本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫 生殖系
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摘要
摘要
了解蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）发生的时间和位置，对于理解蛋白质在细胞内的功能以及发育等更广泛的生命过程如何受到影响至关重要。Caenorhabditis elegans 的生殖系是研究与干细胞调控、减数分裂及发育相关PPI的优良模型系统。该系统具备多种成熟的蛋白质标记技术，可使目标蛋白被常规抗体识别，因而特别适用于邻近连接实验（PLA）反应。因此，相较于其他方法，PLA能够更有效地以时空特异性的方式展示PPI在生殖系中的发生位置。本文介绍了一种应用于C. elegans生殖系中PPI检测与定量分析的技术方案。
引言
据估计，超过80%的蛋白质会与其他分子发生相互作用1，这凸显了蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在细胞内执行特定生物学功能中的重要性2。某些蛋白质作为枢纽发挥作用，促进形成细胞存活所必需的更大复合物1。这些枢纽介导多种蛋白质-蛋白质相互作用，并帮助将蛋白质组织成网络，以促进细胞内的特定功能3。蛋白质复合物的形成还受到生物学背景的影响，例如特定相互作用伙伴的存在与否4、细胞信号事件以及细胞的发育阶段。
C. elegans 常被用作多种研究的模式生物，包括发育研究。该生物结构简单，具有多个器官，如性腺、肠道和透明的角质层，这有利于对线虫发育过程的分析。位于性腺中的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟为配子5，并进一步发育为胚胎，最终形成下一代子代的优良工具。生殖系的远端顶端区域含有一群自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开干细胞微环境（niche）后，会进入减数分裂的粗线期，并最终在年轻成虫阶段发育为卵细胞（图1）。生殖系中的这一发育程序受到多种机制的严格调控，其中包括由RNA结合蛋白（RBPs）介导的转录后调控网....
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方案
注意：本实验方案使用两种潜在相互作用蛋白均带有标签的 C. elegans 菌株。强烈建议使用阴性对照菌株，即其中一种带标签蛋白预期不会与另一种带标签的候选相互作用蛋白发生相互作用。此处使用仅表达 GFP 作为阴性对照以评估背景信号，因为在秀丽隐杆线虫中 DLC-1 不会与 GFP 发生相互作用。实验菌株使用 GFP 标签标记的 OMA-1，因为初步数据表明其可能与 DLC-1 存在相互作用。在本文中，共表达对照蛋白和检测蛋白且同时表达 3xFLAG 标签标记的 DLC-1 的线虫菌株分别称为 3xFLAG::DLC-1；GFP 和 3xFLAG::DLC-1；OMA-1::GFP（菌株可按需提供；详见材料表）。本实验采用 3xFLAG 和 GFP 标签；但也可使用其他标签，前提是其相应抗体与 PLA 试剂盒中的试剂兼容。
1. 动物护理
- 将线虫饲养在接种了OP50菌株的大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli 并在24 °C下维持培养，以实现GFP的最优表达。
- 每2-3天传代一次成虫，以维持线虫种群并确保其营养充足。
2. 同步培养物的制备
- 通过漂白一块喂养良好、处于生殖期的雌雄同体线虫来同步虫体发育。漂白操作步骤详见 Porta-de-la-Riva ....
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结果
使用 FLAG 和 GFP 抗体对 3xFLAG::DLC-1; GFP 以及 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 两种品系的生殖腺进行共免疫染色，揭示了它们在生殖腺中的表达模式（图 3Aii-iii, 3Bii-iii）。GFP 在整个生殖腺中均有表达（图 3Aiii），而 OMA-1::GFP 的表达则局限于晚期粗线期和卵母细胞（图 3Biii）27。FLAG 免疫染色结果显示，在两种品系中，3xFLAG::DLC-1 均在整个生殖腺中表达（图 3Aii, 3Bii）。通过共免疫染色发现，3xFLAG::DLC-1 与 OMA-1::G.......
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讨论
研究蛋白质相互作用（PPIs）时 秀丽隐杆线虫 生殖系中，与共免疫染色相比，PLA 提供的更高分辨率可实现对生殖系内相互作用发生位置的可视化与定量分析。先前已有报道指出，DLC-1 与 OMA-1 之间存在直接相互作用，该作用通过一种 体外 GST下拉实验26；然而，体内pull down实验未能检测到这种相互作用。对3xFLAG::DLC-1与OMA-1::GFP在生殖腺中的荧光共免疫染色显示DLC-1与OMA-1的表达模式存在重叠；然而，尚无证据表明二者在生殖腺中的相互作用发生位置，且该重叠程度并不高于3xFLAG::DLC-1与未融合任何蛋白的GFP（阴性对照）之间的重叠。通过 原位 PLA结果显示，DLC-1确实在生殖系中与OMA-1发生相互作用，这表明PLA在检测蛋白质相互作用（PPIs）方面可能比其他方法更为灵敏。通过该方法，我们进一步拓展了DLC-1作为RNA结合蛋白（RBP）辅助因子的新兴功能。本研究证明了PLA在生殖系中检测蛋白质相互作用的能力，为今后研究者探索自身关注蛋白之间的相互作用提供了参考依据。
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致谢
本研究中使用的一些线虫品系由美国国立卫生研究院（NIH，资助号P40OD010440）资助的Caenorhabditis遗传中心提供。共聚焦显微镜实验在蒙大拿大学生物光谱学核心研究实验室完成，该实验室的运行得到了美国国立卫生研究院资助项目P20GM103546和S10OD021806的支持。本工作部分由NIH基金GM109053（资助E.V.）、美国心脏协会博士后奖学金18PRE34070028（资助X.W.）以及蒙大拿科学院奖项（资助X.W.）支持。资助方未参与本研究的设计或报告撰写。我们感谢M. Ellenbecker提供的讨论与建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 多聚甲醛溶液 | 电子显微镜服务 | 15710 | 用于配制 4% 工作液 |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | 配制 1M 工作储备液 |
| 1x M9 | 多种 | 多种 | 按 10x 储备液配制，使用时稀释至 1x；实验方案详见 wormbook.org |
| 1x PBS | 多种 | 多种 | 实验方案详见 wormbook.org |
| 26.5 号针头 | Exel International | 26402 | 用于解剖的针头 |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| 离心管 | Thermo Scientific | 05-529C | 50 ml Oak Ridge 离心管，用于同步化处理 |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | 880 | |
| 柯普林瓶（Coplin Jar） | PolyLab | 62101 | |
| 用于冷冻样品的盖玻片 | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40 mm，No. 1 |
| 用于封片的盖玻片 | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22 mm，No. 1.5 |
| 免疫荧光用 DAPI 封片剂 | Vector | H-1200 | |
| 连接酶 | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x 连接酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中 |
| 扩增红缓冲液 | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x 扩增红缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中 |
| 连接缓冲液 | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x 连接缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中 |
| 抗体稀释液 | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink 抗体稀释液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供；注意：也可使用 1x PBS/1% BSA 溶液替代稀释抗体 |
| 封闭液 | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink 封闭液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供 |
| PLA 封片剂 | Sigma-Aldrich | DUO82040 | 含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片剂 |
| MINUS 探针 | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ 抗小鼠 MINUS 探针 |
| PLUS 探针 | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ 抗兔 PLUS 探针 |
| 洗涤缓冲液 A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ 洗涤缓冲液 A |
| 洗涤缓冲液 B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ 洗涤缓冲液 B |
| 聚合酶 | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink 聚合酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中 |
| 落射荧光显微镜 | Leica | 配备 DFC300G 相机的 DM5500B 显微镜 | |
| 山羊抗小鼠 Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | 使用稀释比为 1:500 |
| 山羊抗兔 Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | 使用稀释比为 1:200 |
| 图像处理软件 | Adobe | Adobe Photoshop + Illustrator CS3 | |
| 玻璃移液管 | Corning | 7095B-5X | |
| 左旋咪唑（Levamisole） | ACROS Organics | 187870100 | 配制 250 mM 工作储备液 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A454 | |
| 小鼠抗 FLAG 抗体 | Sigma | F1804 | 免疫荧光和 PLA 实验中使用稀释比为 1:1000，建议用正常山羊血清预先封闭 |
| 指甲油 | L.A. colors | CNP195 | |
| 线虫生长培养基（NGM） | 多种 | 实验方案详见 wormbook.org | |
| 正常山羊血清 | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| 聚乙烯巴斯德移液管 | Globe Scientific | 135030 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P1524 | 以水配制成 0.1% 储备液，-20°C 保存，使用时以水 1:100 稀释后用于包被载玻片 |
| 培养皿 | Tritech | PD7060 | 直径 60 mm |
| 兔抗 GFP 抗体 | Thermo Fisher | G10362 | 免疫荧光实验中使用稀释比为 1:200，PLA 实验中为 1:4000 |
| 载玻片 | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | 定制订购的三格 14x14 mm 可高压灭菌载玻片（带条形标记），通过 Fisher Scientific 购买；实验室内添加聚-L-赖氨酸进行包被 |
| 次氯酸钠溶液 | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| 擦拭巾 | Kimtech | 34120 | 尺寸为 4.4x8.4 英寸的擦拭巾 |
| 托盘（242x241x20 mm） | Thermo Fisher | 240845 | 用于制作湿盒 |
| 吐温 X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| 超纯水 | Milli-Q | 来自 Milli-Q Integral 水纯化系统的超纯水 | |
| 表面皿 | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C 冰箱 | |||
| -80 °C 冰箱 | |||
| 铝箔 | |||
| OP50 菌株 E. coli | |||
| 旋转摇床 | |||
| 胶带 | |||
| 本研究中使用的线虫品系（均可申请获取） | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；oma-1 启动子::oma-1::GFP；参考文献 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；gld-1 启动子::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+)；参考文献：本研究 |
参考文献
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
- Patil, A.....
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