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方法文章

使用微流控室系统研究运动神经元培养中细胞器的轴突运输

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DOI：

10.3791/60993

⸱

2020年5月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Sagol School of Neuroscience, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制。在本方案中，我们提供了一种详细的方法，利用微流控小室对运动神经元轴突中酸性区室和线粒体的轴突运输进行示踪。

摘要

运动神经元（MNs）是具有极长轴突的高度极化细胞。轴突运输是维持运动神经元健康的关键机制，参与神经元的生长、发育和存活。本文详细介绍了一种利用微流控室（MFCs）追踪运动神经元轴突中荧光标记细胞器轴突运输的方法。该方法快速、相对经济，并可实现对细胞内信号在空间和时间上的动态监测。我们逐步阐述了以下操作流程：1）聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控室的制备；2）在微流控室内接种脊髓腹侧组织块及分离的运动神经元培养；3）线粒体和酸性区室的标记，随后进行活细胞共聚焦成像；4）手动及半自动化的轴突运输分析。最后，我们展示了HB9::GFP标记的脊髓腹侧组织块轴突中线粒体与酸性区室运输行为的差异，验证了该系统的有效性。总体而言，本实验方案为研究多种轴突组分的运输过程提供了高效工具，同时也为微流控室的使用提供了简明指南，有助于探索空间分辨的实验设计可能性。

引言

运动神经元（MNs）是高度极化的细胞，具有长长的轴突，在成年人体中可长达一米。这一特性给运动神经元连接性和功能的维持带来了严峻挑战。因此，运动神经元依赖于从胞体到突触再返回的轴突内信息、细胞器和物质的正常运输。多种细胞组分，如蛋白质、RNA和细胞器，会定期通过轴突进行转运。线粒体是运动神经元中常规运输的重要细胞器。线粒体对运动神经元的正常活动和功能至关重要，负责ATP供应、钙缓冲以及信号传导过程1,2。线粒体的轴突运输是一个被广泛研究的过程3,4。有趣的是，已有研究报道线粒体运输缺陷参与多种神经退行性疾病，特别是在运动神经元疾病中发挥重要作用5。酸性区室是沿运动神经元轴突移动的另一类内在细胞器。酸性区室包括溶酶体、内体、反式高尔基体以及某些分泌性囊泡6。酸性区室轴突运输的缺陷也在多种神经退行性疾病中被发现7，近期研究进一步强调了其在运动神经元疾病中的重要性8。

为了高效研究轴突运输，通常使用能够分离胞体与轴突区室的微流控装置9,10。微流控系统具备两个显著优势：区室化和轴突的分离，使其成为研究亚细胞过程的理想平台11。神经元胞体与轴突之间的空间分离可用于调控不同神经元区室（如轴突与胞体）的细胞外环境。生化分析、神经元生长/变性研究以及免疫荧光检测均可从该平台中获益。此外，通过将神经元与其他细胞类型（如骨骼肌细胞）共培养，微流控装置还可用于研究细胞间的相互作用12,13,14。

本文介绍了一种简单而精确的方案，用于监测运动神经元中线粒体和酸性区室的运输过程。我们进一步通过比较逆行和顺行运动细胞器的相对百分比，以及运输速度的分布，展示了该方法的应用。

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方案

本方案中动物的护理和处理均在特拉维夫大学动物伦理委员会的监督和批准下进行。

1. 微生物燃料电池的制备

  1. 在初级模具中浇铸 PDMS（图 1）
    1. 购买或按照详细方案制备初级模具（晶圆）9。
    2. 在进行涂覆步骤前，使用加压空气清除晶圆平台上的任何类型污物。晶圆表面应显得光滑且洁净。
    3. 用一个容器装入 50 mL 液氮。准备一支 10 mL 注射器和 23 G 针头。
      注意：从本步骤起的所有操作必须在化学通风橱中进行。
    4. 在化学通风橱中，使用注射器和针头吸取 2 mL 液氮。尽管看起来像是吸入了空气，但注射器内实际充满的是氮气（图 1A）。将含有晶圆的培养皿放入可密封的容器中。
    5. 旋开氯三甲基硅烷瓶盖，用装有氮气的注射器刺穿橡胶塞，将注射器中的全部内容物注入瓶中。不拔出针头，将瓶子倒置，回抽 2 mL 氯三甲基硅烷。
      注意：由于注射器内压力作用，少量氯三甲基硅烷会从针头喷出。为避免危险，请将针头指向通风橱内壁（图 1B）。
    6. 将氯三甲基硅烷均匀地分布在容器（来自步骤 1.1.4）中，但不要直接接触晶圆或含晶圆的培养皿。关闭容器，每片晶圆孵育 5 分钟。
      注意：如果这是首次对晶圆进行氯三甲基硅烷涂覆，应允许每片晶圆孵育 1 小时。
    7. 30 分钟内不得将晶圆和容器移出化学通风橱。
      警告：氯三甲基硅烷具有高度挥发性。
    8. 称取 PDMS 基体（见材料表）至 50 mL 管中，并按 16:1 的比例加入 PDMS 固化剂（例如，47.05 g 基体和 2.95 g 固化剂）。使用低速旋转仪混合 10 分钟。
    9. 将 PDMS 倒入每个含晶圆的培养皿中，至所需高度（图 1C）。
      注意：使用较薄的微流控腔室（厚度不超过 3–4 mm）可提高其与培养皿的粘附性，并防止泄漏。
    10. 将所有培养皿一起放入真空干燥器中处理 2 小时（图 1E）。此过程可去除 PDMS 内部截留的空气，从而消除气泡，形成透明、均匀的模具。
    11. 将培养皿置于烘箱中，在 70 °C 下加热 3 小时（或过夜）（图 1E）。
      注意：培养皿放入烘箱时应保持水平。
  2. 在环氧树脂模具中浇铸 PDMS
    注意：由于晶圆制备成本高、需要特殊设备，且可能损坏脆弱的晶圆，因此可以制作晶圆的环氧树脂复制品。这些复制品成本更低、更耐用，可用于微流控腔室的大规模生产。
    1. 将 PDMS 浇铸并固化（如步骤 1.1.8–1.1.11 所述）到原始晶圆中。
    2. 移除并切除 PDMS 的多余部分，仅保留用于加工成微流控腔室所需的微流控元件和功能区域。
    3. 立即用厚而粘性的胶带包裹 PDMS，以防止其积聚灰尘。
    4. 选择一个组织培养级塑料培养皿，使其能够容纳整个 PDMS，并在周围留有空间用于填充环氧树脂。PDMS 与塑料培养皿之间的距离应小于 5 mm。
    5. 准备少量 PDMS，按 10:1（基体：固化剂）的比例混合。新鲜的液态 PDMS 将用于将固态 PDMS 粘接到塑料培养皿底部。
    6. 在塑料培养皿底部中央涂抹极少量液态 PDMS，然后撕去 PDMS 上的粘性胶带，并将其粘附到塑料培养皿底部。确保微流控元件朝上。
    7. 将 PDMS 在 70 °C 烘箱中固化 30 分钟。
    8. 通过在试管中按 100:45 的比例混合环氧树脂基体和固化剂来配制环氧树脂。不同环氧树脂的混合比例可能不同。对于常规 100 mm 培养皿，所需体积约为 40 mL。
    9. 在旋转仪中混合环氧树脂 10 分钟，直至混合物明显均匀（即液体中无可见的纤维状杂质）。
    10. 将环氧树脂混合物在 400 × g 条件下离心 5 分钟，以去除其中夹带的气泡。
    11. 在离心过程中，沿培养皿壁及其他所有暴露的塑料部分涂布一层薄薄的硅脂。这可以防止环氧树脂与塑料培养皿发生聚合，从而在实验结束时便于取出固化的环氧树脂。
    12. 缓慢将环氧树脂倒入培养皿中，直至完全覆盖 PDMS 并超出至少 5 mm。保持移液管与培养皿之间零距离，以防止环氧树脂内部产生气泡。将培养皿放置在安全位置，确保其在接下来的 48 小时内不会移动。
    13. 48 小时后，环氧树脂应已完全固化。将培养皿放入预热至 80 °C 的烘箱中，再加热 3 小时以完成最终固化。
    14. 通过轻轻拉扯塑料培养皿的壁直至其破裂，从而将固化的环氧树脂从培养皿和原始 PDMS 模具上取下。此时环氧树脂应能轻松分离并剥离。
    15. 取出后，擦去新环氧树脂复制品上残留的油脂，并将其倒置（即复制的微流控元件朝上）嵌入新的培养皿中。该环氧树脂复制品现已准备好用于 PDMS 浇铸。
    16. 使用加压空气或 N2 吹除环氧模具上残留的 PDMS 或污物，并用异丙醇冲洗 2 次。第三次填充后，在轨道摇床上孵育 10 分钟。再用异丙醇冲洗 3 次，弃去剩余液体。用空气或 N2 吹干，或置于 70 °C 烘箱中干燥。
      注意：操作和废弃异丙醇时应遵循安全规程。
    17. 在浇铸前保持模具培养皿封闭。按照步骤 1.1.8–1.1.11 进行操作。
  3. 将 PDMS 打孔并雕刻成微流控腔室（MFC）（图 2）
    1. 使用手术刀沿晶圆上的 (+) 标记切割并从培养皿上取下 PDMS 模具。请勿用力，因为模具较为脆弱（图 2A）。
    2. 根据实验设置，按照示意图中的说明对腔室进行打孔和切割（图 2B–F）。
      1. 用于脊髓组织块培养（图 2C,E）：在大型 MFC 的远端打两个直径为 7 mm 的孔。定位时使这些孔与通道边缘重叠。在近端，于通道中央打一个直径为 7 mm 的孔，重叠部分应尽量小，以便为组织块留出足够空间。在近端通道的两个边缘再打两个直径为 1 mm 的小孔。将 MFC 翻转，使微流控元件朝上，使用 20 G 针头在已打的 7 mm 孔内雕刻三个小型组织块凹槽。
      2. 用于解离运动神经元（MN）培养（图 2D,F）：在小型 MFC 的两个通道边缘各打四个直径为 6 mm 的孔。
  4. 对 MFC 进行灭菌以用于组织培养
    1. 在实验台上铺设长度为 50 cm 的粘性胶带。按压并反向拉回腔室，使其两面（上下表面）均接触胶带，以去除粗大污物。将清洁后的腔室放入新的 15 cm 培养皿中。
      注意：当微流控元件朝上时，切勿直接按压其表面。
    2. 将腔室置于分析纯级 70% 乙醇中，在轨道摇床上孵育 10 分钟。
    3. 弃去乙醇，并在组织培养通风橱中或 70 °C 烘箱中干燥腔室。
  5. 将 MFC 放置在玻璃底培养皿上
    1. 将腔室置于组织培养级 35 mm/50 mm 玻璃底培养皿中央，并在边缘施加轻微压力，使 PDMS 与培养皿底部结合。为避免压碎玻璃底，始终应在坚固表面上施加压力。
    2. 在 70 °C 下孵育 10 分钟。按压腔室以增强其与培养皿的粘附性。
    3. 在紫外光下孵育 10 分钟。
  6. 包被与培养
    1. 向两个腔室中加入 1.5 ng/mL 多聚-L-鸟氨酸（PLO）。通过在通道入口处反复吹打包被液，确保 PLO 流经通道。
    2. 在光学显微镜下以 10 倍放大倍数检查微流控腔室，观察是否存在气泡。若气泡阻塞了微沟槽，将 MFC 放入真空干燥器中处理 2 分钟。随后通过吹打包被液的方式清除通道中残留的空气。过夜孵育。
    3. 用层粘连蛋白（溶于双蒸水，浓度为 3 µg/mL）替换 PLO，同样条件下过夜孵育。
    4. 接种前，用神经元培养基清洗层粘连蛋白。

2. 神经元培养接种

  1. 分离运动神经元培养
    1. 使用直剪刀和精细镊子，从 E12.5 ICR-HB9::GFP 小鼠胚胎中解剖出脊髓。操作在含 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 1× HBSS 溶液中进行（图 3A-C）。
    2. 使用显微解剖剪去除脑脊膜和背角（图 3D）。
    3. 收集脊髓组织块并转移至含有 1 mL HBSS + 1% P/S 的离心管（#1）中。
    4. 用弯头剪将脊髓剪成小块，静置使组织块沉降。
    5. 加入 10 µL 2.5% 胰蛋白酶，置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟。5 分钟时轻敲管壁混匀。组织块应形成螺旋状团块。
    6. 将团块转移至新离心管（#2）中，管内含 800 µL 预热的 L-15 培养基、100 µL 4% BSA 和 100 µL 10 mg/mL DNase。研磨 2 次，静置 2 分钟使未解离组织沉降。将上清液转移至新管（#3）。
    7. 向管中加入 100 µL 4% BSA、20 µL 10 mg/mL DNase 和 900 µL 完全神经基础培养基（CNB，见材料表和表 1）。研磨 8 次，静置 2 分钟。将上清液收集至离心管 #3。
    8. 重复步骤 2.1.7，研磨 10 次。将上清液收集至离心管 #3。此时管底应仅残留少量组织。
      注：若离心管 #2 底部仍有较大团块，需重复步骤 2.1.8。
    9. 在离心管 #3 底部加入 1 mL 4% BSA 缓冲液。
    10. 以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    11. 轻敲管壁重悬细胞沉淀，加入 1 mL CNB 培养基。吹打 6 次，再加入 20 µL 10 mg/mL DNase。
    12. 补充额外 5 mL CNB 培养基，并将 3 mL 转移至新管（#4）。
    13. 在每根离心管（#3 和 #4）底部加入 1 mL 10.4% 密度梯度介质（见表 2）。两相之间应出现清晰的分界面。
    14. 室温（RT）下以 775 × g 离心 20 分钟。离心减速应设为低速，以避免破坏相分离。
    15. 细胞应漂浮于两相之间，呈云雾状界面。将两管中的细胞收集至已预热含 1 mL CNB 培养基的新管（#5）中。
    16. 再加入 4–6 mL CNB 培养基。
    17. 在管底加入 1 mL 4% BSA 缓冲液。
    18. 室温下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 1 mL CNB 培养基轻柔重悬沉淀。
    19. 计数细胞。每根脊髓预期可获得 0.75–1 × 106 个运动神经元。
      注：腹侧脊髓除运动神经元外还含有其他神经元亚型（如中间神经元）。运动神经元纯度主要取决于解剖过程中背侧区域的去除程度以及获取富含运动神经元的头端区域的能力。为确保成像神经元为运动神经元，建议使用内源性运动神经元标记物小鼠品系，例如 HB9::GFP 小鼠。若需获得高纯度运动神经元培养（但细胞得率降低），可采用 FACS 分选纯化15。
    20. 在微流控装置（MFC）中接种分离的运动神经元培养
      1. 以 400 × g 离心 5 分钟，将每室浓缩至 150,000 个运动神经元。
      2. 吸除上清液，用富集型神经基础培养基（RNB）轻柔重悬细胞，每 MFC 加 4 µL。RNB 为 CNB 培养基添加 2% B27 和 25 ng/mL BDNF。
      3. 移除两个腔室中的培养基，仅在远端腔室的孔中保留约 10 µL 的低体积液体。此时可见孔边缘形成一圈薄液环。
      4. 缓慢将 4 µL 细胞悬液加入通道中。从通道另一侧孔中吸出 4 µL 液体，再缓慢将其重新加入通道，以逆转液流方向，从而最大化通道内的细胞密度。
      5. 使用 10× 光学显微镜确认细胞已进入通道，随后将装置放入培养箱孵育 30 分钟，期间不添加额外培养基。
      6. 缓慢向近端和远端孔中各加入约 10–15 µL RNB，并将装置继续置于培养箱中孵育 15 分钟。
      7. 孵育结束后，缓慢向每个孔中加入约 75–80 µL RNB。
    21. 分离运动神经元培养的维持
      1. 接种后第一天（DIV1），更换为含 1 µM 阿糖胞苷（Ara-C）的 RNB 培养基，以抑制胶质细胞生长。
      2. Ara-C 处理两天后（DIV3），将近端腔室中的培养基更换为新鲜 CNB 培养基（不含 Ara-C）。
      3. 为促进轴突穿过微沟道，仅在远端腔室中加入含 25 ng/mL 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和 25 ng/mL 脑源性神经营养因子（BDNF）的 RNB 培养基。远端轴突孔（体积较大）与近端孔之间应维持至少每孔 10 µL 的体积梯度。
      4. 每两天更换一次培养基。轴突完全向远端延伸可能需要 4–6 天。
  2. 脊髓组织块培养
    1. 使用直剪刀和精细镊子，从 E12.5 ICR-HB9::GFP 小鼠胚胎中解剖出脊髓。操作在含 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 1× HBSS 溶液中进行（图 3A-C）。
    2. 使用显微解剖剪去除脑脊膜和背角（图 3D）。
    3. 将脊髓切成 1 mm 厚的横截面（图 3E）。弃去微流控装置（MFC）近端腔室中的全部培养基。
    4. 用移液器吸取单个脊髓组织块，总体积为 4 µL。将组织块尽可能靠近凹槽处注入，并通过侧向出口（1 mm 打孔）吸出近端孔中多余的液体。组织块应被吸入近端通道内。
    5. 缓慢向近端孔中加入 150 µL 脊髓组织块培养基（SCEX，见材料表和表 3）。
    6. 脊髓组织块培养的维持
      1. 在近端腔室中加入 SCEX 培养基，在远端腔室中加入富集型 SCEX 培养基（含 50 ng/mL BDNF 和 GDNF 的 SCEX）。远端孔（体积较大）与近端孔之间应维持至少每孔 15 µL 的体积梯度。
      2. 每两天更换一次培养基。轴突完全向远端延伸可能需要 3–5 天。

3. 轴突运输（图4A）

  1. 线粒体和酸性区室的标记
    1. 配制新鲜的 SCEX 培养基（或用于分离运动神经元的 CNB 培养基），其中含有 100 nM Mitotracker Deep Red FM 和 100 nM LysoTracker Red。在 37 °C 下孵育 30–60 分钟。只要荧光染料的发射光谱不重叠，也可使用其他颜色的染料。
    2. 用预热的 CNB/SCEX 培养基洗涤 3 次。培养板即可用于成像。
  2. 活细胞成像
    1. 以每 3 秒一帧的频率采集 100 个时间序列图像，每段视频总时长为 5 分钟。
      注：本研究使用的成像系统包括一台倒置显微镜，配备转盘共聚焦装置，由专用细胞成像软件控制，使用 60 倍油镜（NA = 1.4）和 EMCCD 相机。成像过程中维持环境温度为 37 °C、CO2 浓度为 5%。
      注：根据实验需求，可采集更长或更短时间的延时成像视频。如有需要，甚至可进行过夜成像。然而，关键是要尽量缩短曝光时间、降低激光功率，并减少总图像数量，以降低成像过程中对细胞的光毒性及荧光漂白。

4. 图像分析（图4-5）

  1. 使用轨迹图分析法分析颗粒运输分布与密度
    1. 在FIJI中打开文件。通过点击图像 | 堆栈 | 工具 | 分离通道来分离各通道。
    2. 通过点击图像 | 属性设置图像属性。
    3. 右键点击直线图标，选择分段直线工具。通过双击直线图标将宽度设置为8-10。在整个分析过程中保持相同的直线宽度。
    4. 沿轴突从远端到近端路径绘制分段直线。双击以结束直线标记。
    5. 点击t键，将新直线区域（ROI）添加至ROI管理器。将此信息添加到电子表格分析表中。
    6. 点击m键，测量轴突的面积和长度。将结果添加至分析表中。
    7. 点击插件 | KymoToolBox | 绘制轨迹图生成轨迹图。也可使用其他可用的轨迹图生成插件。
    8. 手动计数移动（逆行或顺行）和非移动颗粒，并将其填入表格对应列中。
      注：若颗粒在特定方向上的位移超过10 µm，则将其归类为顺行移动（即在轨迹图中向左移动）或逆行移动（即向右移动）。可通过使用直线图标绘制一条水平线并按下m键来测量位移。静止颗粒或未达到位移标准的颗粒定义为非移动颗粒（图4B）。
  2. 单颗粒追踪：手动追踪
    1. 从http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html下载适用于FIJI软件的手动追踪插件（由Fabrice P. Cordelière开发）。
    2. 在FIJI/ImageJ中打开文件。使用旋转选项将MFC沟槽对齐至水平方向。
    3. 如需提高信噪比，点击处理 | 减去背景。
    4. 打开手动追踪插件。根据成像所用的具体显微镜设置参数（如像素大小、时间间隔等）。本研究展示的结果中，显微镜与物镜的比例为0.239 µm/像素，帧间隔为3 s。
    5. 获取轨迹的X和Y坐标，并通过复制文本至电子表格保存结果。
    6. 通过点击图像 | 颜色 | 合并通道合并多通道视频，然后仅追踪共定位的点状结构，以分析多通道视频。
  3. 单颗粒追踪：半自动追踪（图5）
    1. 打开分析软件。本研究使用Bitplane Imaris软件版本8.4.1。
    2. 在顶部菜单中切换至Surpass模式。
    3. 点击图像处理 | 交换时间和Z | 确定。
    4. 点击编辑 | 图像属性 (Ctrl+I) | 几何 | 体素大小行。根据所用显微镜设置设置图像属性。
      注：本研究展示的数据中，显微镜与物镜的比例为0.239 µm/像素。
    5. 点击全部等距并更改时间间隔。例如，将间隔设为3 s。点击右下角的重置按钮或按下Ctrl+B。
    6. 在左上角点击小黄点图标添加一层点（Spots）。左下角将打开一个新的编辑点的菜单。
    7. 按下右侧蓝色箭头，直到点检测开始。
      注：使用窗口左下角的滤波器过滤掉部分点非常重要。反复查看视频数次，确保选中了足够数量的点。
    8. 验证或配置参数以满足实验需求。例如，最大距离 = 12 µm（两个不同点之间仍可归入同一条轨迹的最大允许距离）；最大间隙大小 = 1（一条轨迹允许缺失的帧数，仍视为同一条轨迹）。
    9. 点击设置，然后选择轨迹样式 = 关闭，点 = 球体。
    10. 使用滤波栏选择不同的滤波器进行调整。例如，在本研究提供的数据中，轨迹持续时间 = 9 可移除少于3帧的所有轨迹。设置完所有参数后，点击右侧绿色箭头。此步骤之后无法再进行进一步编辑。
    11. 点击带点的小铅笔图标，手动编辑所有轨迹。
    12. 查看视频（图5B）。若出现错误，有以下几种可能的修正方式：
      1. 要断开一条轨迹，点击对象选项，按住Ctrl选择需要断开的两个点，然后选择断开连接。
      2. 要连接一条轨迹，点击对象选项，按住Ctrl选择需要连接的两个点，然后选择连接。
      3. 要删除轨迹或点，选择正确的选项（轨迹/对象），切换至普通铅笔图标界面，然后选择删除。
      4. 要手动添加点，切换至普通铅笔图标界面。屏幕底部会出现手动追踪标记。确保自动连接复选框处于V状态。在视频上，按住Shift键并左键点击以添加点。
    13. 要向已有轨迹添加点，选择目标轨迹（黄色）和对应帧，切换至普通铅笔图标界面，然后手动添加点。完成整个视频处理后，切换至类似红色图表图标的按钮（统计）。分析后的参数可后续编辑。如需编辑，在屏幕左下角点击瑞典钥匙图标。例如：X位置、Y位置。
    14. 点击类似多个软盘图标的按钮，导出所有统计数据。
      注：电子表格输出可直接处理，或使用本分析所用的已发表代码9进行进一步分析，该代码可根据要求提供。分析中提取的参数包括：速度、轨迹位移、运行长度、速度（含方向性）、停顿次数、平均停顿持续时间、Alpha、方向变化次数和瞬时速度。各参数的详细说明见Gluska等人的研究9。

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结果

按照所述方案，将小鼠胚胎HB9::GFP脊髓外植体培养于微流控装置中（图4A）。外植体培养7天后，轴突完全延伸至远端室。向远端和近端室分别加入Mitotracker Deep Red和Lysotracker Red染料，以标记线粒体和酸性区室（图4C）。对远端沟槽中的轴突进行成像，并按如下方式分析录像：首先，采用纤迹图（kymograph）分析比较总体运动分布（图4B,D）。该分析显示，仅在酸性区室中存在向逆向运输的偏向性（静止 = 77.1 ± 9.5%；逆向 = 16.9 ± 8.3%；顺向 = 6 ± 5%；图4E），而在线粒体运输中则无此偏向（静止 = 83.4 ± 6.8%；逆向 = 10.5 ± 6.9%；顺向 = ...

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讨论

在本实验方案中，我们描述了一种用于追踪运动神经元中线粒体和酸性区室轴突运输的系统。这种简化的体外平台可对神经元亚细胞区室进行精确的控制、监测和操作，从而实现对运动神经元局部功能的实验分析。该方案可用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）等运动神经元疾病，重点关注疾病中轴突运输功能障碍的潜在机制10,16。此外，该系统还可用于研究神经营养因子9,16、microRNA10、mRNA8以及标记蛋白在健康与病变的运动神经元或其他神经元（如感觉神经元9或交感神经元轴突14）中的运输过程。类似的方法也可应用于共培养系统中的细胞器运输研究，例如将运动神经元与骨骼肌细胞共培养12，或将交感...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到了以色列科学基金会（ISF，561/11）和欧洲研究理事会（ERC，309377）资助项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm Fluodish – 玻璃底培养皿World Precision Instruments WPIFD35-100
50 mm Fluodish – 玻璃底培养皿World Precision Instruments WPIFD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD 相机安道尔
阿糖胞苷（Cytosine β-D-阿拉伯呋喃糖苷)Sigma-AldrichC17682 mM 的过滤DDW储备液
B-27添加剂（50倍浓缩）赛默飞世尔科技17504044
BDNFAlomone LabsB-250稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
1.25 mm 活检穿孔器World Precision Instruments WPI504530用于大型微生物燃料电池的制备
6 mm 活检穿刺针World Precision Instruments WPI504533用于小型微生物燃料电池的制备
7 mm 活检穿刺针World Precision Instruments WPI504534用于大规模微生物燃料电池的制备
Bitplane Imaris 软件 - 版本 8.4.1Imaris
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich#A3311-100G5% w/v，溶于ddw
氯三甲基硅烷Sigma-Aldrich#386529-100ML
CNTFAlomone LabsC-240稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
密度梯度介质 - OptiprepSigma-AldrichD1556
牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNAse）Sigma-AldrichDN-25神经基础培养基中储存液浓度为10 mg/mL
道康宁高真空硅脂Sigma-AldrichZ273554-1EA用于环氧模具制备
DPBS 10XThermo Fisher#14200-067用ddw按1:10稀释
Dumont精细镊子#55 0.05 × 0.02 mmF.S.T1125520
环氧树脂固化剂Trias Chem S.R.LIPE 743用于环氧模具制备
环氧树脂Trias Chem S.R.LRP 026UV用于环氧模具制备
FIJI 软件ImageJ
GDNFAlomone LabsG-240稀释至10 µg/mL，溶于含0.01% BSA的过滤ddw中
Glutamax 100X赛默飞世尔科技#35050-038
HB9:GFP 小鼠品系杰克逊实验室005029
HBSS 10X赛默飞世尔科技#14185-045用ddw按1:10稀释，加入1% P/S，过滤
iQ 软件安道尔
虹膜剪，弯型，10 cmAS 医疗技术公司11-441-10
虹膜剪，直型，9 cmAS 医疗技术11-440-09
层粘连蛋白Sigma-Aldrich#L-2020
Leibovitz L-15 培养基赛默飞世尔科技11415064
LysoTracker Red赛默飞世尔科技L7528
Mitotracker Deep-Red FM赛默飞世尔科技M22426
Neurobasal 培养基赛默飞世尔科技21103049
尼康Eclipse Ti显微镜尼康
青霉素-链霉素（P/S）溶液生物工业公司03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-Aldrich#P8638在过滤的1×PBS中按1:1000比例稀释
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒道康宁公司#3097358-1004
牛胰蛋白酶Sigma-AldrichT1426储存液：25 mg/mL，溶于1×PBS
Vannas弹簧式显微解剖剪，3 mm刀头F.S.T15000-00
Yokogawa CSU X-1横河

参考文献

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