我们提供了一种免费的工作流程，专为快速探索和精确分析荧光显微镜图像中特定细胞区室内的细胞结构而设计。该用户友好的工作流程基于开源软件 Icy 构建，同时利用了 ImageJ 的功能。此分析流程无需图像分析专业知识即可使用。
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摘要
摘要
过去十年见证了荧光显微技术的突破性进展，不仅体现在空间分辨率的提升，还包括活细胞成像和高通量显微技术的发展。这导致单个实验所产生的显微图像数据在数量和复杂性上持续增加。由于显微图像数据的手动分析极为耗时、具有主观性，并且难以实现定量分析，因此生物图像分析的自动化正变得几乎不可避免。我们构建了一个名为 Substructure Analyzer 的信息学工作流程，用于完全自动化荧光显微图像中的信号分析。该工作流程基于用户友好的开源平台 Icy 开发，并整合了 ImageJ 的功能模块。其包括图像预处理以提高信噪比、单个细胞的分割（细胞边界的检测），以及对富集于特定细胞区室中的细胞结构的检测与定量。该工作流程的主要优势在于，通过友好的用户界面，使不具备图像分析专业知识的研究人员也能使用复杂的生物成像分析功能。此外，该流程具有高度模块化特性，可适用于多种研究需求，从核质转位的表征到不同细胞亚结构中各类细胞结构的比较分析均可适用。本工作流程的功能通过在氧化应激（OS）条件下对卡哈尔（盘绕）小体的研究得以展示。荧光显微结果显示，在人类细胞中，OS 诱导数小时后，卡哈尔小体的完整性即受到显著影响。这一效应表现为盘绕蛋白（coilin）在典型卡哈尔小体中的成核减少，同时伴随盘绕蛋白在核质中重新分布，形成数量增多但体积更小的焦点结构。鉴于盘绕蛋白在卡哈尔小体组分与周围核质之间物质交换中的核心作用，OS 所引发的盘绕蛋白重分布可能影响卡哈尔小体的组成及其功能。
引言
光学显微镜，尤其是荧光显微镜，是生物科学中常用的强大且多用途的技术。通过特异性的荧光标记，这些技术能够实现对蛋白质或RNA等多种生物分子的精确定位。过去十年间，显微镜与成像技术迅速发展，2014年诺贝尔化学奖授予埃里克·贝齐格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）和威廉·E·莫纳（William E. Moerner），以表彰他们在超分辨荧光显微镜（SRFM）1发展中的贡献。超分辨荧光显微镜突破了传统光学显微镜的衍射极限，使其达到纳米尺度。此外，活体成像和高通量筛选等技术的进步也显著增加了每次实验所需处理的数据量和复杂性。大多数情况下，研究人员面对的是高度异质性的细胞群体，并希望在单细胞水平上分析表型特征。
最初，诸如焦点计数之类的分析是通过肉眼进行的，一些研究人员认为这种方法更优，因为它能够对计数过程实现完全的视觉控制。然而，此类数据的手动分析耗时过长，不同观察者之间易产生差异，并且无法获取更复杂的特征信息，因此基于计算机辅助的分析方法正被广泛采用并几乎成为必然选择2。生物图像信息学方法显著提高了数据分析效率，且避免了人工计数分析中不可避免的操作者主观性和潜在偏差。该领域日益增长的需求以及计算机性能的提升，促使大量图像分析平台得以开发。其中一些工具可免费获取，使用户能够利用个人计算机进行多种分析操作。近期已建立了一种针对开放获取工具的分类体系....
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方案
注意：Icy 网站上提供易于使用的教程，网址为 http://icy.bioimageanalysis.org。
1. 下载 Icy 软件和 Substructure Analyzer 协议
- 从 Icy 官方网站（http://icy.bioimageanalysis.org/download）下载 Icy，并下载 Substructure Analyzer 协议：http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest。
注意：如果使用 64 位操作系统，请务必使用 64 位版本的 Java。该版本允许增加分配给 Icy 的内存（首选项 | 常规 | 最大内存）。
2. 打开实验方案
- 打开 Icy 软件，点击 功能区 菜单中的 工具。
- 点击 协议 以打开 协议编辑器<....
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结果
所有描述的分析均在一台标准笔记本电脑（64 位，2.80 GHz 四核处理器，16 GB 随机存取存储器（RAM））上完成，该电脑运行 64 位版本的 Java。随机存取存储器是需要考虑的重要参数，具体取决于待分析图像的数量和分辨率。使用 32 位版本的 Java 会将内存限制在约 1300 MB，这可能不适用于大数据分析，而 64 位版本则允许增加分配给 Icy 的内存。图 3 显示了对不同类型图像和不同分辨率进行分割所需的时间。结果证实，高分辨率会显著增加初级目标分割所需的时间。
下文展示的数据表明，Substructure Analyzer 工作流程可用于解决细胞和分子生物学中遇到的大多数常见问题（细胞计数、焦点计数与分析、转位分析）。
在大量细胞中测量特定区室内的分子精确比例，或亚细胞区域间定位变化，可能是一项非常繁琐且易出错的任务，尤其是当手动操作时。图4展示了该工作流程快速而精确.......
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讨论
目前有越来越多的免费软件工具可用于荧光细胞图像的分析。用户必须根据自身研究问题的复杂程度、图像处理知识水平以及愿意在分析上投入的时间，正确选择合适的软件。Icy、CellProfiler 或 ImageJ/Fiji 均为兼具易用性与功能性的强大工具3。Icy 是一款独立运行的软件，具有清晰的图形用户界面（GUI），其“Protocols”模块提供点击式操作界面，可方便地设计或调整工作流程4。该软件支持并可调用 ImageJ 插件，进一步增强了其功能，同时得益于庞大的用户社区，提供了丰富的文档资源。我们利用 Icy 软件在易用性与功能性方面的优势，开发了 Substructure Analyzer 工作流程。其主要目标是提供一种自动化解决方案，用于对多幅图像中的细胞荧光信号进行完整分析。该分析过程包括图像预处理、目标分割以及荧光信号分析。
Icy 网站上分享了多个协议，建议使用 Icy 功能来检测和分析荧光信号（如细胞焦点）。然而，其中一些协议每次运行仅处理一幅图像，未将.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
G.H. 获得了法国研究与技术部研究生奖学金的资助。L.H. 获得了洛林癌症研究所（ICL）研究生奖学金的资助，而 Q.T. 获得了法国国家研究署（ANR）监管的公共资助，该资助属于第二期“未来投资计划”FIGHT-HF 项目（项目编号：ANR-15-RHU4570004）。本研究由法国国家科学研究中心（CNRS）和洛林大学（UMR 7365）提供经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 甲醛溶液（w/v），无甲醇 | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 用于固定细胞 |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | 荧光二抗 |
| Alexa Fluor 555 标记的山羊抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-21425 | 荧光二抗 |
| Alexa Fluor 555 标记的鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A34055 | 荧光二抗 |
| 牛血清白蛋白标准品（BSA） | euromedex | 04-100-812-E | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796-500ml | 细胞培养基 |
| Duolink In Situ DAPI 封片剂 | Sigma-Aldrich | DUO82040-5ML | 封片剂 |
| 人：HeLa S3 细胞 | IGBMC, Strasbourg, France | 用于实验的细胞系 | |
| 30% 过氧化氢溶液（H2O2） | Sigma-Aldrich | H1009-100ml | 用作应激刺激剂 |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | 转染试剂 |
| 小鼠单克隆抗coilin抗体 | abcam | ab11822 | coilin特异性抗体 |
| Nikon Optiphot-2 荧光显微镜 | Nikon | 落射荧光显微镜 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | 转染培养基 |
| PBS pH 7.4 (10x) | gibco | 70011-036 | 用于洗涤细胞 |
| 兔多克隆抗53BP1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16565 | 53BP1特异性抗体 |
| 兔多克隆抗EDC4抗体 | Sigma-Aldrich | SAB4200114 | EDC4特异性抗体 |
| Triton X-100 | Roth | 6683 | 用于细胞通透处理 |
参考文献
- Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
- Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -C.
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重印与许可
