使用接近连接测定在C.elegans Germline中对核糖蛋白复合体装配的实地检测

摘要

该协议演示了使用接近连接测定来探测在C. elegans生殖系中原位的蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

了解蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 的何时何地发生对于了解细胞中的蛋白质功能以及开发等更广泛的过程受到的影响至关重要。Caenorhabditis elegans生殖系是研究与干细胞、梅氏病和发育调控相关的PPI的一种很好的模型系统。有多种开发良好的技术，允许感兴趣的蛋白质被标出标准抗体来识别，使该系统有利于接近结扎测定（PLA）反应。因此，PLA 能够比替代方法更有效地以空间和时间方式显示 PPI 在生殖系中的位置。此处描述的是一种用于应用和定量该技术以在C. elegans生殖系中探测 PPI 的协议。

引言

据估计，超过80%的蛋白质与其他分子^{有相互作用1，}这强调PPI对于在细胞²中执行特定生物功能的重要性。一些蛋白质作为中心，促进组装更大的复合物，这是细胞生存^{所必需的1。}这些中心调解多个PPI，并帮助组织蛋白质进入一个网络，促进细胞³中的特定功能。蛋白质复合物的形成也受到生物背景的影响，如存在或缺乏特定的相互作用伙伴^4、细胞信号事件和细胞的发育阶段。

C. elegans通常用作各种研究（包括发育）的模型有机体。这种动物的简单解剖由几个器官组成，包括果子、肠和透明角质，这有利于蠕虫发育的分析。居住在哥纳的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟成配体^5，发育成胚胎，并最终成为下一代后代的一个很好的工具。生殖系的远端区域包含一池自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开这个利基时，它们进入微离子pachytene，并最终在年轻的成人阶段发展成卵母细胞（图1）。该生殖系的发育方案通过不同的机制受到严格监管，包括由RNA结合蛋白（RBPs）6促进的转录后监管网络。⁶PPI 对于这一监管活动非常重要，因为限制性商业惯例与其他辅助因素相关联以发挥其职能。

有几种方法可用于探测蠕虫中的 PPI，但每种方法都有独特的限制。体内免疫沉淀（IP）可用于从整个蠕虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物;但是，此方法并不指示 PPI 在蠕虫中的位置。此外，在特定的发育阶段或有限数量的细胞中，暂时性且仅形成的蛋白质复合物很难通过共同免疫沉淀来恢复。最后，IP实验需要解决在压解后蛋白质复杂重新分类以及蛋白质在亲和力基质上的非特异性保留后的问题。

PPI原位检测的替代方法是联合免疫染色、Fürster共振能量转移（FRET）和双分子荧光补充（BiFC）。联合免疫染色依赖于同时检测固定蠕虫组织中感兴趣的两种蛋白质，以及信号共定位程度的测量。使用超分辨率显微镜，它提供了比标准显微镜⁷更多的细节，有助于更严格地测试蛋白质共定位超过衍射限制屏障200-300 nm⁸。然而，使用常规和超高分辨率显微镜的共免疫染色最适合具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于漫射分布的交互伙伴来说，它的信息量要少得多。测量基于重叠的信号的共定位并不能提供有关蛋白质是否彼此复杂^99、1010的准确信息。

此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共同免疫染色不是定量的，因此很难确定这种相互作用是否显著。FRET 和 BiFC 都是基于荧光的技术。FRET依赖于标记感兴趣的蛋白质与荧光蛋白（FP），具有光谱重叠，其中能量从一个FP（捐赠者）转移到另一FP（接受者^）11。这种能量的非辐射转移导致接受方FP的荧光，可以在其各自的发射波长下检测到。BiFC是基于在体内重组荧光蛋白。它需要将GFP分成两个互补片段，如螺旋1-10和螺旋11^12，然后融合到两个感兴趣的蛋白质。如果这两种蛋白质相互作用，GFP的互补片段就变得足够接近折叠和组装，重建GFP荧光。重组后的 GFP 被直接观察为荧光，并指示 PPI 发生的位置。

因此，FRET 和 BiFC 都依赖于大型荧光标签，这些荧光标签会破坏标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要大量且可比较地表达标记的蛋白质才能获得准确的数据。FRET 可能不适合一个伙伴超过另一个伙伴的实验，这可能导致高背景¹³。还应避免在 BiFC 实验中过度表达，因为这可能导致非特异性装配¹⁴导致背景增加。这两种技术都需要优化标记蛋白的表达和成像条件，这可能会延长完成实验所需的时间。

接近连接测定 （PLA） 是一种替代方法，可以解决上述技术的限制。PLA利用识别感兴趣的蛋白质（或其标签）的主要抗体。这些主要抗体然后由含有寡核苷酸探针的二次抗体结合，当在40纳米（或较短）距离¹⁵内时，这些抗体可以相互杂交。由此产生的杂交DNA通过PCR反应被放大，由补充DNA的探测器检测到。这将导致由显微镜可视化的 foci。该技术可以在复杂组织（即蠕虫腺体）中现场检测PPI，该组织为在发育和分化的不同阶段包含细胞的装配线。使用 PLA，PPI 可以直接可视化到固定蠕虫子，这有利于调查 PPI 是否在特定开发阶段发生。PLA 提供更高的 PPI 分辨率，而不是基于联合本地化的检测，这是进行精确测量的理想选择。如果使用，超高分辨率显微镜有可能提供有关PLA foci在细胞内位置的更精细的细节。另一个优点是，PLA反应产生的方法可以通过基于ImageJ的分析工作流进行计数，使这种技术具有定量性。

LC8系列的代宁光链最初被描述为Dynein电机复合体¹⁶的子单元，并假设作为货物适配器。自首次发现以来，LC8除了Dynein马达^,复合体^{17、18、19、20,18,19}外，还发现多种蛋白质复合物。²⁰扫描含有LC8相互作用图案^{的蛋白质序列19}表明LC8可能与各种不同的蛋白质有许多相互作用17，18，19，20，21，22。^{17,18,19,20,21,22}因此，LC8家族蛋白现在被认为是中心，帮助促进组装较大的蛋白质复合物^19，22，如内部紊乱蛋白质^{的组装21。19,}

一种C.elegansLC8系列蛋白质，代宁光链-1（DLC-1），广泛表达在许多组织中，不丰富在特定亚细胞结构^{23，24。,24}因此，由于多种原因，在C.elegans中确定DLC-1体内的体内伙伴是具有挑战性的:1） 共同免疫沉淀并不指示发生相互作用的组织源;2） 特定伴侣的有限表达或瞬态相互作用可能妨碍通过共同免疫沉淀检测相互作用的能力;和 3） DLC-1 的漫反射通过共同免疫染色导致与潜在伙伴蛋白的非特异性重叠。基于这些挑战，PLA 是测试与 DLC-1在体内交互的理想方法。

此前有报道称，DLC-1与RNA结合蛋白（BPS）FBF-223和GLD-125直接相互作用，并作为共同因子。^{23 25}我们的工作支持作为中心蛋白的DLC-1模型，并建议DLC-1促进一个超越Dynein^19，22,22的交互网络。使用 GST 下拉测定，已识别一个新的 DLC-1 交互 RBP 名为 OMA-1²⁶。OMA-1对卵母细胞生长和成熟很重要^27，并与一些转化抑制剂和活化剂²⁸一起功能。虽然FBF-2和GLD-1分别表达在干细胞和环太平洋区域，OMA-1在从卵母细胞²⁷的生殖系中漫射（图1）。这表明DLC-1在哥纳德的不同区域与限制性商业惯例形成复合体。还发现，在体外观察到的DLC-1和OMA-1之间的直接相互作用并没有通过体内IP恢复。人民解放军已经成功地作为另一种方法，进一步研究这种相互作用在C.elegans生殖系，结果表明，PLA可用于探索许多其他PPI在蠕虫。

方案

注:此协议使用C. elegans菌株，其中潜在的交互伙伴都标记。强烈建议使用负控制菌株，其中一种标记的蛋白质不应与另一个标记的候选相互作用伙伴相互作用。在这里，仅 GFP 就用作评估背景的负控件，因为 DLC-1 预计不会在蠕虫中与 GFP 交互。GFP标记的OMA-1被用作实验菌株，因为初步数据表明与DLC-1相互作用。Nematode 菌株与 3xFLAG 标记的 DLC-1 共同表达控制和测试蛋白质在本文本中称为 3xFLAG::DLC-1;GFP 和 3xFLAG::DLC-1;OMA-1:GFP（应要求提供菌株;材料表中的更多信息）。在这里，使用 3xFLAG 和 GFP 标记;但是，只要其他标签的抗体与 PLA 试剂兼容，即可更换其他标签。

1. 动物护理

1. 将蠕虫放在用OP50大肠杆菌菌株播种的线虫生长介质（NGM）板上，并保持在24°C，以最佳表达GFP。
2. 每2-3天通过成年蠕虫传播蠕虫，并保存它们良好的喂养。

2. 同步文化的准备

1. 通过漂白一盘喂食良好、肉汁的黄斑石来同步蠕虫。在波塔-德拉里瓦等人²⁹日中描述了漂白协议。让胚胎在24°C的离心管中孵化过夜，同时在M9最小介质（M9）缓冲液的10 mL缓冲液中旋转末端。这将产生一种被捕的L1幼虫文化。
2. 在冰上孵育被逮捕的L1级幼虫的管10分钟，然后用冰冷1x M9从管子上拔下。
3. 使用离心机在4°C下以600 x g的颗粒粒度为5分钟。小心地吸气上清液，使仅保留1-2 mL的上清液。
4. 重新悬浮幼虫颗粒，并使用微移液器将2μL的悬浮幼虫培养转移到玻璃滑梯上。计算有多少幼虫存在，以确定幼虫培养的密度，这将有助于指导在步骤2.5中播种蠕虫。
   注:密度为10-15 L1幼虫/1 μL，非常适合播种。
5. 使用微移液器在 60 mm OP50 板上移植大约 100-120 L1 级幼虫所需的幼虫培养量。例如，密度为10 L1幼虫/1 μL的幼虫培养的种子10μL。
   注:不要超过40μL的体积来播种幼虫，否则多余的液体会破坏OP50草坪。如果培养量超过 40 μL，重复步骤 2.3-2.4 以进一步减小体积并增加幼虫培养的密度。
6. 在24°C下生长蠕虫。记录 L1 在板上播种的时间，并定期检查开发阶段，以确定解剖的理想时间。
   注:在L1播种后52小时，在24°C下培养的蠕虫通常处于年轻的成人阶段，这是对高纳德靶向PLA进行解剖的理想阶段。然而，同步蠕虫达到年轻成人阶段的实际时间可能因菌株和孵育温度而异。

3. 解剖/高纳德挤出

注:要成功工作，必须解剖以挤压戈纳德。这种方法还可以释放胚胎，这些胚胎也可以使用该协议为PLA工作（有关详细信息，请参阅讨论）。解剖后，对负对照和实验样品进行固定处理，并同时为PLA进行处理。还建议为荧光共免疫染色²³目的再制备一组样品，以展示感兴趣的蛋白质伴侣的表达模式。

1. 将 30-40 只年轻的成年蠕虫放入手表玻璃盘中，该盘含有 500 μL 的 1x M9 = levamisole（2.5 mM 最终浓度）。收集蠕虫后，小心地去除并丢弃大部分介质，以去除与蠕虫一起转移的细菌。
2. 加入新鲜 500 μL 的 1x M9 + levamisole，并使用移液器轻轻绘制和分配介质以冲洗蠕虫。小心地去除并丢弃大多数介质，以清除与蠕虫一起转移的细菌。
   1. 重复此步骤 2x-3x，直到清除所有细菌。完成补时后，将蠕虫留在约100 μL的介质中，以保持水分。
      注:不要让蠕虫在介质中停留超过 7 分钟，因为这将在解剖过程中损害多面体的挤出。在解剖显微镜的帮助下进行消毒，以监测介质的去除，以便蠕虫不会丢失。
3. 使用玻璃或聚乙烯移液器，将蠕虫转移到涂有 0.001% 聚-L-莱辛的 25 mm x 75 mm 显微镜幻灯片中（本步骤中使用的幻灯片具有环氧涂层周长，留下三个工作空间，每个 14 mm x 14 mm）。去除多余的介质，使大约 10-15 μL 的介质保持。
4. 在解剖显微镜的帮助下，使用两根261⁄2仪表针，将一根针放在另一根针上，使末端形成一把剪刀。使用这种方式的针头，在咽部后面切开蠕虫以释放生殖系。在 5 分钟内分解所有蠕虫。
   注:有关如何执行解剖的更多细节，请参阅 Gervaise 和 Arur³⁰以前的出版物。
5. 解剖所有蠕虫后，在幻灯片上轻轻放置一个 22 mm x 40 mm 的盖玻片，使其垂直于幻灯片。盖玻片的末端应悬挂在滑轨上。
6. 将滑板冻结在干冰上预冷却的铝块上至少 20 分钟。轻轻将一支冰冷的铅笔放在盖玻片上，以防止盖玻片因结冰膨胀而松动。

4. 固定/阻塞

1. 准备好固定时，用铅笔或其他钝刃工具轻拂盖玻片，立即将滑道浸入装有新鲜冰冷甲醇（冷却至-20°C）的罐子中 1 分钟。
2. 轻轻擦拭样品周围的幻灯片边缘，以便下一个试剂由样品周围的表面张力保持。在 RT 时，将 150 μL 的固定剂（100 mM KH₂PO 中的 2% 甲醛_、pH = 7.2）应用 5 分钟。
   注:我们还测试了甲醇/丙酮固定程序^31，32，发现它与解放军的反应兼容。^31,
3. 以垂直 90° 角触摸滑块到纸巾，让固定式从滑道上跑出并吸收到纸巾中。在 Coplin 罐子中，在 RT 中，块滑 2x 15 分钟，50 mL 的 1x PBS/1% Triton X-100/1% 牛血清白蛋白 （PBT/BSA）。
   注:建议为此阻塞步骤和以下第 6-9 节中的洗涤步骤使用 Coplin 罐或其他类型的染色罐。这些提供了足够的体积，以便有效地交换阻塞或洗涤缓冲器与样品。
4. 块状幻灯片，含有10%正常山羊血清的PBT/BSA溶液。轻轻擦拭幻灯片周围的边缘，并将 100 μL 的解决方案应用于幻灯片。在潮湿的室内在 RT 孵育 1 小时。
   注:此步骤强烈建议使用 #FLAG 原抗体染色。湿式造型室通过用胶带固定玻璃移液器在托盘中，使滑轨在孵化时放在纸盒上。浸湿的任务湿巾（材料表） 被放置在托盘中，以提高托盘的内部湿度，以防止蒸发。盖子和托盘用箔覆盖，以保护样品在光线敏感步骤期间免受光照。
5. 将幻灯片放在纸巾上，让 PBT/BSA/10%NGS 解决方案从幻灯片上运行，轻轻擦拭幻灯片边缘。使用阻塞试剂 （材料表） 阻止幻灯片。将一滴涂抹到 14 mm x 14 mm 空间上。在潮湿的腔室中，在37°C下孵育1小时。

5. 原抗体孵育

注:为了获得最佳的PLA结果和最小的背景，主要抗体的稀释系数可能需要优化（有关详细信息，请参阅讨论）。此外，应在与用于PLA的二次抗体的特异性相匹配的不同宿主中引发主要抗体。

1. 将滑块放在纸巾上，让阻塞试剂从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。使用抗体稀释剂 （材料表） 稀释主要抗体.每 14 mm x 14 mm 空间应用 40 μL 原抗体溶液。
2. 在4°C下在潮湿的室内孵育滑梯过夜。

6. PLA 探针（二次抗体）孵育

注:对于步骤 6-9，在 RT 时使用洗涤缓冲器 A 和 B。如果缓冲器储存在 4 °C，则在使用前请它们加热到 RT。

1. 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A （材料表） 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
2. 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。准备含有 PLUS 和 MINUS 探头的 40 μL 溶液（用抗体稀释剂稀释 1:5）。将解决方案应用于每个 14 mm x 14 mm 空间。
3. 在 37 °C 下在潮湿室中孵育 1 小时。

7. 结扎

1. 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
2. 用超纯水稀释连接缓冲液 （材料表） 1:5.使用此缓冲液稀释连接（材料表）1:40，以准备成套溶液的工作库存。
   1. 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。将 40 μL 的配扎溶液应用于每个 14 mm x 14 mm 空间。
3. 在37°C下在潮湿的室内孵育30分钟。

8. 放大

注:使用带有红色荧光球的检测试剂（材料表）可使C.elegans组织的背景量最少。

1. 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 A 清洗幻灯片 2x 5 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
2. 用超纯水稀释放大红缓冲液（材料表）1:5。使用此缓冲液稀释聚合酶（材料表）1:80，制备放大溶液的工作库存并防止光照。
   1. 将滑块放在纸巾上，让洗涤缓冲器从滑道上运行，轻轻擦拭边缘。将 40 μL 的放大溶液应用于每个 14mm x 14 mm 空间。
3. 在37°C下，在潮湿的室内孵育1小时40分钟。确保湿室被铝箔覆盖，以保护样品免受光照。

9. 最终用时

1. 在 Coplin 罐子中的 RT 处用 50 mL 的 1x 洗涤缓冲液 B （材料表） 清洗幻灯片 2x 10 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。
2. 在 Coplin 罐中的 RT 时，用 50 mL 0.01x 的洗涤缓冲液 B 清洗 1x 1 分钟。将Coplin振动器上的Coplin罐设置为60rpm。此缓冲液通过稀释洗涤缓冲液 B 与超纯水制备。

10. 盖玻片安装

1. 让多余的洗涤缓冲器从滑道上运行到纸巾上，擦去幻灯片环氧涂层周长上残留的缓冲液。
2. 加入10 μL的安装介质（材料表）进行取样，轻轻在上面放置盖玻片，使安装介质散开。
3. 用指甲油在盖玻片边缘涂上油漆，以密封盖玻片和滑动。使用指甲油时要温柔，以免移动盖玻片，以免损坏生殖线。让指甲油在RT下硬化至少20分钟，而幻灯片则不受光的影响，然后再在显微镜下查看。
4. 将幻灯片存放在深色容器或幻灯片支架中，因为 PLA 标记的样品具有淡敏感。制造商建议，幻灯片可以储存在-20°C，用于长期存储，也可以储存在4°C，用于短期存储。使用此协议准备的幻灯片在 20°C 下存储时至少会持续 2 个月。

11. 图像采集

1. 为了量化，使用共聚焦显微镜捕获在清晰视野、无损坏和畅通无阻的挤出生殖系的图像。捕获线系的 z 堆栈，该堆栈跨越 z 平面中的整个生殖系，并生成用于定量的最大投影图像。
   注:与使用荧光显微镜获得的图像相比，共聚焦显微镜是获取和量化背景较少的PLA图像的理想选择。
   1. 如果生殖系不适合一个视场，则根据需要捕获重叠的视场，以成像整个生殖系。这些图像的最大投影可以在 FIJI 中拼接在一起。
2. 一定要在对照样品和实验样品之间保持相同的成像条件，为图像分析期间识别foci设定一个公平、适当的阈值。
   注:每次复制从每个样品中记录至少8-10个生殖系，以便对PLA定量进行统计分析。建议解放军至少进行三次生物复制，以获得可靠和一致的定量结果。

12. 使用 FIJI/ImageJ 进行图像分析和定量

注: 以下工作流基于在共聚焦显微镜上使用 40x 目标获取的图像，其中图像以 .czi 格式保存。这些 .czi 图像及其附带的元数据（包括尺寸）可以在 FIJI/ImageJ 中访问和打开，以便进一步分析。应检查 FIJI 是否接受来自特定用户可用的共聚焦文件的格式。否则，可以交替使用 .tiff 格式的图像进行分析，但用户需要在 FIJI/ImageJ 中手动设置图像的比例（分析 |设置比例。建议首先将所有负控制图像分析在一起，以确定背景级别。

1. 首先分析所有负控制图像，然后转到实验样本，从而启动分析工作流。打开 FIJI/ImageJ 中的最大投影图像进行分析（图 2A）。如果使用 .czi 文件，将提示使用生物格式导入选项框。
   1. 包括以下选项来打开映像:使用数据浏览器查看堆栈;颜色模式 =着色。现在，具有图像的窗口应打开一个滑动条，在共聚焦捕获的不同通道（例如 DAPI 或 PLA）之间切换。
   2. 如果需要拼接图像，请通过用鼠标右选择图像并选择"重复"窗口来从每个图像创建每个通道的重复项。仅指定对应于 PLA 或 DAPI 通道（例如2）的通道号 （c），并取消选中"重复超堆栈"复选框。
   3. 打开两个图像后，选择插件 |缝合 |已弃用 |2D缝合。将打开2D 图像的拼接窗口。选择将用于拼接的图像，并使用窗口中预设的默认参数，然后选择"确定"。生成的图像将是一个组装的灰度图像。
      注: 如果子图像不完全对齐，则调整参数（即，将要检查的峰值数从5增加到500，或将融合方法从线性混合更改为Max。强度）可能有助于获得所需的图像。虽然其他拼接工具可用，但这种方法保留了图像的尺寸，这对定量非常重要。
2. 按键盘上的T打开 ROI（感兴趣区域）管理器。将打开一个名为ROI 管理器的新窗口。
3. 从 FIJI 工具集框中选择多边形工具。在生殖系周围放置点以勾勒出它并生成 ROI（图 2B）。将最后一个点连接到第一个点，以生成完整的 ROI。
   注: 对于较暗的图像，调整对比度以提高生殖系（可逆）的可见性是很有帮助的，以便更准确地勾勒出它。
   1. 完成 ROI 后，立即转到 ROI 经理，然后选择"添加 [t]以存储 ROI。在继续下一步之前，必须更新 ROI 的任何更改，包括添加/删除点或移动 ROI 和点（从 ROI 经理中选择"更新"），否则这些更改将丢失。有关操纵 RO 及其点的进一步详细信息，请参阅 FIJI/ImageJ 用户指南。
4. 设置 ROI 方向后，可以通过在 ROI 管理器中选择 ROI 名称后，然后选择更多 ， 将其保存以供以后参考保存 |（命名文件并指定要保存的位置的目标）。通过选择更多 |打开 |（选择该文件）.
5. 通过从 ROI 经理中选择 ROI 名称，然后选择 ROI 经理上的"度量"按钮，衡量 ROI 内部的区域。将打开"结果"窗口，其中将包含有关 ROI 的信息，包括它覆盖在图像中的区域 （μM²）（图 2B的页）。在电子表格中记录此信息以供后续计算。
   注: 确保图像的比例已正确设置，以便收集 ROI 的正确维度。"结果"框中报告的测量类型可以通过"分析" 进行修改|设置测量...
6. 通过右选择 PLA 图像并选择"重复"（图 2C），打开仅解放军通道的重复图像。将打开"重复"窗口。仅指定与 PLA 通道对应的通道号 （c）（例如，2），并取消选中"重复超堆栈"复选框。建议复制此图像，以便不修改原始图像。
   注:这些选项仅在查看 FIJI/ImageJ 上包含多个通道的图像时才会显示。另一种方法是拆分通道图像|颜色 |拆分通道，但这将修改原始图像文件。
7. 只选择 PLA 通道的图像，转到图像|调整 |阈值。将打开图像的阈值窗口。选择"默认"作为阈值方法，红色作为颜色，然后选中"深色背景"框。使用窗口上的上轨，将条向右侧滑动，直到图像中明显突出显示所有 PLA foci。
   1. 将值记录在上轨右侧的框中，并记下用于设置阈值的值。在"阈值"窗口中选择"应用"以最终确定阈值，图像将转换为白色背景，只有阈值作为黑点可见（图2D）。测试多个负控制图像的阈值，以确保在量化之前捕获从图像到图像的所有 PLA 信息。
      注: 要将阈值 foci 视为白色背景上的黑点，请访问"进程" |二进制 |选项...并取消选中"黑色"背景框。30-40 之间的阈值是识别生殖系中的 PLA 的良好起点;但是，理想值可能因背景而异。
8. 要量化 PLA 信息，请从 ROI 管理器窗口中选择 ROI 名称，将步骤 12.3-12.3.1 生成的 ROI 应用于阈值映像。ROI 的轮廓应与源映像位于同一位置的映像显示（图 2E）。
   1. 转到分析 |分析粒子。"分析粒子"窗口将打开并选择以下参数:大小（微米+2）=0-无穷大，圆度 = 0.00-1.00，显示 =无。选中"汇总"框。
   2. 选择"确定"，将显示一个摘要表，其中将显示有关投资回报率的信息（即，解放军在投资回报率中所占用的总面积、解放军官皮的平均大小以及 PLA foci 相对于 ROI 大小的面积百分比）（图 2E中）。在电子表格中记录这些测量值。
9. 对使用相同阈值的多个负控制图像重复步骤 12.1-12.8。
   1. 分析所有负控制图像后，对所有实验样本重复步骤12.1-12.8，使用负控制确定的相同阈值来识别和量化PLA foci。

结果

3xFLAG::DLC-1的共免疫染色;GFP 和 3xFLAG::DLC-1;OMA-1:具有FLAG和GFP抗体的GFP生殖系揭示了它们在生殖系中的表达模式（图3Aii-iii，3Bii-iii）。虽然GFP在整个生殖系中表达（图3Aiii），但OMA-1:GFP表达仅限于晚期的pachytene和卵母细胞（图3Biii）27。²⁷FLAG免疫染色显示，3xFLAG::DLC-1在两种菌株的生殖系中表达（图3Aii，3Bii）。通过共同免疫染色，3xFLAG::DLC-1 和 OMA-1:GFP 之间的重叠与 3xFLAG::DLC-1 和 GFP（负...

讨论

在研究C.elegans生殖系中的PPI时，PLA提供的与共同免疫染色相比提供的更高分辨率，可以对生殖系中发生相互作用的位置进行可视化和定量。此前有报道称，DLC-1使用体外GST下拉测定²⁶直接与OMA-1相互作用;然而，这种相互作用并没有通过体内下拉恢复。3xFLAG的荧光共免疫染色::DLC-1;OMA-1:GFP生殖系显示DLC-1和OMA-1的表达模式重叠;然而，没有迹象表明它们的相互作用发生在生殖系中，并且重叠本身不大于3xFLAG::DLC-1和GFP之间没有融合到任何蛋白质（负控制）之间的重叠。使用原地PLA，发现DLC-1确实与发芽线上的OMA-1相互作用，这表明PLA在检测PPI方面可能比其他方法更敏感。通过这种方法，我们继续扩展 DLC-1 作为 RBP 协理器的新兴作用。这项工作展示了PLA在生殖系中检测PPI的能力，并为未来用户探索自己感兴趣的蛋白质之间的相互作用提供了参考。

PLA 为用户提供了测试具有类似灵敏度的 PPI 的能力，而不需要与其他技术（如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16% 多聚甲醛溶液	电子显微镜服务	15710	用于制备 4% 工作溶液
1M KH2PO4	Sigma	P0662	制备 1M 工作原液
1x M9	各种	制备	为 10x 原液，用于 1x;参见 wormbook.org 方案
1x PBS	各种	不同	参见方案
26.5 针	Exel International	26402	针
BSA	Lampire	7500802
离心管	Thermo Scientific	05-529C	50ml 橡树岭离心管，用于同步
共聚焦显微镜	蔡	880
Coplin 染色缸	PolyLab	62101
用于冷冻样品的盖玻片	Globe Scientific	1411-10,22	x 40 mm，1 号
盖玻片，用于密封载玻片	Globe Scientific	1404-15,22	x 22 mm，1.5 号
载体	H-1200		DAPI 封固剂
	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x 连接酶，作为 Duolink 原位检测试剂 Red 试剂盒的一部分DUO92008
扩增红色缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x 扩增红色缓冲液，作为 Duolink 原位检测试剂红色试剂盒的一部分 DUO92008
连接缓冲液	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x 连接缓冲液，作为 Duolink 原位检测试剂红色试剂盒的一部分 DUO92008
抗体稀释剂	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink 抗体稀释剂，随附 DUO92004 和 DUO92002，注意：也可以使用 1x PBS/1% BSA 溶液作为替代品来稀释抗体。
封闭解决方案	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink 封闭解决方案，随附
封固剂	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink 原位封固剂，带 DAPI
MINUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink 原位探针 抗小鼠 MINUS
PLUS 探针	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink 原位探针抗兔 PLUS
洗涤缓冲液 A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink 原位洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink 原位洗涤缓冲液 B
聚合酶	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink 聚合酶，作为 Duolink 原位检测试剂 Red 试剂盒的一部分 DUO92008
落射荧光显微镜	Leica		DFC300G相机，DM5500B显微镜
山羊抗小鼠 Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	以 1：500 的速度使用
山羊抗兔药物 Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	以 1：200 的速度使用
图像处理软件	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
玻璃移液器	Corning	7095B-5X
左旋咪唑	ACROS有机物	187870100	制备 250 mM 工作原液
甲醇	Fisher Scientific	A454
小鼠抗 FLAG	Sigma	F1804	以 1：1000 的比例用于免疫荧光和 PLA，用正常山羊血清预封闭 推荐
使用指甲油	洛杉矶颜色	CNP195
线虫生长培养基 （NGM）	各种		参见 wormbook.org方案
正常山羊血清	JacksonImmuno	005-000-121
聚乙烯巴斯德移液管	Globe Scientific	135030
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1524	制备为 0.1% 水溶液储备液，储存在 -20°C，并在水中以 1：100 稀释以包被载玻片
培养皿	Tritech	PD7060	60 直径
兔子抗 GFP	Thermo Fisher	G10362	荧光以 1：200 的比例使用，PLA 载玻片以 1：4000 的比例使用
	Thermo Fisher	30-2066A-Brown	带棒的三方 14x14mm 可高温高压灭菌载玻片可通过 Fisher Scientific 定制订购。在实验室的载玻片中添加聚-L-赖氨酸
次氯酸钠溶液	Fisher Scientific	SS290-1
任务湿巾	Kimtech	34120	4.4x8.4 英寸任务湿巾
托盘（242x241x20mm）	Thermo Fisher	240845	用于制作潮湿室
Triton X-100	ACROS 有机物	327372500
超纯水	Milli-Q		从 Milli-Q 整体水净化系统
Watchglass	Carolina Biological	742300-20
° 获得的超纯水C 冷冻机
-80 °C 冷冻室
铝箔
OP50 菌株 大肠杆菌
轨道摇床
胶带
<强>本研究中使用的线虫菌株（均可根据要求提供）
mntSi13[pME4.1] II;unc-119（ed3） III;teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom：：3xFLAG：:d lc-1：:d lc-1 3'UTR;oma-1 prom：：oma-1：：GFP;参考文献 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119（ed3） III		UMT 422	dlc-1 prom：：3xFLAG：:d lc-1：:d lc-1 3'UTR; gld-1 prom：：ceGFP：：fbf-1 3'UTR + unc-119（+）;参考资料：本研究