g 条件下离心 20 分钟，以收集 DNA 和细胞颗粒。倾去上清液，将离心管倒置放在干净的纸巾上沥干。稍作干燥，但避免过度干燥。
9. 使用商业试剂盒开始絮状物 DNA 提取过程，该试剂盒采用珠磨破碎和离心柱结合法，结合容量为 25 µg。
   1. 首先，将絮状物重悬于 800 µL 试剂盒提供的裂解缓冲液中，并将悬浮液完全转移至珠磨管中。以短时间多次珠磨并间歇冷却的方式处理絮状物悬浮液。此时匀浆液可冷冻保存，或继续按照试剂盒说明书操作。
   2. 先用 100 µL 洗脱缓冲液从离心柱中洗脱 DNA，然后将洗脱液重新通过离心柱循环一次。
   3. 最后，再用额外的 100 µL 洗脱缓冲液洗脱柱中残留的 DNA，最终总体积为 200 µL。此步骤可最大化 DNA 回收率。
10. 收集、制备并分析环境 DNA（eDNA），以验证本方案的性能及其相对于广泛使用的过滤方法的表现。
    1. 配制包含 1x qPCR 预混液、25 μg/mL 牛凝血酶^14,16、0.4 μM 正向和反向引物以及 2 μL 模板（相当于回收 DNA 样品的 1%）的反应体系。使用通过凭证 DNA 扩增并纯化定量的 PCR 产物进行系列稀释，构建标准曲线。或者，也可商业合成目标片段。
    2. 若无标准品，可采用比较定量法。以本示例为例，热循环条件为：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 10 秒，57 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），但其他检测需根据实际情况调整条件。使用仪器制造商提供的软件分析数据。

结果

采集自饲养两只东部锦龟（Chrysemys picta picta）的水族箱的八份500 mL水样（每份450 mL）被用于按照所述方案制备环境DNA（eDNA）。另取八份500 mL水样，通过孔径1.5 µm、无黏合剂的47 mm玻璃纤维滤膜进行过滤，并采用与絮凝法相同的提取方法提取eDNA。两种方法制备的DNA均通过定量PCR进行分析，该PCR针对目标物种线粒体控制区，并使用针对目标生物的特异性正向和反向引物。本实验的目标物种为Chrysemys picta picta，其正向和反向引物序列分别为（5’-CGTCCATGTAACAGATGGCGT-3’）和（5’-AAACCACCGTATGCCAGGTT-3’）。

首先采用相对定量法来验证该方案的可重复性，因为此方法无需标准曲线。通过絮凝方案制备的八份水样进行了相对定量qPCR分析，结果显示这些反应的起始点（即二阶导数达到最大值20%时的循环数）为23.5，平均PCR反应效率为1.92（范围为1.89–1.93）。平均相对定量值为1.003，其99%置信区间为0.88–1.12。

讨论

尽管该技术操作简单，但某些步骤对成功至关重要。收集和转移絮状物时必须彻底，以免丢失DNA。应通过有策略的冲洗来收集残留物质。本方案描述使用商业DNA提取试剂盒对絮状物进行最终处理。其他提取方法可能具有相似或更优的性能，但对该方案部分的修改尚未经过全面测试。

本方案适用于需要从空间分布广泛的采样点采集样本且各样本间时间差异最小化的情况，或当水体中悬浮沉积物浓度较高而容易堵塞滤膜时。该方案的一个缺点是需要将水样从野外运送到现场工作站进行处理，或运送到其他实验室进行后续处理。过滤法可产生重量轻且体积小的滤膜，目标物质被富集在滤膜上，便于运输和邮寄。然而，现场过滤所需时间会因各采样点的水质条件不同而有所变化，导致每个采样点停留时间不一。此外，过滤操作需要携带设备进入野外，样品间需对设备进行去污染处理，并要求操作人员接受专门培训，因此通常不适合公民科学家使用。

所述方案简单易行，样品采集步骤可由经过 minimal 培训的野外工作人员甚至公民科学家轻松完成。未来可预见的应用包括对病原体、入侵物种以及污染物或其他非生物因素引起的生物多样性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5M EDTA，pH 8.0	可从多个商业来源获得
1 × TE 缓冲液，pH 8.0	可从多个商业来源获得
15 ml 圆锥形离心管	一次性使用
16 盎司 PET 透明方瓶	经清洗和去污后可重复使用
38/400 聚丙烯盖，带压敏衬垫	使用前保持盖子松动。使用时需拧紧以密封压敏衬垫。
50 mL 圆锥形离心管	一次性使用
6% 柠檬酸溶液	用于去除可重复使用样品瓶中的矿物沉积物。
粪便/土壤微生物组提取试剂盒	使用抑制剂去除树脂或层析柱
七水合氯化镧(III)	100 mM 储存液
直流蠕动泵	任何型号的蠕动泵均可，或可采用虹吸方式
聚丙烯酰胺载体	10% 线性聚丙烯酰胺
碳酸氢钠	1 M，过滤除菌后室温保存