方法文章

评估成人不同年龄段的吞噬能力 黑腹果蝇 使用体内吞噬作用检测法研究血细胞

7.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60983

⸱

2020年6月11日

 ,  , 
1Department of Biology, University of Maryland Baltimore County

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于评估和量化年轻与年老个体吞噬能力的体内吞噬作用检测方法 黑腹果蝇 血细胞吞噬细菌.

摘要

吞噬作用是先天免疫反应的一项基本功能。该过程由吞噬性血细胞执行，其主要功能是识别多种颗粒并清除微生物病原体。随着生物体衰老，这一过程逐渐衰退，但目前对免疫衰老的潜在机制或遗传基础仍知之甚少。本文采用一种基于注射的体内吞噬作用检测方法，通过定量分析成年黑腹果蝇（Drosophila）血细胞中的吞噬事件，评估衰老过程中吞噬作用在颗粒结合、内吞及内化颗粒降解等不同方面的变化。黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）因其多种优势已成为研究先天免疫功能随年龄变化的理想模型。首先，包括吞噬作用在内的许多先天免疫反应的遗传组分和功能在果蝇与哺乳动物之间具有进化上的保守性。因此，采用本实验方案所得结果可能广泛适用于理解多种生物免疫功能的年龄相关变化。此外，我们注意到该方法可对血细胞的吞噬能力提供定量评估，这对于多种研究课题均具有应用价值，而不仅限于衰老研究。

引言

先天免疫系统由抵御感染的物理和化学屏障以及细胞组分构成，在多细胞生物中具有进化上的保守性1,2。作为防御的第一道防线，先天免疫系统在所有动物抵抗入侵病原体的过程中发挥着关键作用1,2,3。先天免疫反应的组分包括多种细胞类型，其分类依据是缺乏特异性和免疫记忆2,3,4。在人类中，这些细胞类型包括吞噬性单核细胞和巨噬细胞、中性粒细胞以及具有细胞毒性的自然杀伤细胞4,5。尽管功能性免疫系统对宿主的生存至关重要，但显然免疫细胞的功能会随着年龄增长而下降，这一现象被称为免疫衰老5,6。能够评估免疫反应中与年龄相关的变化，包括吞噬作用过程的不同方面，将有助于我们理解免疫衰老。本文所描述的方法提供了一种有效且可重复的技术，用于评估和定量黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）血细胞中的吞噬事件。

Drosophila 是研究免疫反应的理想模型，原因众多。首先，已有大量遗传工具可供使用，能够以组织依赖的方式轻松操控基因表达7。这些工具包括一系列突变体、RNA干扰品系、GAL4/UAS品系，以及包含205个不同近交品系的Drosophila遗传参考面板，这些品系的全基因组序列均已记录在案8。Drosophila 生命周期短且繁殖数量大，使研究人员能够在短时间内于受控环境中检测大量个体。这显著提高了识别不同基因型、性别或年龄之间感染后免疫反应细微差异的能力。重要的是，包括吞噬作用在内的许多先天免疫反应的遗传组分和功能在Drosophila与哺乳动物之间是进化上保守的1,2。

在Drosophila中，感染后发生的吞噬作用由一类称为浆血细胞（plasmatocytes）的吞噬性血细胞执行，这类细胞相当于哺乳动物的巨噬细胞9。血细胞对于识别多种颗粒并清除微生物病原体至关重要9,10,11,12,13。这些细胞表达多种受体，能够区分“自我”与“非自我”，并启动吞噬过程所需的信号事件10,11,12,13,14,15。一旦颗粒被结合，细胞即通过肌动蛋白细胞骨架的重组以及质膜重塑包裹颗粒，开始将其内化，形成吞噬杯11,12,13,14。在此过程中，另一组信号促使细胞进一步内化颗粒，通过闭合吞噬杯形成由膜包被的吞噬体11,12,13,14,15。随后，吞噬体经历成熟过程，与不同蛋白质结合并融合溶酶体，形成酸性的吞噬溶酶体11,12,13,14,15。此时，颗粒可被高效降解并清除11,12,13,14,15。Drosophila的研究表明，较老的果蝇（4周龄）相较于年轻果蝇（1周龄）清除感染的能力下降，这可能至少部分归因于吞噬作用某些方面的衰退16,17。

本文所述方法利用两种不同的荧光标记的热灭活 E. coli 颗粒，其中一种携带标准荧光染料，另一种则对 pH 敏感，用于评估吞噬作用的两个不同方面：颗粒的初始吞噬过程，以及颗粒在吞噬溶酶体中的降解过程。在该检测中，当颗粒被血细胞结合并内吞后，荧光颗粒的信号即可被观察到；而 pH 敏感颗粒仅在吞噬体的低 pH 环境下发出荧光。随后可在定位于背血管的血细胞中观察到荧光信号事件。我们重点关注位于背血管区域的血细胞，该解剖结构可作为定位参与细菌清除的血细胞的解剖标志，并有助于稳定地分离这些细胞。然而，机体其他部位及血淋巴中的血细胞在清除过程中同样具有重要作用。尽管我们尚未研究该细胞群体，但本实验的通用流程也可能适用于这些细胞的吞噬功能检测。本方法的一个优势在于，我们能够对单个血细胞内的吞噬事件进行定量分析，从而检测吞噬过程中的细微差异。以往一些通过体壁观察荧光事件的研究18,19未考虑血细胞数量的差异，而在本研究中这一点尤为重要，因为总血细胞数量会随年龄发生变化17。

方案

1. 收集并培养黑腹果蝇（Drosophila）

  1. 为了获得同龄的F1代果蝇用于吞噬作用检测，将5-10只 virgin 雌蝇和5只具有适当基因型的雄蝇放入含有新鲜果蝇培养基的小瓶中。我们使用基于玉米粉-糖蜜琼脂的培养基20，但本方法应适用于任何饲养果蝇的饮食类型。本实验中使用Hemese (He)-GAL4; UAS-GFP 果蝇，以实现对血细胞的遗传标记。
    注意：可以使用更多果蝇，但某些黑腹果蝇（D. melanogaster）品系在过度拥挤时可能交配或繁殖不佳，且过度拥挤可能对幼虫发育21和吞噬作用产生不利影响。
  2. 将果蝇维持在所需的实验条件下。本实验中，将He-GAL4; UAS-GFP 果蝇维持在24 °C。让成年果蝇交配一周后移除成虫。F1代果蝇羽化后将从这些小瓶中收集用于实验。 
  3. 在整个一周内持续收集 virgin 果蝇，直至获得所需数量。并非必须使用 virgin 果蝇；然而，交配可能影响免疫反应。若F1代果蝇需以 virgin 状态进行测试，则应在羽化后8小时内将雌雄分开，并分别维持在不同的小瓶中以防止交配。收集足够数量的果蝇，以便对每种基因型/处理/性别在每个年龄阶段至少检测10只果蝇的吞噬作用。
    1. 若需将果蝇培养至一周龄，总共至少收集50只果蝇，或为每种处理条件每种颗粒（荧光颗粒或pH敏感颗粒）至少收集20只果蝇用于注射。这将确保实验时每组至少有10只果蝇可用于检测。
    2. 若需将果蝇培养超过3周，总共至少收集100-150只果蝇，或每种处理条件收集50-75只果蝇，以确保有足够的果蝇用于吞噬作用的测量。在实验室中培养果蝇时，通常使用昆虫饲养笼，在24 °C、12:12光暗周期条件下维持，并每隔一天更换一次食物。若使用小瓶而非饲养笼，则根据小瓶内食物状况，每隔3-5天将果蝇转移至新的小瓶中。所需果蝇数量取决于吞噬作用分析时的年龄大小，以及该基因型在特定环境条件下的年龄特异性存活率。
    3. 若需同时检测年轻果蝇和年老果蝇，应合理规划，使一周龄果蝇与年老果蝇在同一天接受注射。这将最大限度减少不同实验间颗粒浓度的差异，并确保年龄对吞噬作用测量结果的影响不会与实验检测当天的效应相混淆。
  4. 将收集的果蝇在24 °C下饲养至5-7日龄，或维持至所需年龄。

2. 制备荧光标记的颗粒

  1. 将热灭活的 E. coli 荧光颗粒或 pH 敏感性 E. coli 颗粒分别重悬至储存浓度为 20 mg/mL 或 1 mg/mL。也可使用其他类型的细菌，可能更适用于特定实验，但应参考生产商说明书确定合适的储存浓度。
    1. 对于荧光颗粒，加入 990 µL 的 1x PBS（pH 7.4）或所选缓冲液，以及 10 µL 的 2 mM（20%）叠氮化钠。涡旋混匀。
      注意：叠氮化钠为防腐剂，可省略；但未添加叠氮化钠的颗粒保存时间较短。荧光颗粒必须在 24 小时内使用，pH 敏感性颗粒必须在 7 天内使用。
    2. 对于 pH 敏感性颗粒，加入 1,980 µL 的 1x PBS（pH 7.4）或所选缓冲液，以及 20 µL 的 2 mM（20%）叠氮化钠。涡旋混匀。
    3. 将颗粒分装为多个单次使用量（每份 20 µL）至 1.5 mL 微量离心管中。荧光颗粒避光保存于 -20 °C，可保存长达一年；pH 敏感性颗粒避光保存于 4 °C，可保存长达 6 个月。
  2. 在注射当天，使用前需去除颗粒中的叠氮化钠。操作方法为：室温下以 15,000 x g 离心 5 分钟。
  3. 弃去上清液，用 50 µL 的 1x PBS 或所选缓冲液重悬颗粒，洗涤两次，每次均以 15,000 x g 离心 5 分钟。
  4. 第二次洗涤后，弃去上清液，将颗粒重悬于 100 µL 的 1x PBS 或所选缓冲液中。保持溶液在离心管中，并在整个实验过程中尽量减少光照。一旦去除叠氮化钠，荧光颗粒须在 24 小时内使用，pH 敏感性颗粒须在 5–7 天内使用。
    注意：在我们先前的实验中发现，该浓度的颗粒可产生可计数的吞噬事件，且血细胞可用于吞噬的颗粒数量并不存在限制17。然而，本方案的使用者可能希望比较不同浓度下的实验结果，以确保在各自实验条件下有足够数量的颗粒可供血细胞吞噬。
    1. 若已省略叠氮化钠，则在注射前用与颗粒制备时相同的缓冲液将颗粒稀释 1:5。
  5. 向颗粒中加入一滴（约 10 µL）绿色食用色素。这有助于确认果蝇已被成功注射。

3. 注射果蝇

  1. 准备用于注射的玻璃针。
    1. 使用移液器拉制仪拉制玻璃针。将移液器拉制仪的加热器设置为 55 °C，电磁阀设置为 45。仅使用注射器配套提供的针头，因为无法保证其他针头能以相同的精度工作。
    2. 用矿物油填充一支 1 mL 无菌注射器，并安装纳米注射器配套提供的 30 号（G）皮下注射针头。
    3. 通过将 30 G 针头插入拉制好的玻璃针的钝端，用矿物油反向填充毛细玻璃针。缓慢拔出 30 G 针头，确保针内无气泡，因为气泡可能导致注射体积不准确。若未对针头进行反向填充，注射器将无法正常工作。
    4. 使用镊子折断针尖，形成开口，以便溶液能够喷出。
  2. 组装纳米注射器。
    注意：也可使用其他类型的注射器。以下所述方法适用于纳米注射器。对于其他注射器，请参考其用户手册中的说明。
    1. 将注射器设定为所需体积（介于 46 nL 至 69 nL 之间）。
    2. 取下卡箍，依次将密封 O 形圈、白色垫片（凹面朝上，用于容纳针的后端）和较大的 O 形圈套在金属推杆上。重新装上卡箍，但暂不拧紧。
    3. 将金属推杆插入已充满油的玻璃针的钝端。轻轻下压针头，使其进入较大的 O 形圈内。拧紧卡箍直至固定牢固。
      注意：如果金属推杆未伸出卡箍外，按住“EMPTY”键直至推杆可见。这有助于确保推杆正确插入针头中。
    4. 按住“EMPTY”键直至注射器发出蜂鸣声。此操作可排出针内大部分矿物油，仅保留少量油作为两种液体之间的屏障，同时去除气泡。
    5. 将玻璃针尖插入含有已制备颗粒的微量离心管中，用荧光颗粒或 pH 敏感颗粒填充针头。
    6. 按住“FILL”键直至注射器发出蜂鸣声。
  3. 注射操作
    1. 将待注射的果蝇转移至空瓶中。通过将瓶子置于冰上使果蝇麻醉固定。也可使用 CO2 麻醉果蝇。但需注意，当使用 pH 敏感颗粒时，升高的 CO2 水平可能人为酸化所用缓冲液，并增强背景荧光。
    2. 在果蝇胸部的胸侧板区域进行注射（图 1A）。若观察到绿色染料进入果蝇体内，则表明注射成功（图 1B）。如果果蝇未变绿，请检查针头是否堵塞。
      注意：也可选择在腹部注射果蝇，但在所有实验中应保持注射部位一致。
    3. 将注射后的果蝇放入新的食物培养瓶中，并记录第一只和最后一只果蝇的注射时间。为尽量减少因完成注射所需时间不同而带来的实验误差，应尽快完成注射操作。经过练习后，注射一组果蝇不应超过 10 分钟。将培养瓶横放，直至所有果蝇恢复活动，以防止果蝇陷入食物中。
    4. 根据实验条件，让果蝇恢复 60–90 分钟。本实验采用 60 分钟恢复时间。需注意，该恢复时间范围在 Horn 等人的研究中被证明在其实验条件下最适合计数吞噬事件17。但在某些情况下，此时间可能过长，不利于检测处理组间吞噬作用的细微差异。建议参考先前的研究方法17开展时间进程实验，以确定能够最大程度揭示对照组与实验组结果差异的恢复时间。无论选择何种恢复时间，均应在所有实验处理组中保持一致。
    5. 若在同一天使用荧光颗粒和 pH 敏感颗粒进行注射，每种溶液应使用新的针头。若两种颗粒均发红色荧光，则不得对同一只果蝇同时注射两种颗粒，否则无法区分吞噬作用的两个阶段：颗粒结合/吞噬与颗粒进入吞噬体。

4. 解剖背血管

  1. 果蝇恢复60-90分钟后，将所有存活的果蝇转移至一个空的培养管中，并在冰上固定。
  2. 一次将一只果蝇转移至硅胶弹性体解剖板上。
    注意：如果在室温下固化，解剖板应至少提前1周制备。具体操作为：制备弹性体后，倒入直径33 mm、高10 mm的培养皿中，填充至约一半高度。轻轻敲击培养皿底部以减少气泡。将培养皿在室温下静置，至少一周内不要扰动。
    1. 在解剖体视显微镜下，将果蝇腹面朝上放置。
    2. 使用昆虫针，将果蝇固定在解剖板上：一根针穿过胸部，另一根针穿过腹部最末端靠近生殖器的位置（图2A）。为避免妨碍后续解剖操作，建议在固定前将昆虫针剪短。每块解剖板最多可固定10只果蝇。
      注意：可选步骤：在将果蝇固定于板上前，去除翅膀和腿。这有助于防止加入培养液后在果蝇周围形成气泡。
    3. 当所有果蝇均被固定在板上后，使用移液管加入足够的解剖液以完全覆盖果蝇（约1 mL）。
    4. 使用镊子或角质层剪刀，移除果蝇头部。
    5. 使用角质层剪刀进行两处水平切口：一处位于腹部后端固定针的正上方，另一处位于腹部最前端，即胸部与腹部交界处（图2B, C）。在图2中，头部保持完整以明确方位。
    6. 进行一条垂直切口，连接上述两条水平切口（三条切口形似字母“I”），以打开腹腔（图2D）。
    7. 使用镊子小心移除内部器官和组织，注意避开背血管。若未受干扰，透明的背血管通常可在腹部前端附近观察到搏动。可使用额外的昆虫针将新切开的角质层边缘固定展开（图2E, F）。
    8. 使用角质层剪刀移除胸部。或者，也可在将解剖后的角质层和背血管置于显微镜载玻片上前再移除胸部。
    9. 对剩余果蝇重复上述操作。 应尽快完成果蝇解剖，以尽量减少吞噬速率可能产生的变异。所有果蝇解剖完成后，将带有附着背血管的角质层继续固定在解剖板上。第5步的所有操作均在解剖板中进行，以防止在步骤间损伤或意外丢弃角质层。

5. 固定与染色

  1. 用4%多聚甲醛（PFA）固定附有背血管的解剖后体壁。
    1. 每步操作均使用新的一次性移液管，弃去解剖液，加入1 mL 4% PFA。在整个固定和染色过程中，应尽可能避免样品暴露于光线下。
    2. 室温下以20 rpm振荡孵育15分钟。固定时间不得超过20分钟，以免开始损伤组织。
  2. 用1× PBS + 0.1% Tween（PBST）洗涤体壁2次。
    1. 去除固定液，加入1 mL 1× PBST。
    2. 室温下振荡洗涤15分钟。
    3. 重复1次。
      注意：解剖并固定后的组织可在第一次洗涤后用新鲜PBST替代洗涤液，于4 °C避光保存，最长可保存3天。若需使用抗体，则不应保存固定组织。为获得最佳结果，抗体染色应使用新鲜组织。
  3. 可选步骤：抗体染色。可使用抗体清晰显示背血管（图3），或检测血细胞特异性标记物。此步骤可确保仅计数沿背血管分布的细胞，或标记血细胞的细胞膜。
    1. 去除第二次洗涤液，加入适当稀释倍数的一抗，于4 °C振荡过夜孵育。
    2. 弃去一抗，用PBST振荡洗涤2次，每次15分钟。
    3. 加入荧光二抗。建议使用绿色荧光抗体，以避免遮蔽荧光颗粒。室温下振荡孵育2小时。
    4. 弃去二抗，用PBST洗涤2次，每次15分钟。
  4. DAPI染色。
    1. 去除最后一次洗涤液，加入1 mL用PBST稀释的DAPI（1:1000）。
    2. 室温下振荡染色20分钟。
    3. 去除DAPI，用PBST洗涤2次（重复步骤5.2）。
    4. 将最后一次洗涤液替换为新鲜的1× PBST。
      注意：果蝇样品可在第一次洗涤后用新鲜PBST替代洗涤液，于4 °C避光保存，最长可保存3天。

6. 将表皮组织固定到显微镜载玻片上并进行成像

  1. 准备解剖好的表皮。
    1. 在解剖体视显微镜下，剪除可能干扰成像的多余表皮。
    2. 使用镊子将带有背血管的表皮转移至含有70%甘油的1.5 mL微量离心管中。将表皮置于甘油中有助于去除PBST，并在成像时获得更清晰的图像。
  2. 将表皮固定在显微镜载玻片上。
    1. 在显微镜载玻片上滴加数滴70%甘油。
    2. 用镊子从甘油管中取出表皮，并将其放置在载玻片的甘油中。
    3. 在解剖体视显微镜下，使用镊子将表皮腹面朝上摆放，确保背血管可见。表皮颜色较深的色素面应朝下。
    4. 如有需要，可再添加一滴甘油，以防止产生气泡并获得更清晰的图像。
    5. 轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘。静置10–15分钟使其干燥后再进行后续操作。应立即成像，或将样本存放在4 °C的避光盒中。
  3. 成像背血管。
    1. 使用荧光显微镜，通过结构干涉系统对背血管进行光学切片。也可选用共聚焦显微镜，可能提供更高的精确度。使用20倍物镜和合适的成像软件获取背血管的Z轴层扫图像。添加10 mm比例尺，并正确标注后将图像保存为tiff文件（图4）或其他所需格式。
      注意：Z轴层扫图像的数量因解剖样本而异，取决于背血管解剖的质量以及设定的图像步进间距。此处设定的步进间距为0.49 mm。根据经验，每组Z轴图像的数量可在3至40张之间变化。

7. 分析图像

  1. 使用 ImageJ 量化荧光事件。
    1. 打开图像并将其堆叠：图像 → 堆栈 → 图像到堆栈。
    2. 仅对每只果蝇至少10个细胞中、以DAPI阳性细胞核为中心、直径10 mm范围内大小约为1 mm的荧光信号进行计数，每种颗粒类型在每个年龄组至少检测10只果蝇：点击 插件 → 分析 → 细胞计数器提示（图5A）。细胞计数器提示工具会为每个被追踪的细胞分配不同颜色，并在该细胞内每点击一个荧光事件时显示对应颜色的圆点。
    3. 要列出与每个点相关的计数器和堆栈位置，可按“m”键，或在 分析 选项卡下选择 测量；若要在结果表格中显示每个细胞中计数的事件数量，请按“alt + y”（图5B）。
    4. 将细胞计数数据导入电子表格，用于统计分析。
  2. 进行统计分析。
    1. 使用固定效应方差分析（ANOVA）或混合模型嵌套方差分析来分析吞噬事件的差异。混合模型可用于检验年龄和基因型的主固定效应，以及嵌套于各基因型内的个体的随机效应17。
      注意：研究人员在检验所用统计方法的假设条件时应保持严谨。

结果

为了说明所述的注射方法，图1A展示了在Drosophila melanogaster上的注射位点，以及食物染料如何实现对果蝇是否已被注射的可视化确认（图1B）。添加食物染料还有助于识别针头是否堵塞。注射可在腹部进行，但在各次实验中应保持注射位点一致，以尽量减少每次实验之间的可能差异。

为了观察沿背血管分布的常驻血细胞内荧光标记的颗粒，我们解剖了背血管及附着的腹部表皮。图2A-F 展示了该解剖方法。

为了评估年轻和年老果蝇在不同年龄阶段的吞噬能力，利用荧光显微镜观察 dorsal vessel（背血管）沿线的血细胞。为确保仅计数沿背血管分布的细胞，可使用针对特定血细胞标记物或心脏特异性胶原蛋白（如 Hemese 和 Hemolectin）的抗体或 GFP 标记基因, 或心肌蛋白（Pericardin）图3），分别可用于22,23,24荧光标记的 E. coli 颗粒的长度为1 mm，而血细胞的直径为10 mm17仅计数位于DAPI阳性细胞核中心10 mm直径范围内的荧光事件（图4）。为了定量荧光事件，使用 ImageJ 软件（图5).

果蝇解剖与GFP表达；显微镜图像；遗传学研究。
图1：注射位点与可视化验证。（A）使用拉制毛细玻璃针穿刺胸部侧面。（B）通过在颗粒溶液中添加绿色食用染料以进行注射过程的视觉验证。请点击此处查看该图的放大版本。

果蝇解剖、显微镜图像，展示使用标记物进行遗传分析的逐步过程。
图 2：背血管解剖过程。（A）在胸部和腹部后端插入大头针（黑色箭头所示）。（B-C）在腹部后端（B）和前端（C）分别做两条横向切口（绿色箭头所示）。（D）沿腹部中线做一条纵向切口（绿色箭头所示），连接两条横向切口。（E）可选择使用额外的大头针（*）将腹腔剖开，以暴露内部组织。（F）移除内部组织（嗉囊、肠道、子宫、卵巢、脂肪体），暴露背血管。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光显微镜下神经网络活动的显微图像，突出显示神经通路。
图3：注射了pH敏感颗粒并用抗Pericardin抗体染色的5周龄雌性个体解剖后的背血管腹面视图 (A). 白色虚线标出背血管外侧边缘，箭头指向头端区域。B) 放大的图像 (A）：背血管第一主动脉腔内正在积极降解细菌的血细胞簇（蓝色箭头）。C) （放大图像A）示意图显示细胞外基质（ECM）中类胶原蛋白Pericardin（绿色箭头），该蛋白将背血管固定在原位24. 请点击此处以查看此图的放大版本。

荧光显微镜；红色和蓝色染色；细胞结构；10 µm 比例尺；示意图；分析。
图4：来自注射了pH敏感性颗粒或荧光颗粒的雌性果蝇的解剖背血管及相关的血细胞。（A）背血管及相关的血细胞，其中吞噬了pH敏感性标记的E. coli颗粒（红色），或（E）荧光标记的E. coli颗粒（红色），样本取自恢复60分钟后的一周龄果蝇。（B, F）分别为（A）和（E）中白色框区域的放大图，显示两个独立的血细胞及其可计数的吞噬事件。（C）背血管及相关的血细胞，其中吞噬了pH敏感性标记的E. coli颗粒（红色），或（G）荧光标记的E. coli颗粒（红色），样本取自恢复60分钟后的五周龄果蝇。（D, H）分别为（C）和（G）中白色框区域的放大图，显示两个独立的血细胞及其可计数的吞噬事件。白色虚线勾勒出背血管的侧面轮廓，箭头指向前端区域。细胞核用DAPI染色（蓝色）。请点击此处查看该图的高清版本。

显示细胞分割与分析的荧光显微镜图像；ImageJ插件的使用。
图5：使用ImageJ中的细胞计数器定量10 mm 血细胞中的吞噬事件。（A）在ImageJ中打开图像后，可使用“细胞计数器提示”工具记录每个细胞的吞噬事件数量。（B）该工具会为每个被选中计数的细胞分配不同颜色，每个点代表该细胞内的一个荧光事件。按下“alt+y”将显示一个表格，列出每个细胞所计数的事件数量。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方案是在受控实验条件下定量分析吞噬作用不同方面的可靠方法。需要注意的是，我们仅使用革兰氏阴性细菌颗粒测试过该实验流程，若改用革兰氏阳性细菌颗粒，结果可能会有所不同。事实上，在不同实验条件下比较对革兰氏阴性与革兰氏阳性细菌的吞噬反应将具有重要意义。使用纳米注射仪可精确控制注射体积，确保每只果蝇注射的颗粒体积相同。该方案的一个局限性在于颗粒制备过程中的不一致性。颗粒在冷冻后容易发生聚集，因此稀释体积的微小差异或未充分涡旋混匀均可能导致不同实验间颗粒浓度的变化。为尽量减少不同年龄组间颗粒浓度的可能差异，建议在同一天使用同一根针头和同一份颗粒溶液对1周龄和5周龄果蝇进行注射。另一个潜在缺点是，在解剖过程中，若大头针操作不当，背血管和/或体壁可能容易受损。为避免损伤背血管，应尽量减少每次解剖所使用的大头针数量。该解剖方法的优点在于所有固定、洗涤和染色步骤均可在解剖板中完成。由于体壁被大头针固定，可防止样品在各步骤之间丢失。

与现有方法相比18,19,25,26,27,28,29所述方案具有其优势与局限性。通过解剖背血管，我们能够在此位置直接观察并定量单个血细胞，从而检测不同实验组之间吞噬活性的细微差异。其他方法则通过采集血细胞并观察荧光标记颗粒来实现可视化 划痕/刮除实验19,25,26,27，或通过完整的腹侧角质层18,19,28,29；然而，通过背表皮观察时无法对单个血细胞进行评估。与传统方法相比，本方案的优势在于 放血/刮取 该方法的优势在于，我们能够特异性地评估与背血管相关联的血细胞，而不会将循环中的血细胞或体壁附近的血细胞纳入分析，这些细胞在功能上可能存在差异。此外，通过解剖分离背血管，可避免额外进行第二轮注射荧光淬灭剂（如台盼蓝）的步骤。19,26这是因为未与细胞结合或未被细胞吞噬的颗粒会在洗涤步骤中被洗去。相反，某些替代方法可能更容易操作，因为它们不需要进行解剖。尽管背血管的解剖易于掌握，但该步骤增加了实验复杂性，在某些实验设计中可能并不可行。

尽管本体内吞噬作用检测方法的描述用途是评估和量化不同年龄之间的吞噬事件，但该方案具有高度的可适应性，也可用于分析不同基因型、性别或组织类型之间的吞噬作用的各个方面。由于吞噬作用对大多数多细胞动物至关重要，了解这一过程如何随年龄增长而衰退，可能为老年人群带来更有效的治疗方案。该方法在阐明免疫应答中与年龄相关的变化方面具有长期潜力，尤其聚焦于吞噬作用。 

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院 R03 AG061484-02 项目资助以及马里兰大学巴尔的摩县分校自然科学与数学学院贝克顿·迪金森教员研究基金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.10 mm 昆虫针Fine Science Tools26002-10此处：将针剪成两半，使用尖端部分
1 mL 无菌注射器Becton Dickinson309602装入矿物油以填充针头
15% 胎牛血清（FBS）Gibco16000-044用于解剖培养基
16% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710电镜级，工作浓度为 4%，用 1× PBS 稀释
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP3813
3 mL 转移吸管Falcon357524
3.5" 玻璃毛细管Drummond3-000-203-G/X外径 1.14 mm，长度 3.5"，内径 0.53"
35×10 mm 培养皿Becton Dickinson351008用作解剖板，半满填充 Sylgard
6× 青霉素/链霉素Life Technologies15140-122用于解剖培养基
70% 甘油SigmaG9012
模拟旋涡混合器VWR58816-121
生物用尖头镊子，Dumont No. 5Fine Science Tools11295-10
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）Life TechnologiesD1306用 1× PBST 按 1:1000 稀释
果蝇品系w[*]; P{w[+mC]=He-GAL4.Z}85, P{w[+mC]=UAS-GFP.nls}8
大肠杆菌（K-12 菌株）BioParticles™，Alexa Fluor™ 594 标记物Life TechnologiesE23370
载玻片PremiereD17026102
活细胞成像溶液Life TechnologiesA14291DJ推荐用于颗粒制备和稀释的缓冲液
矿物油Mpbio194836
Nanoject II 自动纳升级注射仪Drummond3-000-204
窄型聚苯乙烯大容量果蝇培养管Genesee32-116SB尺寸：25 × 95 mm
旋转混合器Fisher Scientific88-861-043使用速度：20 rpm
pHrodo™ Red 大肠杆菌 BioParticles™ 吞噬作用标记物Life TechnologiesP35361
Schneider's 果蝇细胞培养基（1×）Gibco21720-024解剖培养基，混合：Schneider's 培养基、FBS 和青霉素/链霉素；过滤除菌
叠氮化钠Sigma-AldrichS2002工作浓度 2 mM（或 20%）
弹簧剪Fine Science Tools15000-00
Sylgard 184 硅橡胶弹性体Electron Microscopy Sciences24236-10按照提供的方案制备
Tween 20SigmaP1379用于配制含 0.1% Tween 的 PBS
垂直移液器拉制仪 700C 型David Kopf Instruments812368加热器：55？电磁阀：45
Zeiss AxioImager.Z1 荧光显微镜Zeiss此处：配备 Apotome 结构干涉系统和 Zeiss Zen 成像软件

参考文献

  1. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in ageing animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  2. DeVeale, B., Brummel, T., Seroude, L. Immunity and aging: the enemy within. Aging Cell. 3 (4), 195-208 (2004).
  3. Gomez, C. R., Nomellini, V., Faunce, D. E., Kovacs, E. J. Innate immunity and aging. Experimental Gerontology. 43 (8), 718-728 (2008).
  4. Panda, A., et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends in Immunology. 30 (7), 325-333 (2009).
  5. Aw, D., Silva, A. B., Palmer, D. B. Immunosenescence: emerging challenges for an ageing population. Immunology. 120 (4), 435-446 (2007).
  6. Min, K. -J., Tatar, M. Unraveling the molecular mechanism of immunosenescence in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), 2472(2018).
  7. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  8. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: a primer on the Drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  9. Banerjee, U., Girard, J. R., Goins, L. M., Spratford, C. M. Drosophila as a genetic model for hematopoiesis. Genetics. 211 (2), 367-417 (2019).
  10. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. B. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416 (6881), 644-648 (2002).
  11. Garschall, K., Flatt, T. The interplay between immunity and aging in Drosophila. F1000Research. 7, (2018).
  12. Brennan, C. A., Anderson, K. V. Drosophila: The genetics of innate immune recognition and response. Annual Review of Immunology. 22 (1), 457-483 (2004).
  13. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: a fundamental process in immunity. BioMed Research International. 9042851, Research article (2017).
  14. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (10), 781-795 (2008).
  15. Stuart, L., et al. A systems biology analysis of the Drosophila phagosome. Nature. 445 (7123), 95-101 (2007).
  16. Mackenzie, D. K., Bussière, L. F., Tinsley, M. C. Senescence of the cellular immune response in Drosophila melanogaster. Experimental Gerontology. 46 (11), 853-859 (2011).
  17. Horn, L., Leips, J., Starz-Gaiano, M. Phagocytic ability declines with age in adult Drosophila hemocytes. Aging Cell. 13 (4), 719-728 (2014).
  18. Elrod-Erickson, M., Mishra, S., Schneider, D. Interactions between the cellular and humoral immune responses in Drosophila. Current Biology. 10 (13), 781-784 (2000).
  19. Garg, A., Wu, L. P. Drosophila Rab14 mediates phagocytosis in the immune response to Staphylococcus aureus. Cellular Microbiology. 16 (2), 296-310 (2014).
  20. Bloomington Drosophila Stock Center: Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/innformation/recipes/molassesfood.html (2019).
  21. Fellous, S., Lazzaro, B. P. Larval food quality affects adult (but not larval) immune gene expression independent of effects on general condition. Molecular Ecology. 19 (7), 1462-1468 (2010).
  22. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  23. Goto, A., et al. A Drosophila haemocyte-specific protein, hemolectin, similar to human von Willebrand factor. Biochemical Journal. 359, Pt 1 99-108 (2001).
  24. Cevik, D., Acker, M., Michalski, C., Jacobs, J. R. Pericardin, a Drosophila collagen, facilitates accumulation of hemocytes at the heart. Developmental Biology. 454 (1), 52-65 (2019).
  25. Ghosh, S., Mandal, S., Mandal, L. Detecting proliferation of adult hemocytes in Drosophila by BrdU incorporation and PH3 expression in response to bacterial infection. Wellcome Open Research. 3, (2018).
  26. Hao, Y., Yu, S., Luo, F., Jin, L. H. Jumu is required for circulating hemocyte differentiation and phagocytosis in Drosophila. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 95(2018).
  27. Petraki, S., Alexander, B., Brückner, K. Assaying blood cell populations of the Drosophila melanogaster larva. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
  28. Gyoergy, A., et al. Tools allowing independent visualization and genetic manipulation of Drosophila melanogaster macrophages and surrounding Tissues. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (3), 845-857 (2018).
  29. Bosch, P. S., et al. Blood cells of adult Drosophila do not expand, but control survival after bacterial infection by induction of Drosocin around their reservoir at the respiratory epithelia. BioRxiv. 578864, (2019).

重印与许可

标签

果蝇血细胞活体成像血细胞分离荧光成像ImageJ 分析抗体染色解剖方案年龄相关免疫细胞免疫
评估成人不同年龄段的吞噬能力 黑腹果蝇 使用体内吞噬作用检测法研究血细胞
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。