本文介绍了一种利用基于荧光素酶的生长检测方法评估化学化合物对体外弓形虫（Toxoplasma gondii）细胞内生长抑制效果的实验方案。该技术通过相应靶基因的遗传敲除来验证抑制作用的特异性。以LHVS对TgCPL蛋白酶的抑制作用为例进行了评估。
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方法文章
基于荧光素酶的生长检测法测定化学抑制剂对细胞内Toxoplasma gondii生长的抑制效率
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Toxoplasma gondii 是一种广泛影响人类的原虫病原体。目前用于治疗临床弓形虫病的抗生素种类有限，且在某些人群中会产生不良副作用。因此，发现治疗临床弓形虫病的新型药物势在必行。开发新型抗生素的第一步是采用高通量筛选策略，鉴定出对抑制寄生虫生长具有高效活性的化学化合物。由于Toxoplasma是一种专性胞内寄生虫，只能在宿主细胞内复制，因此无法使用光吸收度测量作为快速评估其生长的指标。本文介绍了一种基于荧光素酶的生长检测方法的详细实验方案。作为示例，该方法用于计算野生型Toxoplasma寄生虫的倍增时间，并评估吗啉脲-亮氨酰-高苯丙氨酰-乙烯基砜苯（LHVS，一种靶向半胱氨酸蛋白酶的化合物）对寄生虫胞内生长的抑制效果。此外，还描述了一种基于CRISPR-Cas9技术、利用50 bp同源序列介导同源依赖性重组（HDR）的Toxoplasma基因敲除实验方案。通过定量比较LHVS在野生型和TgCPL（Toxoplasma类组织蛋白酶L样蛋白酶）缺失型寄生虫中的抑制效果，发现LHVS对野生型寄生虫生长的抑制效率高于对Δcpl寄生虫的抑制，表明TgCPL是LHVS在Toxoplasma中作用的靶点。该基于荧光素酶的生长检测方法具有高灵敏度和操作简便的优点，适用于以高通量方式监测Toxoplasma的增殖及评估药物疗效。
引言
Toxoplasma gondii 是一种高度成功的专性胞内寄生虫，感染了约三分之一的人类人口。其高传播率主要归因于多种传播途径，包括食用未煮熟的肉类、接触哺乳动物宿主以及出生时的先天性传播。T. gondii 主要引起机会性感染，可在免疫功能低下个体中导致严重的发病率和死亡率1,2,3,4,5,6。目前用于治疗急性弓形虫病的抗生素在治疗先天性和潜伏性感染方面效率低下，并且在部分个体中会引起严重不良反应3,7,8。因此，迫切需要发现新的治疗方法。了解Toxoplasma及其宿主之间亚细胞过程的差异，将有助于识别潜在的药物靶点。因此，需要高效且便捷的基因组操作技术，以研究单个基因在Toxoplasma中的功能。此外，Toxoplasma属于顶复门（Apicomplexa....
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方案
弓形虫（Toxoplasma gondii）被归类为生物安全二级风险组（Risk Group 2），必须在生物安全二级（BSL-2）条件下操作。本方案已通过克莱姆森大学机构生物安全委员会的审查和批准。
1. 基于荧光素酶的Toxoplasma生长检测
- 在接种寄生虫前1周接种人包皮成纤维细胞（HFFs），以确保宿主细胞完全汇合。在透明板中进行模拟实验，以确保在整个评估期间寄生虫保持在细胞内。
注意：此处实验在96孔微孔板中进行。根据实验需求，可扩展至384或1536孔微孔板。 - 在使用前2天，将Toxoplasma寄生虫传代至汇合的HFFs中，方法是将约0.3–0.4 mL完全裂解的寄生虫转移至T25培养瓶中。将感染的宿主细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育2天。
- 用5 mL新鲜裂解的寄生虫通过21 G安全针头反复吹打5次以释放细胞内寄生虫，然后通过3 µm滤器去除宿主细胞碎片。用7 mL无酚红D10培养基冲洗培养瓶中残留的寄生虫，再次通过滤器过滤。
- 在室温（RT）下以1000 × g离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL无酚红D10培养基中。
- 使用血细胞计数板计数寄生虫，以确定其浓度。
- 将野生型（WT）株寄生虫稀释至1 × 104....
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结果
图1展示了RHΔku80::NLuc株生长曲线的一个示例及其倍增时间的相应计算方法。通常，该实验对三个生物学重复中的每一个均进行三个技术重复，以消除荧光素酶活性读数的变异。为了计算寄生虫生长的归一化倍数变化，将感染后24–96 h的每次读数除以感染后4 h的初始读数，后者反映了实验中活寄生虫的起始数量（图1A,B）。在确定寄生虫倍增时间时，将寄生虫生长归一化倍数变化的log₂值对各个时间点作图。随后，对该图进行线性回归分析以获得斜率，该斜率即代表倍增时间（图1C）。
LHVS 在野生型和 Δcpl 菌株中的抑制效果通过在
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讨论
++本方案描述了一种基于荧光素酶的方法，用于评估细胞内Toxoplasma的生长情况，并检测化学化合物对寄生虫生长的抑制效果。与现有的用于测量细胞内Toxoplasma生长的策略相比，该方法具有高灵敏度和高特异性。在监测寄生虫生长的同时，建议在透明的96孔微孔板中进行模拟实验，以确认所测试的菌株不会在评估期结束前过早裂解宿主细胞。否则，由于Toxoplasma仅在宿主细胞内复制，发光读数将无法准确反映寄生虫的生长情况。
已观察到酚红染料会迅速淬灭荧光素酶活性，由于酶标仪对各个孔的检测存在时间延迟，这可能导致技术重复样本之间的荧光素酶读数出现显著差异。因此，在将人包皮成纤维细胞（HFFs）接种至96孔微孔板之前，最好将其培养在不含酚红的培养基中。此外，在荧光素酶活性较高的情况下，相邻孔之间可能发生信号干扰，导致表现出强荧光素酶活性的邻近孔之间出现显著变异。因此，建议在每种菌株之间留出一个空列。
对于 RHΔku80::NLuc 菌株，生长实.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Sibley 博士和 Carruthers 博士分享 pSAG1-Cas9-sgRNA-TgUPRT 质粒以及抗 TgCPL 和 TgActin 抗体。本研究由克莱姆森大学启动资金（资助 Z.D.）、圣殿骑士眼科基金会儿科眼科学职业启动研究基金（资助 Z.D.）、美国国立卫生研究院 COBRE 项目 P20GM109094 的试点资助（资助 Z.D.）以及美国国立卫生研究院 R01AI143707 项目（资助 Z.D.）支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖凝胶回收试剂盒 | New England BioLabs | T1020L | |
| BamHI | New England BioLabs | R0316S | |
| Biotek Synergy H1 多功能微孔板读板仪 | BioTek Instruments | ||
| BTX Gemini 双波形电穿孔系统 | Harvard Apparatus | ||
| 化学感受态 E. coli 细胞 | New England BioLabs | C29871 | |
| CloneAmp HiFi PCR 预混液 | Takara Bio | 639298 | |
| 腔肠素 h | Prolume | 301-10 hCTZ | |
| EcoRV | New England BioLabs | R3195S | |
| Phire 组织直接 PCR 预混液 | Thermo Scientific | F170L | |
| 质粒小提试剂盒 | Zymo Research | D4054 | |
| Q5 定点突变试剂盒 | New England BioLabs | E0554S | |
| 软件 | |||
| 用于 sgRNA 设计的 Geneious 软件（版本：R11） | |||
| GraphPad Prism 软件（第 8th 版） | |||
| 用于分子克隆的 SnapGene 软件（版本：4.2.11） |
参考文献
- Blader, I. J., Coleman, B. I., Chen, C. T., Gubbels, M. J. Lytic Cycle of Toxoplasma gondii: 15 Years Later. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 1-23 (2014).
- Jones, J. L., Kruszon-Moran, D., Rivera, H., Price, C., Wilkins, P. P.
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重印与许可
