我们描述了一种利用高频超声心动图评估成年斑马鱼心脏形态和功能的实验方案。该方法可实现心脏的可视化，并进一步对心率（HR）、心输出量（CO）、面积变化分数（FAC）、射血分数（EF）以及血流流入和流出速度等功能参数进行定量分析。
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摘要
摘要
斑马鱼（Danio rerio）由于其胚胎透明性、遗传可操作性以及适用于快速、高通量研究的特性，已成为心血管研究（包括人类心脏疾病）中一种非常流行的研究模型生物。然而，随着发育至成体阶段，其透明性丧失，限制了对心脏功能的分析，从而增加了模拟年龄相关性心脏疾病模型的难度。为克服这些局限，高频超声心动图技术在斑马鱼研究中正逐渐成为一种可行的选择。本文介绍了一种利用高频超声进行无创超声心动图检测以评估成年斑马鱼心脏功能的详细实验方案。该方法可实现对斑马鱼心脏尺寸的可视化与分析，并量化多项重要功能参数，包括心率、每搏输出量、心输出量和射血分数。在本方法中，斑马鱼在麻醉状态下保持水下，检测后可恢复存活。尽管高频超声技术成本较高，但通过更换不同的探头，同一成像平台可用于多种物种（如小鼠和斑马鱼）的研究。斑马鱼超声心动图是一种可靠的心脏表型分析方法，适用于晚发性疾病的模型验证与特征描述、药物筛选，以及心脏损伤、恢复和再生能力的研究。
引言
斑马鱼（Danio rerio）是研究发育过程和人类疾病的成熟脊椎动物模型1。斑马鱼与人类具有较高的基因相似性（70%），且具备良好的遗传可操作性、高繁殖力，以及在胚胎发育期间的光学透明性，从而允许对包括心脏在内的器官和组织进行直接的可视化分析。尽管斑马鱼心脏仅有一个心房和一个心室（图1），但其生理特征与哺乳动物的四腔心脏相似。更重要的是，斑马鱼的心率、心电图形态和动作电位形状相较于小鼠更接近人类2。这些特性使斑马鱼成为心血管研究的优秀模型，并在心脏发育3,4、再生5以及病理状态研究方面提供了重要见解1,3,4，包括动脉硬化、心肌病、心律失常、先天性心脏病以及轻链型淀粉样蛋白心脏毒性1,4,6。在胚胎阶段（受精后1天），已可通过高速视频显微镜结合直接视频分析来评估心脏功能7,8。然而，斑马鱼在胚胎期后失去透明性，限制了对正常成熟心脏及迟发性心脏病变的功能评估。为克服这一局限，超声心动图已被成功应用于成年斑马鱼心脏功能的评估，作为一种高分辨率、实时、无创的影像学替代方法9,10,11,12,13,14,15。
在斑马鱼中，心脏位于胸腔腹侧，紧邻鳃的后方，心房位于心室的背侧。心房收集来自静脉窦的静脉血，并将其输送至心室，血液随后被进一步泵入动脉球（图1）。本文介绍一种生理状态下在水下进行的无创性超声心动图检测方法，用于评估成年斑马鱼的心脏功能，采用中心频率为50 MHz的线阵超声探头进行B模式成像，分辨率为30 µm。由于超声波可轻易穿透水介质，将斑马鱼与扫描探头在水下保持近距离接触即可提供足够的心脏检测接触面，无需使用超声耦合凝胶，整体上对鱼类的应激更小。尽管已有若干研究者报道了其他斑马鱼超声心动图系统9,12,13，本文所展示的是适用于动物高频超声检测的通用且最常用的实验装置。
该方法可实现对成年斑马鱼心脏的高分辨率成像，追踪心脏结构，并通过多普勒血流测量定量分析峰值流速。我们展示了对重要收缩期和舒张期参数进行可靠活体定量的结果，包括射血分数（EF）、面积变化分数（FAC）、心室血流流入和流出速度、心率（HR）以及心输出量（CO）。本研究有助于建立正常健康成年斑马鱼心脏功能和形态参数的可靠参考范围，从而更精确地评估病理状态。总体而言，我们提供了一种评估斑马鱼心脏功能的稳健方法，该方法已被证明在建立和验证斑马鱼心脏病模型6,16、心脏损伤与恢复10,13以及心脏再生11,12方面极为有效，并可进一步用于潜在药物的评价。
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方案
所有涉及斑马鱼的操作均经本机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国农业部《动物福利法》的规定。
1. 实验设置
- 设置图像采集平台
- 使用小剪刀或解剖刀在海绵的12点钟位置切开一个切口，用于在扫描过程中固定鱼类。将海绵放入玻璃容器中（图2A).
注意：切口的位置应留出足够空间以移动换能器，同时在平台倾斜扫描时能使鱼体保持在水线以下图2）。切口的大小可根据鱼的尺寸进行调整；但对于标准尺寸和重量的鱼，切口应约为 2.5 cm × 0.7 cm × 0.5 cm（分别为长度、宽度和深度）。玻璃容器的深度应至少为 6 cm，以避免在成像过程中发生漏水。 - 将装有海绵的玻璃盒固定在超声平台上方，例如使用双面胶带。确保玻璃盒位于平台中心并牢固粘附（图2B).
- 使用平台支架左侧的旋钮将平台向前倾斜约30°图2B）。在玻璃方形容器中加入200–250 mL含有0.2 mg/mL三卡因甲磺酸盐（MS222）的鱼类系统用水。
注意：Tricaine 可用 40 mM pH 7 的 Tris 缓冲液配制成 4 mg/mL 的储存液，再用养殖鱼用水稀释至所需浓度；经发现，0.2 mg/mL 为最佳使用浓度164 mg/mL 的三卡因储存液可在 -20 °C 长期保存，或在 4 °C 保存一个月。 - 将换能器插入工作轨道站上的显微操作器支架内，使换能器的凹槽朝向操作者。保持阵列与地面平行，工作侧沿载物台纵向放置（参见 图2B）。为已连接的换能器-导轨系统在x轴和y轴方向上的移动预留足够空间（两侧各留出10 cm）。
- 登录控制软件并选择 小鼠（小型）血管创建一项新研究，并为研究中包含的每只动物创建一个新的序列。查找 新研究 位于浏览器页面屏幕左下角的按钮（视图从B模式开始）。
- 使用小剪刀或解剖刀在海绵的12点钟位置切开一个切口，用于在扫描过程中固定鱼类。将海绵放入玻璃容器中（图2A).
2. 鱼类的处理
注意：本研究中使用的斑马鱼为野生型AB/图宾根（AB/TU）品系的成年雄性，年龄为11个月。斑马鱼饲养于独立的循环水养殖系统中，水温维持在28 °C，光照周期恒定为14小时光照/10小时黑暗。每日饲喂两次卤虫（Artemia nauplii）及干燥薄片饲料。
- 使用鱼网将鱼转移到含有系统水的小型水箱中，水中加入 0.2 mg/mL 三卡因。等待鱼完全麻醉（无任何运动，且对触碰无反应）。
- 使用塑料小勺，轻柔而迅速地将鱼转移至玻璃盒中，使其进入海绵上预先切好的切口，鱼的腹面朝上。
注意：确保鱼的头部朝向操作者（与换能器凹槽方向一致），且略高于身体其他部位，以获得更好的心脏成像效果。 - 通过轨道系统上的手柄，轻柔地降低换能器（保持其原有位置），使其沿纵轴方向靠近鱼的腹面，换能器的凹槽朝向操作者。换能器与鱼之间保留 2–3 mm（不超过 1 cm）的间隙。使用三维微操纵器调节平台位置，直至在屏幕上观察到鱼的心脏，然后开始图像采集。在整个图像采集过程中，不得改变换能器的角度（图 2C）。
注意：只要距离足够近（不超过 1 cm），鱼体上方的水层即可通过液体表面张力在探头与鱼之间形成接触界面，使超声波得以传播。因此，无需将换能器压在鱼体上。应尽量在 3 分钟内完成此步骤并结束扫描，以防止鱼死亡或在成像过程中心率下降。如有需要，可使用计时器。心脏通常位于屏幕上方、靠近鱼眼左侧的位置；若将 X 轴完全向右移动，可更容易观察到眼睛。若在 B 模式下持续难以定位心脏，可切换至彩色多普勒模式，该模式可显示血流方向（红色表示血流朝向操作者），有助于追踪血流并定位心脏。
3. 图像采集
注意：成像系统和图像分析软件请参见材料表。
- 纵向视图B模式
- 定位心脏后，选择或保持在B模式（在启动新序列后，位于触摸屏左下角），并缩小视野以放大图像，便于在分析过程中更清晰地追踪心脏结构。
- 为了在B模式图像采集过程中获得更近、更清晰的心脏视图，可通过放大来缩小视野。使用触摸屏手动在x轴和y轴方向上缩小视野范围。
- 如有需要，通过将动态范围设置为45–50 dB来提高图像质量/对比度。进入更多控制选项中的B模式控制菜单，并将更改保存至模式预设。每次开始采集新序列前，点击模式预设以调用优化后的图像采集设置。
- 通过选择保存图像，在长轴平面上采集所需数量的图像。
注：有关图像采集的更多详细信息和培训资源，请访问 https://www.visualsonics.com/product/software/vevo-lab 和 https://www.visualsonics.com/Learning-hub-online-video-training-our-users
- 纵向视图脉冲波多普勒
- 切换至彩色多普勒模式以检测血流（选择彩色按钮）并进行采集（在启动新序列后，位于触摸屏左下角）。
- 使用触摸屏将取样框置于房室瓣上方，定位流入血流，其信号将以红色显示（图3A）。尽可能缩小取样框区域，以提高帧率。
注：降低彩色脉冲重复频率（Color PRF，即速度范围），以确保在彩色多普勒图像的速度剖面中可见黄色信号。这将扩大可显示的速度范围，并有助于形成色彩镶嵌效果，从而更清晰地观察到峰值速度。 - 激活脉冲波（选择PW）多普勒模式，以采样心室流入血流速度。将取样容积门置于房室瓣中心位置（红色信号变为偏黄处），以检测最大流速。用手指在屏幕上调整PW角度，使其与血流方向对齐。按下开始或更新按钮，开始采样流入心室的血流速度。
注：为确保结果的一致性和可重复性，必须使角度校正线与血流方向平行。正确对齐角度校正线与血流方向，可确保准确捕获血流速度。 - 重复步骤3.2.3，将彩色多普勒取样框置于心室与动脉球交界处（即bulbuventricular瓣），定位流出血流，其信号将以蓝色显示（图3B），从而测定流出速度。将取样容积门置于心室-动脉球连接处前方，并调整角度校正线以匹配血流方向。
注：如前所述，为获得准确的速度值，务必确保PW角度与血流方向一致。 - 调整基线（横条），在流速显示面板中上下移动，以便完整检测和描记信号峰值（图3C,D）。流入峰值位于上方/正向象限（信号朝向探头），流出峰值位于下方/负向象限（信号远离探头）。
4. 鱼类恢复
- 图像采集一完成，立即使用茶匙将鱼转移到不含三卡因的常规曝气系统水中，让鱼恢复（通常需要30秒至2分钟恢复鳃部运动和游泳能力）。
- 为促进恢复，使用移液管反复将水喷洒在鱼鳃上，以增强水体曝气和氧气交换。
5. 图像分析
- 打开图像分析软件。
- 选择一幅图像，然后点击图像处理图标（图4）。利用提供的标尺（图4），调节图像的亮度和对比度，以清晰显示心室壁或血流模式。
- 使用B模式图像，在心脏分析包/测量功能中打开PSLAX（胸骨旁长轴）选项的下拉菜单（图4）。选择LV trace，分别在收缩期和舒张期勾画心室内壁，以获得收缩期心室面积（VAs）和舒张期心室面积（VAd）、舒张末期容积（EDV）以及收缩末期容积（ESV）（图5A,B）。
注意：容积值由二维图像勾画推算得出，可能与三维实际值存在偏差。所有测量应至少取每只动物3个代表性心动周期的平均值。 - 记录软件自动计算并显示的每搏输出量和射血分数。
注意：每搏输出量和射血分数也可通过以下公式手动计算：
SV = EDV - ESV
EF = (EDV - ESV) / EDV
其中SV为每搏输出量，EDV为舒张末期容积，ESV为收缩末期容积，EF为射血分数。 - 使用以下公式计算面积变化分数：
FAC = (VAd - VAs) / VAd
其中FAC为面积变化分数，VAd为舒张期心室面积，VAs为收缩期心室面积。 - 使用以下公式计算心输出量：
CO = HR × SV
其中CO为心输出量，HR为心率，SV为每搏输出量。 - 使用脉冲波多普勒模式图像，在心脏分析包中选择MV Flow选项（图4），测量流入血流速度。分别选择舒张早期（E）和舒张晚期（A），并在图像上确定峰值速度（图3C）。
- 选择AoV Flow以测量流出血流速度，并在描记图上确定峰值（图3D）。
- 采用两种不同方法测量心率，以获得更可靠的结果：
- 在图像采集过程中，当心脏显示在屏幕上时，记录10秒内心跳次数，并乘以6。
- 在Vevo LAB软件的脉冲波多普勒图像中，点击heart rate按钮，描记连续三个主动脉血流峰值之间的间隔（图4和图6）。
- 在完成心室及血流峰值的描记后，如需将数据导出至电子表格，请点击report | export | save as | excel。
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结果
本方案可用于测量重要的心脏结构和功能参数，类似于人类及动物超声心动图所采用的技术。B型超声图像可显示收缩期和舒张期心室内壁的轮廓（图5），从而获取心脏腔室和室壁尺寸等结构参数，以及心率、每搏输出量、心输出量等功能参数，还可获得反映心室收缩功能的指标，如面积变化分数和射血分数（Table 1）。通过彩色多普勒模式在房室瓣水平进行测量，还可获得心室充盈和射血时的血流速度（即血液进入和离开心室的速度）（图3 和 Table 1）。
本研究获得的参数与先前在相似实验条件下报道的结果具有可比性6,16,1...
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讨论
我们介绍了一种用于成年斑马鱼心脏功能超声心动图成像与评估的系统性方法。超声心动图是目前唯一可用的非侵入性且最可靠的活体成年斑马鱼心脏成像及功能分析方法，其在斑马鱼心血管研究中的应用正日益广泛。该方法所需时间较短，适用于高通量及纵向研究。然而，目前在实验方法和数据分析方面仍存在较大差异。由于多种变量均可影响最终的测量参数，斑马鱼超声心动图的标准化极为困难。在开展实验研究时，应考虑可能引起变异性的因素，包括麻醉方式、体重、年龄、性别以及遗传背景品系。Wang, L 等人16评估了这些因素所引入的变异性，并汇总了现有斑马鱼心脏功能相关数据，以推动该方法的标准化。他们的研究为设计涉及斑马鱼超声心动图评估的实验提供了重要参考。基于 Wang, L 等人16及其引用文献所提供的信息以及我们自身的观察结果6，我们总结了在方案优化和确保可重复性方面所认为关键的步骤与条件：
标...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Fred Roberts 提供的技术支持以及对稿件的修改。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 双面胶带 | |||
| 捞鱼网 | |||
| 玻璃容器 - 高100英寸 | |||
| 高频换能器 | Fujifilm/VisualSonics | MX700 | 带宽29-71 MHz，中心发射频率50 MHz，轴向分辨率30 µm |
| 塑料茶匙 | |||
| 手术刀或剪刀 | |||
| 小型鱼缸 | |||
| 海绵（厨房用海绵） | |||
| 移液管（3 mL刻度） | Samco Scientific | 212 | |
| 三卡因（MS-222） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vevo 3100成像系统及成像工作站 | Fujifilm/VisualSonics | ||
| Vevo LAB软件 v 1.7.1 | Fujifilm/VisualSonics |
参考文献
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