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方法文章

利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装

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DOI：

10.3791/60982

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2020年5月5日

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Montana

本文内容

摘要

本方案演示了使用邻近连接技术检测蛋白质-蛋白质相互作用 原位 在 秀丽隐杆线虫 生殖系

摘要

了解蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）发生的时间和位置，对于理解蛋白质在细胞内的功能以及发育等更广泛的生命过程如何受到影响至关重要。Caenorhabditis elegans 的生殖系是研究与干细胞调控、减数分裂及发育相关PPI的优良模型系统。该系统具备多种成熟的蛋白质标记技术，可使目标蛋白被常规抗体识别，因而特别适用于邻近连接实验（PLA）反应。因此，相较于其他方法，PLA能够更有效地以时空特异性的方式展示PPI在生殖系中的发生位置。本文介绍了一种应用于C. elegans生殖系中PPI检测与定量分析的技术方案。

引言

据估计，超过80%的蛋白质会与其他分子发生相互作用1，这凸显了蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在细胞内执行特定生物学功能中的重要性2。某些蛋白质作为枢纽发挥作用，促进形成细胞存活所必需的更大复合物1。这些枢纽介导多种蛋白质-蛋白质相互作用，并帮助将蛋白质组织成网络，以促进细胞内的特定功能3。蛋白质复合物的形成还受到生物学背景的影响，例如特定相互作用伙伴的存在与否4、细胞信号事件以及细胞的发育阶段。

C. elegans 常被用作多种研究的模式生物，包括发育研究。该生物结构简单，具有多个器官，如性腺、肠道和透明的角质层，这有利于对线虫发育过程的分析。位于性腺中的生殖系是研究生殖系干细胞如何成熟为配子5，并进一步发育为胚胎，最终形成下一代子代的优良工具。生殖系的远端顶端区域含有一群自我更新的干细胞（图1）。当干细胞离开干细胞微环境（niche）后，会进入减数分裂的粗线期，并最终在年轻成虫阶段发育为卵细胞（图1）。生殖系中的这一发育程序受到多种机制的严格调控，其中包括由RNA结合蛋白（RBPs）介导的转录后调控网络6。蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在这一调控活动中至关重要，因为RNA结合蛋白需与其他辅助因子相互作用以发挥其功能。

在秀丽隐杆线虫中，有多种方法可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），但每种方法都有其独特的局限性。体内免疫共沉淀（IP）可用于从整个线虫提取物中分离蛋白质-蛋白质复合物；然而，该方法无法指明PPI在线虫体内的具体发生位置。此外，那些短暂存在、仅在特定发育阶段或少数细胞中形成的蛋白质复合物，通过共免疫沉淀难以被有效捕获。最后，IP实验还需考虑裂解后蛋白质复合物可能发生重排，以及蛋白质非特异性结合于亲和基质等问题。

替代方法 原位 检测蛋白质相互作用（PPIs）的方法包括共免疫染色、荧光共振能量转移（FRET）和双分子荧光互补（BiFC）。共免疫染色依赖于在固定线虫组织中同时检测两种目标蛋白，并测量信号共定位的程度。使用超分辨率显微镜可获得比常规显微镜更精细的细节7有助于更严格地检验超出200-300 nm衍射极限的蛋白质共定位8然而，共免疫染色结合常规显微镜与超分辨率显微镜技术最适合用于具有明确定位模式的蛋白质。相比之下，对于呈弥散分布的相互作用蛋白伴侣，该方法提供的信息量显著减少。基于信号重叠程度来评估共定位，并不能准确反映蛋白质之间是否真正形成复合物。9,10.

此外，蛋白质-蛋白质复合物的共免疫沉淀和共免疫染色并非定量方法，因此难以判断此类相互作用是否具有显著性。FRET 和 BiFC 均为基于荧光的技术。FRET 依赖于用具有光谱重叠的荧光蛋白（FP）标记目标蛋白，使得一个荧光蛋白（供体）的能量传递给另一个荧光蛋白（受体）11。这种非辐射能量转移会导致受体荧光蛋白在其相应的发射波长处产生可检测的荧光信号。BiFC 技术基于在活体（in vivo）条件下重建荧光蛋白。该方法将 GFP 分裂为两个互补片段，例如螺旋 1-10 和螺旋 1112，并将这些片段分别与两个目标蛋白融合。当这两个蛋白发生相互作用时，GFP 的互补片段在空间上足够接近，能够折叠并组装，从而重建 GFP 荧光基团。重建后的 GFP 可直接通过荧光观察，指示蛋白质相互作用（PPI）发生的位置。

因此，FRET 和 BiFC 均依赖较大的荧光标签，这些标签可能会干扰被标记蛋白的功能。此外，FRET 和 BiFC 需要被标记蛋白的表达量充足且相当，才能获得准确的数据。当其中一个相互作用蛋白过量时，FRET 可能不适用，因为这会导致较高的背景信号13。在 BiFC 实验中也应避免过表达，因为这可能引起非特异性组装14，从而增加背景信号。这两种技术均需要优化被标记蛋白的表达条件和成像条件，这可能会延长实验所需的时间。

邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）是一种可克服上述技术局限性的替代方法。PLA 利用能够识别目标蛋白（或其标签）的一抗，随后这些一抗会与带有寡核苷酸探针的二抗结合；当两个寡核苷酸探针之间的距离在 40 nm（或更短）范围内时，它们可相互杂交15. 通过PCR反应扩增杂交后的DNA，并由与DNA互补的探针进行检测。由此产生的信号焦点可通过显微镜观察。该技术可用于检测蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs） 原位 在复杂组织（例如线虫性腺）中，这些组织以类似流水线的方式组织，包含处于不同发育和分化阶段的细胞。通过邻近连接技术（PLA），可在固定的线虫性腺中直接可视化蛋白质相互作用（PPIs），这有利于研究特定发育阶段是否发生PPIs。与基于共定位的检测方法相比，PLA具有更高的分辨率，适用于精确测量。若结合超分辨率显微镜使用，还可进一步揭示PLA信号焦点在细胞内的精确定位。另一优势在于，PLA反应产生的信号焦点可通过基于ImageJ的分析流程进行计数，使该技术具备定量能力。

动力蛋白轻链LC8家族最初被描述为动力蛋白马达复合物的一个亚基16 并被假定作为货物适配器发挥作用。自最初被发现以来，LC8除存在于动力蛋白马达复合物中外，还被发现存在于多种蛋白质复合物中17,18,19,20扫描含有 LC8 相互作用基序的蛋白质序列19 表明LC8可能与多种不同的蛋白质存在相互作用17,18,19,20,21,22因此，LC8家族蛋白现被视为促进大型蛋白质复合物组装的枢纽。19,22，例如内在无序蛋白的组装体21.

一 秀丽隐杆线虫 LC8家族蛋白、动力蛋白轻链-1（DLC-1）在多种组织中广泛表达，且未富集于特定的亚细胞结构23,24因此，鉴定具有生物学意义的 体内 DLC-1 的相互作用蛋白 秀丽隐杆线虫 由于以下几个原因，该实验具有挑战性：1）共免疫沉淀无法指明相互作用发生的具体组织来源；2）特定互作伴侣蛋白表达量有限或相互作用具有瞬时性，可能阻碍通过共免疫沉淀检测到相互作用；3）DLC-1 的弥散性分布会导致在共免疫染色中与潜在伴侣蛋白产生非特异性重叠。鉴于上述挑战，PLA 是一种理想的检测方法 体内 与DLC-1的相互作用

已有报道表明，DLC-1 可直接与 RNA 结合蛋白（RBPs）FBF-2 相互作用，并作为其辅助因子23 和 GLD-125我们的研究支持DLC-1作为枢纽蛋白的作用模型，并提示DLC-1有助于形成一个超越驱动蛋白的相互作用网络19,22. 利用GST下拉实验，鉴定出一种新的与DLC-1相互作用的RNA结合蛋白OMA-126OMA-1 对卵母细胞生长和减数分裂成熟具有重要作用27 并与多种翻译抑制因子和激活因子协同发挥作用28尽管FBF-2和GLD-1分别在干细胞和减数分裂粗线期区域表达，OMA-1则从减数分裂粗线期到卵母细胞阶段在整个生殖系中呈弥散性表达27 (图1）。这表明DLC-1在性腺的不同区域与RNA结合蛋白（RBPs）形成复合物。此外，还发现DLC-1与OMA-1之间存在直接相互作用 体外 无法通过 an 恢复 体内 IP。PLA 已被成功用作研究该相互作用的替代方法 秀丽隐杆线虫 生殖系，结果表明PLA可用于研究线虫中许多其他蛋白质相互作用。

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方案

注意：本实验方案使用两种潜在相互作用蛋白均带有标签的 C. elegans 菌株。强烈建议使用阴性对照菌株，即其中一种带标签蛋白预期不会与另一种带标签的候选相互作用蛋白发生相互作用。此处使用仅表达 GFP 作为阴性对照以评估背景信号，因为在秀丽隐杆线虫中 DLC-1 不会与 GFP 发生相互作用。实验菌株使用 GFP 标签标记的 OMA-1，因为初步数据表明其可能与 DLC-1 存在相互作用。在本文中，共表达对照蛋白和检测蛋白且同时表达 3xFLAG 标签标记的 DLC-1 的线虫菌株分别称为 3xFLAG::DLC-1；GFP 和 3xFLAG::DLC-1；OMA-1::GFP（菌株可按需提供；详见材料表）。本实验采用 3xFLAG 和 GFP 标签；但也可使用其他标签，前提是其相应抗体与 PLA 试剂盒中的试剂兼容。

1. 动物护理

  1. 将线虫饲养在接种了OP50菌株的大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli 并在24 °C下维持培养，以实现GFP的最优表达。
  2. 每2-3天传代一次成虫，以维持线虫种群并确保其营养充足。

2. 同步培养物的制备

  1. 通过漂白一块喂养良好、处于生殖期的雌雄同体线虫来同步虫体发育。漂白操作步骤详见 Porta-de-la-Riva 等人29 的描述。将收集的胚胎置于含 10 mL M9 最小培养基（M9）缓冲液的离心管中，在 24 °C 下旋转（头尾翻转）过夜孵化。此过程将获得一批处于滞育状态的 L1 幼虫。
  2. 将含有滞育 L1 幼虫的离心管置于冰上孵育 10 分钟，然后加入冰预冷的 1× M9 缓冲液补满离心管。
  3. 使用离心机在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟，使幼虫沉淀。小心吸除上清液，仅保留 1–2 mL 上清。
  4. 重新悬浮幼虫沉淀，用微量移液器吸取 2 µL 悬浮液转移至载玻片上，计数其中的幼虫数量，以确定幼虫培养液的密度，该数据将用于指导步骤 2.5 中线虫的接种量。
    注：幼虫培养液密度在 10–15 条 L1 幼虫/1 µL 时适合接种。
  5. 使用微量移液器转移适量的幼虫培养液，使约 100–120 条 L1 幼虫接种于一个 60 mm 的 OP50 培养皿上。例如，若培养液密度为 10 条 L1 幼虫/1 µL，则接种 10 µL。
    注：接种体积不应超过 40 µL，否则过量液体将破坏 OP50 菌苔。若培养液体积超过 40 µL，应重复步骤 2.3–2.4，进一步浓缩以提高幼虫密度。
  6. 在 24 °C 下培养线虫。记录 L1 幼虫接种至培养皿的时间，并定期检查其发育阶段，以确定最佳解剖时机。
    注：在 24 °C 培养条件下，L1 接种后约 52 小时，线虫通常发育至年轻成虫阶段，此阶段最适合进行以性腺为靶标的 PLA 实验。然而，不同品系及培养温度下，同步化线虫达到年轻成虫阶段的实际时间可能有所差异。

3. 解剖/性腺挤出

注意：为了使靶向性腺的 PLA 实验成功进行，必须通过解剖将性腺挤出。该方法还可释放胚胎，胚胎也可使用本实验方案进行 PLA（详见讨论部分）。解剖后，阴性对照样本和实验样本应同时平行进行固定和 PLA 处理。此外，建议额外准备一组样本用于荧光共免疫染色23，以展示目标蛋白互作伙伴的表达模式。

  1. 用移液器挑取30-40条年轻成虫线虫，放入含有500 µL 1× M9缓冲液加左旋咪唑（终浓度2.5 mM）的手表玻璃皿中。收集线虫后，小心吸除并弃去大部分培养基，以去除随线虫转移的细菌。
  2. 加入新鲜的500 µL 1× M9缓冲液加左旋咪唑，用移液器轻轻吸打液体以清洗线虫。随后小心吸除并弃去大部分液体，以清除随线虫带入的细菌。
    1. 重复此步骤2至3次，直至完全去除细菌。清洗完成后，保留约100 µL液体以保持线虫湿润。
      注意：线虫在液体中停留时间不得超过7分钟，否则会影响解剖时性腺的挤出。应在解剖显微镜下进行清洗操作，以便监控液体去除过程，防止线虫丢失。
  3. 使用玻璃或聚乙烯移液器，将线虫转移至经0.001%多聚-L-赖氨酸包被的25 mm × 75 mm显微镜载玻片上（本实验所用载玻片四周具有环氧涂层，形成三个工作区域，每个区域为14 mm × 14 mm）。去除多余液体，使残留液体量约为10–15 µL。
  4. 在解剖显微镜下，使用两根26½号细针，将一根针置于另一根之上，使针尖交叉形成剪刀状。以此方式操作细针，在咽部后方剪开线虫，释放生殖腺。所有线虫应在5分钟内完成解剖。
    注意：有关解剖操作的更多细节，可参考Gervaise和Arur此前发表的研究30。
  5. 完成所有线虫解剖后，轻轻将一块22 mm × 40 mm的盖玻片覆盖在载玻片上，使其与载玻片垂直，盖玻片两端应悬于载玻片之外。
  6. 将载玻片置于预先冷却的铝块上（铝块置于干冰中），冷冻至少20分钟。轻轻将一支预冷的铅笔置于盖玻片上方，以防止因冰晶膨胀导致盖玻片松动。

4. 固定/封闭

  1. 准备固定时，用铅笔或其他钝边工具轻弹盖玻片，使其脱落，立即将载玻片浸入盛有新鲜冰甲醇（预冷至 -20 °C）的容器中，固定 1 分钟。
  2. 轻轻擦拭载玻片样品周围边缘，使后续试剂依靠表面张力环绕样品。在室温下加入 150 µL 固定液（2% 甲醛溶于 100 mM KH2PO4，pH = 7.2），孵育 5 分钟。
    注意：我们还测试了甲醇/丙酮固定程序31,32，发现其与 PLA 反应兼容。
  3. 将载玻片以垂直 90° 角接触纸巾，使固定液从载玻片上流下并被纸巾吸收。在 Coplin 染色缸中用 50 mL 1x PBS/1% Triton X-100/1% 牛血清白蛋白（PBT/BSA）于室温下封闭 2 次，每次 15 分钟。
    注意：建议在本步骤及后续第 6–9 节的洗涤步骤中使用 Coplin 染色缸或其他类型的染色缸。此类容器可提供足够体积，以实现封闭液或洗涤缓冲液与样品之间的高效交换。
  4. 使用含 10% 正常山羊血清的 PBT/BSA 溶液对载玻片进行封闭。轻轻擦拭载玻片周围边缘，然后加入 100 µL 该溶液。在湿盒中室温孵育 1 小时。
    注意：此步骤强烈推荐用于 αFLAG 一抗染色。湿盒的构建方法为：用胶带将玻璃移液管固定在载玻片托盘底部，供载玻片放置孵育。在托盘内放置润湿的任务擦拭巾（材料表），以提高内部湿度，防止蒸发。在孵育过程中，用铝箔包裹盒盖和托盘，以保护样品免受光照，特别是在对光敏感的步骤中。
  5. 将载玻片置于纸巾上，使 PBT/BSA/10%NGS 溶液流下，并轻轻擦拭载玻片边缘。使用封闭试剂（材料表）对载玻片进行封闭。在 14 mm × 14 mm 区域内滴加一滴试剂。在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。

5. 一抗孵育

注意：为了获得最佳的 PLA 结果并减少背景信号，可能需要优化一抗的稀释倍数（详见讨论部分）。此外，一抗应来自不同的宿主，且与 PLA 实验中所用二抗的特异性相匹配。

  1. 将玻片置于纸巾上，使封闭剂流下，并轻轻擦拭边缘。使用抗体稀释液（材料表）稀释一抗。每个 14 mm × 14 mm 区域加入 40 µL 一抗溶液。
  2. 将玻片置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。

6. PLA 探针（二抗）孵育

注意：步骤 6-9 中，使用室温的洗涤缓冲液 A 和 B。如果缓冲液储存于 4 °C，则使用前需使其升至室温。

  1. 在室温下，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用 50 mL 的 1× 洗涤缓冲液 A（材料表）洗涤 2 次，每次 5 分钟。将 Coplin 染色缸置于设定为 60 rpm 的旋转摇床上。
  2. 将载玻片放在纸巾上，使洗涤缓冲液从载玻片上流下，并轻轻擦拭边缘。准备 40 µL 的溶液，其中包含 PLUS 和 MINUS 探针（用抗体稀释液按 1:5 稀释）。将该溶液加至每个 14 mm × 14 mm 的区域。
  3. 将载玻片在湿盒中于 37 °C 孵育 1 小时。

7. 连接

  1. 在室温下，于 Coplin 染色缸中用 50 mL 1× 洗涤缓冲液 A 清洗载玻片 2 次，每次 5 分钟。将 Coplin 染色缸置于设定为 60 rpm 的轨道摇床上。
  2. 用超纯水将连接酶缓冲液（材料表）按 1:5 稀释。用此缓冲液将连接酶（材料表）按 1:40 稀释，以配制连接反应工作液。
    1. 将载玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液自然流下，并轻轻擦拭边缘。在每个 14 mm × 14 mm 区域上加 40 µL 连接反应工作液。
  3. 将载玻片置于湿盒中，在 37 °C 下孵育 30 分钟。

8. 扩增

注意：使用带有红色荧光染料的检测试剂（材料表）可使秀丽隐杆线虫（C. elegans）组织中的背景信号降至最低。

  1. 在室温下，于Coplin染色缸中用50 mL 1×洗涤缓冲液A洗涤载玻片，每次5分钟，共洗涤2次。将Coplin染色缸置于转速为60 rpm的轨道摇床上。
  2. 用超纯水将扩增红色缓冲液（材料表）按1:5比例稀释。再用此缓冲液将聚合酶（材料表）按1:80比例稀释，配制扩增工作液，并避光保存。
    1. 将载玻片置于纸巾上，使洗涤缓冲液自然流下，并轻轻擦拭边缘。在每个14 mm × 14 mm的区域上加40 µL扩增溶液。
  3. 将载玻片置于湿盒中，在37 °C条件下孵育1小时40分钟。确保湿盒用铝箔覆盖，以保护样品免受光照。

9. 最终洗涤

  1. 在室温下，于Coplin瓶中用50 mL的1×洗涤缓冲液B（材料表）清洗载玻片2次，每次10分钟。将Coplin瓶置于转速为60 rpm的轨道摇床上。
  2. 在室温下，于Coplin瓶中用50 mL的0.01×洗涤缓冲液B清洗载玻片1次，持续1分钟。将Coplin瓶置于转速为60 rpm的轨道摇床上。该缓冲液通过用超纯水稀释洗涤缓冲液B制备而成。

10. 盖玻片封片

  1. 让多余的洗涤缓冲液从切片上流到纸巾上，并用纸巾擦去环氧涂层切片边缘残留的缓冲液。
  2. 向样本中加入 10 µL 封片介质（材料表），轻轻盖上盖玻片，使封片介质自然铺展。
  3. 用指甲油沿盖玻片边缘涂抹，以密封盖玻片与载玻片。涂抹时动作要轻柔，避免移动盖玻片而损伤生殖系结构。将切片避光室温放置至少 20 分钟，待指甲油完全硬化后再进行显微镜观察。
  4. 将切片存放在避光容器或切片盒中，因为 PLA 标记的样本对光敏感。制造商建议长期保存可置于 -20 °C，短期保存可置于 4 °C。按照本方案制备的切片在 20 °C 下保存至少可稳定 2 个月。

11. 图像采集

  1. 为了定量分析，使用共聚焦显微镜拍摄清晰可见、无损伤且无遮挡的挤出型生殖腺图像。采集覆盖Z轴整个生殖腺范围的Z-stack图像，并生成最大投影图像用于定量分析。
    注意：与使用落射荧光显微镜获得的图像相比，共聚焦显微镜更适合获取和定量PLA图像，背景信号更低。
    1. 如果生殖腺无法在一个视野内完整呈现，可根据需要拍摄重叠的多个视野。这些图像的最大投影图可在FIJI软件中进行拼接。
  2. 务必保持对照样本与实验样本的成像条件一致，以便在图像分析过程中为信号焦点的识别设定公平且恰当的阈值。
    注意：每次重复实验中，每组样本应至少记录8–10个生殖腺，以利于PLA定量结果的统计分析。建议至少进行三次生物学重复实验，以获得可靠且一致的定量结果。

12. 使用 FIJI/ImageJ 进行图像分析与定量

注意：以下工作流程基于使用共聚焦显微镜40倍物镜获取的图像，图像以.czi格式保存。这些.czi图像及其伴随的元数据（包括尺寸信息）可在FIJI/ImageJ中访问和打开，用于进一步分析。应首先确认FIJI是否支持用户所使用的共聚焦显微镜生成的文件格式。如果不支持，可改用.tiff格式的图像进行分析，但用户需在FIJI/ImageJ中手动设置图像比例尺（分析 | 设置比例尺）。建议首先统一分析所有阴性对照图像，以确定背景信号水平。

  1. 首先分析所有阴性对照图像，然后继续分析实验样本，以此启动分析流程。在 FIJI/ImageJ 中打开一幅最大投影图像进行分析（图 2A）。如果使用 .czi 文件，系统将弹出Bio-Formats 导入选项对话框。
    1. 使用以下选项打开图像：在数据浏览器中查看堆栈；颜色模式 = 彩色化。此时应打开一个包含图像的窗口，并带有滑动条，可用于在共聚焦显微镜捕获的不同通道（例如 DAPI 或 PLA）之间切换。
    2. 如果图像需要拼接，请通过鼠标右键点击图像并选择复制，为每幅图像的每个通道创建副本，以打开复制窗口。仅指定对应于 PLA 或 DAPI 通道的通道编号（c）（例如 2），并取消勾选复制超堆栈选项。
    3. 在需要拼接的两幅图像均已打开的情况下，选择插件 | 拼接 | 已弃用 | 2D 拼接。将弹出2D 图像拼接窗口。选择用于拼接的图像，并使用窗口中预设的默认参数，然后点击确定。生成的图像将是一幅拼接完成的灰度图像。
      注意：如果子图像未能完全对齐，调整参数（例如将检查的峰值数量从5增加到500，或将融合方法从线性混合更改为最大强度）可能有助于获得理想图像。尽管存在其他拼接工具，但此方法可保留图像的维度信息，这对定量分析至关重要。
  2. 按下键盘上的T键，打开 ROI（感兴趣区域）管理器。一个名为ROI 管理器的新窗口将被打开。
  3. 从 FIJI 工具箱中选择多边形工具，在生殖系周围逐点标记以勾勒其轮廓，并生成一个 ROI（图 2B）。将最后一个点与第一个点连接，以生成一个完整的 ROI。
    注意：对于较暗的图像，调整对比度以提高生殖系的可见性（该操作可逆）将有助于更精确地勾勒轮廓。
    1. 完成 ROI 后，立即进入 ROI 管理器并选择添加 [t]以保存该 ROI。在进入下一步之前，必须更新对 ROI 的任何更改（包括添加/删除点或移动 ROI 及其点），方法是在 ROI 管理器中选择更新，否则更改将丢失。有关 ROI 及其点操作的更多详细信息，请参阅 FIJI/ImageJ 用户指南。
  4. ROI 方向确定后，可在 ROI 管理器中选中 ROI 名称，然后选择更多 | 保存 |（命名文件并指定保存位置），以供后续参考。保存的 ROI 可通过在 ROI 管理器中选择更多 | 打开 |（选择文件）重新载入。
  5. 在 ROI 管理器中选中 ROI 名称，然后点击测量按钮，以测量 ROI 内部的面积。将打开一个结果窗口，显示有关 ROI 的信息，包括其在图像中覆盖的面积（µM2）（图 2B的插图）。将此信息记录在电子表格中，用于后续计算。
    注意：请确保图像的比例尺已正确设置，以获取 ROI 的准确尺寸。可通过进入分析 | 设置测量...来修改结果窗口中报告的测量类型。
  6. 通过右键点击 PLA 图像并选择复制，打开仅包含 PLA 通道的图像副本（图 2C）。将弹出复制窗口。仅指定对应于 PLA 通道的通道编号（c）（例如 2），并取消勾选复制超堆栈选项。建议复制该图像，以避免修改原始图像。
    注意：这些选项仅在 FIJI/ImageJ 中查看包含多个通道的图像时才会显示。另一种方法是拆分通道：图像 | 颜色 | 拆分通道，但这将修改原始图像文件。
  7. 在仅选中 PLA 通道图像的情况下，进入图像 | 调整 | 阈值。图像的阈值窗口将被打开。选择默认作为阈值方法，红色作为颜色，并勾选暗背景选项。使用窗口上方的滑块，将滑块向右移动，直到图像中所有 PLA 焦点均被清晰高亮显示。
    1. 记录滑块右侧框中的数值，并记下用于设定阈值的具体数值。在阈值窗口中点击应用以确认阈值设置，图像将转换为白色背景，仅阈值焦点以黑色点状显示（图 2D）。在多个阴性对照图像上测试该阈值，以确保其适用于不同图像中所有 PLA 焦点的捕获，再进行定量分析。
      注意：若要将阈值焦点显示为白底黑点，请进入处理 | 二值化 | 选项…，并取消勾选黑色背景选项。30–40 之间的阈值是识别生殖系中 PLA 的良好起点；然而，理想值可能因背景差异而有所不同。
  8. 为定量分析 PLA 焦点，将步骤 12.3–12.3.1 生成的 ROI 应用于阈值图像：在 ROI 管理器窗口中选择 ROI 名称。ROI 轮廓应出现在图像上，位置与源图像中一致（图 2E）。
    1. 进入分析 | 分析颗粒。将打开分析颗粒窗口，请设置以下参数：大小（micron^2）= 0-无穷大，圆度 = 0.00–1.00，显示 = 无。勾选汇总选项。
    2. 点击确定，将弹出一个汇总表格，其中包含有关 ROI 的信息（例如 ROI 内 PLA 焦点的总数、PLA 焦点占据的总面积、PLA 焦点的平均大小，以及 PLA 焦点占据面积占 ROI 总面积的百分比）（图 2E的插图）。将这些测量数据记录在电子表格中。
  9. 使用相同的阈值，对多个阴性对照图像重复执行步骤 12.1–12.8。
    1. 在完成所有阴性对照图像的分析后，使用由阴性对照确定的相同阈值，对所有实验样本重复执行步骤 12.1–12.8，以识别并定量 PLA 焦点。

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结果

使用 FLAG 和 GFP 抗体对 3xFLAG::DLC-1; GFP 以及 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP 两种品系的生殖腺进行共免疫染色，揭示了它们在生殖腺中的表达模式（图 3Aii-iii, 3Bii-iii）。GFP 在整个生殖腺中均有表达（图 3Aiii），而 OMA-1::GFP 的表达则局限于晚期粗线期和卵母细胞（图 3Biii）27。FLAG 免疫染色结果显示，在两种品系中，3xFLAG::DLC-1 均在整个生殖腺中表达（图 3Aii, 3Bii）。通过共免疫染色发现，3xFLAG::DLC-1 与 OMA-1::G...

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讨论

研究蛋白质相互作用（PPIs）时 秀丽隐杆线虫 生殖系中，与共免疫染色相比，PLA 提供的更高分辨率可实现对生殖系内相互作用发生位置的可视化与定量分析。先前已有报道指出，DLC-1 与 OMA-1 之间存在直接相互作用，该作用通过一种 体外 GST下拉实验26；然而，体内pull down实验未能检测到这种相互作用。对3xFLAG::DLC-1与OMA-1::GFP在生殖腺中的荧光共免疫染色显示DLC-1与OMA-1的表达模式存在重叠；然而，尚无证据表明二者在生殖腺中的相互作用发生位置，且该重叠程度并不高于3xFLAG::DLC-1与未融合任何蛋白的GFP（阴性对照）之间的重叠。通过 原位 PLA结果显示，DLC-1确实在生殖系中与OMA-1发生相互作用，这表明PLA在检测蛋白质相互作用（PPIs）方面可能比其他方法更为灵敏。通过该方法，我们进一步拓展了DLC-1作为RNA结合蛋白（RBP）辅助因子的新兴功能。本研究证明了PLA在生殖系中检测蛋白质相互作用的能力，为今后研究者探索自身关注蛋白之间的相互作用提供了参考依据。

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致谢

本研究中使用的一些线虫品系由美国国立卫生研究院（NIH，资助号P40OD010440）资助的Caenorhabditis遗传中心提供。共聚焦显微镜实验在蒙大拿大学生物光谱学核心研究实验室完成，该实验室的运行得到了美国国立卫生研究院资助项目P20GM103546和S10OD021806的支持。本工作部分由NIH基金GM109053（资助E.V.）、美国心脏协会博士后奖学金18PRE34070028（资助X.W.）以及蒙大拿科学院奖项（资助X.W.）支持。资助方未参与本研究的设计或报告撰写。我们感谢M. Ellenbecker提供的讨论与建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 多聚甲醛溶液电子显微镜服务15710用于配制 4% 工作液
1M KH2PO4SigmaP0662配制 1M 工作储备液
1x M9多种多种按 10x 储备液配制，使用时稀释至 1x；实验方案详见 wormbook.org
1x PBS多种多种实验方案详见 wormbook.org
26.5 号针头Exel International26402用于解剖的针头
BSALampire7500802
离心管Thermo Scientific05-529C50 ml Oak Ridge 离心管，用于同步化处理
共聚焦显微镜Zeiss880
柯普林瓶（Coplin Jar）PolyLab62101
用于冷冻样品的盖玻片Globe Scientific1411-1022x40 mm，No. 1
用于封片的盖玻片Globe Scientific1404-1522x22 mm，No. 1.5
免疫荧光用 DAPI 封片剂VectorH-1200
连接酶Sigma-AldrichDUO82029Duolink 1x 连接酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
扩增红缓冲液Sigma-AldrichDUO82011Duolink 5x 扩增红缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
连接缓冲液Sigma-AldrichDUO82009Duolink 5x 连接缓冲液，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
抗体稀释液Sigma-AldrichDUO82008Duolink 抗体稀释液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供；注意：也可使用 1x PBS/1% BSA 溶液替代稀释抗体
封闭液Sigma-AldrichDUO82007Duolink 封闭液，随 DUO92004 和 DUO92002 提供
PLA 封片剂Sigma-AldrichDUO82040含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片剂
MINUS 探针Sigma-AldrichDUO92004Duolink In Situ 抗小鼠 MINUS 探针
PLUS 探针Sigma-AldrichDUO92002Duolink In Situ 抗兔 PLUS 探针
洗涤缓冲液 ASigma-AldrichDUO82046Duolink In Situ 洗涤缓冲液 A
洗涤缓冲液 BSigma-AldrichDUO82048Duolink In Situ 洗涤缓冲液 B
聚合酶Sigma-AldrichDUO82030Duolink 聚合酶，包含于 Duolink In Situ 检测试剂红套装 DUO92008 中
落射荧光显微镜Leica配备 DFC300G 相机的 DM5500B 显微镜
山羊抗小鼠 Alexa 594JacksonImmuno115-585-146使用稀释比为 1:500
山羊抗兔 Alexa 488JacksonImmuno111-545-144使用稀释比为 1:200
图像处理软件AdobeAdobe Photoshop + Illustrator CS3
玻璃移液管Corning7095B-5X
左旋咪唑（Levamisole）ACROS Organics187870100配制 250 mM 工作储备液
甲醇Fisher ScientificA454
小鼠抗 FLAG 抗体SigmaF1804免疫荧光和 PLA 实验中使用稀释比为 1:1000，建议用正常山羊血清预先封闭
指甲油L.A. colorsCNP195
线虫生长培养基（NGM）多种实验方案详见 wormbook.org
正常山羊血清JacksonImmuno005-000-121
聚乙烯巴斯德移液管Globe Scientific135030
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP1524以水配制成 0.1% 储备液，-20°C 保存，使用时以水 1:100 稀释后用于包被载玻片
培养皿TritechPD7060直径 60 mm
兔抗 GFP 抗体Thermo FisherG10362免疫荧光实验中使用稀释比为 1:200，PLA 实验中为 1:4000
载玻片Thermo Fisher30-2066A-Brown定制订购的三格 14x14 mm 可高压灭菌载玻片（带条形标记），通过 Fisher Scientific 购买；实验室内添加聚-L-赖氨酸进行包被
次氯酸钠溶液Fisher ScientificSS290-1
擦拭巾Kimtech34120尺寸为 4.4x8.4 英寸的擦拭巾
托盘（242x241x20 mm）Thermo Fisher240845用于制作湿盒
吐温 X-100ACROS Organics327372500
超纯水Milli-Q来自 Milli-Q Integral 水纯化系统的超纯水
表面皿Carolina Biological742300
-20 °C 冰箱
-80 °C 冰箱
铝箔
OP50 菌株 E. coli
旋转摇床
胶带
本研究中使用的线虫品系（均可申请获取）
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]UMT 376dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；oma-1 启动子::oma-1::GFP；参考文献 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) IIIUMT 422dlc-1 启动子::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR；gld-1 启动子::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+)；参考文献：本研究

参考文献

  1. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
  3. Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
  4. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807(2010).
  5. Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
  6. Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
  7. Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003(2018).
  8. Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
  9. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  10. Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139(2015).
  11. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  12. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
  13. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
  14. Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
  15. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  16. Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
  17. Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).
  18. Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
  19. Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
  20. Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818(2011).
  21. Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
  22. Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
  23. Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
  24. Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
  25. Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).
  26. Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
  27. Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
  28. Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).
  29. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
  30. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  31. Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking". Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  32. Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).

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蛋白质-蛋白质相互作用线虫解剖共聚焦显微镜ImageJ 定量分析抗体孵育荧光标记生殖系发育时空分析
利用邻位连接实验在 C. elegans 生殖系中检测核糖核蛋白复合物的原位组装
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