通过立体定位注射5,7-二羟色胺消除小鼠背缝核中的5-羟色胺能神经元

摘要

本方案描述了一种背缝核（DRN）损毁小鼠模型（>通过立体定位注射5,7-二羟基色胺至中缝背核（DRN），采用倾斜入路以避免损伤上矢状窦，实现实验小鼠中缝背核5-羟色胺能神经元稳定丢失，同时达到90%的存活率。

摘要

立体定位注射已广泛用于将化合物或病毒直接递送至啮齿类动物的特定脑区。由于中缝背核（DRN）位于上矢状窦（SSS）下方，直接靶向该区域的5-羟色胺能神经元可能导致严重出血和动物死亡。本方案描述了一种中缝背核5-羟色胺能神经元损毁小鼠模型的建立方法，其动物存活率超过>90%，且DRN内5-HT阳性细胞稳定减少超过>70%。该损毁通过立体定位技术，以30°前/后方向倾斜进针，将选择性5-羟色胺能神经毒素5,7-二羟基色胺（5,7-DHT）注射至DRN，从而避免损伤SSS。中缝背核5-羟色胺能神经元损毁小鼠表现出与焦虑相关的行为改变，可用于验证DRN损毁手术的成功。本方法虽用于DRN损毁，但亦适用于其他需要倾斜进针以避开中线结构的立体定位注射。该中缝背核5-羟色胺能神经元损毁小鼠模型为研究5-羟色胺能神经元在广泛性焦虑障碍和重度抑郁障碍等精神疾病发病机制中的作用提供了重要工具。

引言

5-羟色胺（5-HT）是一种重要的神经递质，主要在肠道和大脑中产生，影响多种心理功能。在中枢神经系统（CNS）中，5-羟色胺能系统在调节情绪与社会行为、睡眠与觉醒、食欲、记忆以及性欲方面发挥核心作用。在中枢神经系统中，5-羟色胺由5-羟色胺能神经元合成，这些神经元可分为以下两组：头侧组，其具有上行投射，几乎支配全脑；尾侧组，主要投射至脊髓¹。头侧组包含大脑中约85%的5-羟色胺能神经元，由尾侧线性核、中缝正中核以及背缝核（DRN）组成，其中背缝核是大脑中5-羟色胺能神经元数量最多的区域。

通常认为，5-羟色胺系统功能失调与重度抑郁症（MDD）和广泛性焦虑症（GAD）的发病机制相关²。这主要是因为选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）对这些精神疾病具有良好的药理治疗效果^3,4。此外，累积的证据表明，躁狂⁵和自杀行为⁶可能与背缝核（DRN）中5-羟色胺功能水平降低有关。已有研究报道，Pet1-Cre;Lmx1b^flox/flox小鼠和hTM-DTA^iPet1小鼠（分别为从晚期胚胎阶段⁷....

方案

所有外科手术干预和动物护理程序均已获得中国上海市同济大学生命科学与技术学院动物伦理委员会的批准。

1. 动物饲养

1. 将雄性C57BL/6NCrl小鼠（10周龄，25 g，n = 21）饲养于标准条件下（24 °C；55%湿度），光照/黑暗周期为12 h/12 h。
2. 提供食物和水 随意摄取.
   注意：此处使用三只小鼠以确认针道位置。

2. 试剂的准备

注意：所有药物配制步骤均须在层流罩内进行，以避免污染。所有配制好的溶液均储存于 -80 °C 冰箱中。建议每次使用一个分装 aliquot，完全解冻后充分混匀，使用后弃去管中剩余溶液，避免反复冻融。

1. 将0.25 g丙米嗪盐酸盐溶于100 mL 0.9%生理盐水中，配制成2.5 mg/mL的溶液。使用带有0.22 μm孔径亲水性PES膜的注射器滤器对溶液进行灭菌。然后将溶液分装（每管1.8 mL）至2 mL微量离心管（EP管）中。立即标记、注明日期，并于-80 °C冰箱中保存。推荐动物使用剂量为25 mg/kg。
2. 将5 mg 5,7-二羟基色胺（5,7-DHT）溶于含0.1%抗坏血酸的1.67 mL 0.9%生理盐水中，配制成3 μg/μL的溶液。轻轻涡旋混匀，使用0.22 μm孔径注射器滤器灭....

结果

在冠状切面中，中缝背核（DRN）的位置位于上矢状窦（SSS）和导水管下方（图1B,C）；因此，采用标准方法定位DRN可能导致小鼠大量出血和高死亡率¹⁶。为此，本研究采用倾斜进针方式而非标准的垂直进针方式进行立体定位注射，以避免损伤上矢状窦（图1A,B）。为确认针头进入脑内的位置，对接受立体定位注射的小鼠在术后立即处死，灌注后取出脑组织进行组织学检查。如图1C所示，损伤部位（针道）恰好位于导水管下方的中缝背核区域。

据报道，ETM中的抑制性回避可能是一种适合评估焦虑行为的任务¹⁹。小鼠倾向于回避高架迷宫的开放臂，而偏好封闭臂；因此，在封闭臂中停留时间更短的小鼠表现出抗焦虑行为²⁰。本实验方案的结果显.......

讨论

本方案成功描述了一种可靠的中缝背核（DRN）5-羟色胺能神经元损毁小鼠模型的制备方法，具有高损毁可重复性和低死亡率的特点。由于中缝背核上方紧邻矢状窦（SSS），对其进行靶向操作较为复杂，可能损伤SSS¹⁶，导致严重出血甚至死亡¹⁴。因此，为避免损伤SSS，立体定位注射时将操作臂在前后（AP）方向上设置为30°角（图1A,B）。导水管下方可见的针道轨迹（图1C）证实了对DRN的精确定位。术后一个月，DRN 5-羟色胺能神经元损毁小鼠在高架十字迷宫（ETM）测试中表现出显著缩短的潜伏期，提示具有抗焦虑样行为（图2B），且损毁侧DRN中5-羟色胺能神经元丢失超过>70%（图4）。

尽管在进行立体定位注射时采用斜向入脑.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22微米注射器滤器	Millipore	SLGPRB
3%过氧化氢	江西草珊瑚有限公司，中国江西
5,7-二羟基色胺	Sigma-Aldrich	SML2058	3ug/ul，2ul
紧凑型小动物麻醉机	瑞沃德生命科学有限公司	R500系列
冷冻切片机	Leica Biosystems，德国韦茨拉尔	CM1950
Cy 3 AffiniPure 驴抗山羊IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	705-165-003	1:2,000
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
盐酸去甲替林	Sigma-Aldrich	PHR1723	25mg/kg
Eppendorf管	Quality Scientific Plastics	509-GRD-Q
山羊抗5-HT抗体	Abcam	ab66047	1:800
GraphPad Prism	Graphpad Software Inc，美国加利福尼亚州
Hamilton微量注射器	Hamilton	87943
酮洛芬	Sigma-Aldrich	K1751-1G	5mg/kg
L-抗坏血酸	BBI生命科学	A610021-0500	0.10%
利多卡因软膏	清华同方制药有限公司	H20063466
氧氟沙星眼膏	沈阳兴齐制药有限公司，中国	H10940177
蠕动泵	上海沪西分析仪器厂有限公司，中国上海	HL-1D
立体定位仪	瑞沃德生命科学有限公司	68018
超低温冰箱	海尔	DW-86L388
涡旋振荡器	Kylin-bell	VORTEX-5