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方法文章

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

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DOI：

10.3791/60995

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2020年3月28日

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1Biocenter Oulu and Faculty of Biochemistry and Molecular Medicine, University of Oulu, 2InfoTech Oulu, University of Oulu, 3Biobank Borealis of Northern Finland, Oulu University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。

摘要

胚胎肾类器官培养，尤其是由多能干细胞衍生的肾类器官，是研究肾脏发育过程和模拟肾脏疾病的理想工具。然而，这些模型受限于缺乏血管化和功能性。为解决这一问题，本研究改进了将细胞和组织异种移植至禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）以实现血管化并恢复血流的方法。移植组织上覆盖有定制的微型储液装置，可将样本固定在CAM上，并持续提供培养基，防止移植物干燥。改进后的培养方法可使异种移植物存活并生长长达9天。本文还描述了如何利用先前发表的固定Z轴方向（FiZD）方法，为肾类器官和类器官型培养物的长期共聚焦成像提供最佳条件。该方法通过在大量培养基中，将胚胎器官或类器官轻柔地夹在盖玻片与膜之间，从而实现长达12天的高质量成像。上述两种方法结合使用，可实现肾类器官和类器官型肾组织培养的血管化与血流重建，并显著提升共聚焦成像效果。本文所述方法对于体外研究肾脏的基础与应用功能具有重要价值。这两种方法亦可广泛应用于多种类型的组织和类器官。

引言

几十年前，胚胎肾脏的器官型培养已成为研究肾发生的重要模型1,2,3。肾脏类器官代表了一种先进的模型系统，可用于研究健康和病变肾脏的发育过程4。然而，这两种方法的主要缺陷在于均未能重现肾脏的核心功能：血液滤过。在肾脏类器官和器官型培养中，肾单位和肾脏脉管系统的发育过程与体内早期发育阶段相似；然而，体外形成的肾小球仍处于无血管状态5。离体胚胎肾脏和肾脏类器官的血管化此前仅在体内条件下通过移植实验得以实现。例如，将人多能干细胞来源的肾脏类器官移植至小鼠肾包膜下，可使其内的肾单位发育至具备功能的阶段6。

介于完全体外培养与体内移植方法之间的一种中间策略是将组织移植至禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）上。此前已通过该系统证实了完整的小鼠肾原基能够实现血管化7,8。然而，研究也表明，异种移植后小鼠肾脏中的血管系统来源于宿主内皮，而非移植物本身9。这一发现显著限制了嵌合型（禽-哺乳类）胚胎肾脏模型在肾血管系统发育研究中的应用潜力，因为实验条件不支持供体来源的内皮细胞存活。

本方案的第一部分介绍了一种改进的小鼠胚胎肾脏在禽类卵CAM上培养的方法，该方法结合了器官型培养和异种移植的微环境条件。相较于以往的方法，主要改进之处在于：不再将小鼠胚胎肾脏和肾类器官直接放置于CAM上，而是在移植区域覆盖充满培养基的可渗透微型储液器，为移植组织提供营养并防止其干燥。该改进显著提高了实验成功率，并改善了供体来源血管系统发育的条件。将此方法应用于异种移植培养时，可促进由供体肾脏内源性内皮细胞构成的肾小球血管系统的发育。

对细胞形态发生的详细分析是肾类器官培养模型的另一项重要应用。以往报道的肾类器官培养时间序列成像方法仅适用于胚胎肾整体形态和模式形成的分析，而无法用于单个细胞的追踪10。最近，一种新型的固定Z轴方向（Fixed Z-Direction, FiZD）方法被提出，旨在实现对肾类器官和器官型培养物进行高分辨率共聚焦三维时间序列成像11。该方法通过将类器官或胚胎器官轻柔地夹在盖玻片与定制培养板中Transwell插件的可渗透膜之间，直至样品厚度压缩至70 µm，从而为成像提供最佳的光学条件。在本方法的第二部分，详细描述了该定制培养板的制备流程以及FiZD实验的建立步骤，以实现类器官的长期成像。

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方案

动物护理和操作程序符合芬兰关于实验动物使用的国家立法、《欧洲实验和其他科学用途脊椎动物保护公约》（ETS 123）以及欧盟指令 86/609/EEC。

1. 在鸡胚尿囊膜上培养小鼠胚胎肾脏和肾类器官的微型储液器制备及异种移植实验的建立

  1. 使用专为6孔板或12孔板设计的Transwell细胞培养小室。
    注意：根据具体实验需求，可使用大号或小号微型储液槽。当移植不超过八个胚胎肾脏，或在同一鸡胚（例如，在同一鸡胚CAM上同时放置实验组和对照组样本）上放置多个微型储液槽时，建议使用小号微型储液槽。
  2. 使用装有圆锯刀片的旋转多用工具或手锯，将小室侧壁切短，制成一个高2 mm、底部带有可渗透膜的塑料环。
  3. 用手术刀或锋利刀片修整这些微型储液槽的边缘，使其光滑。
  4. 将微型储液槽置于70%乙醇中灭菌，时间不少于1小时。
  5. 用高压灭菌的双蒸水清洗微型储液槽，并在超净工作台中晾干。
  6. 用PBS缓冲液和培养基（高糖DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素）冲洗微型储液槽。
  7. 将储液槽置于培养皿中，膜面朝上，放置于一滴培养基（600 µL/400 µL）之上。
  8. 借助移液器或玻璃毛细管，将分离好的离体胚胎肾脏或肾类器官均匀地排列在膜上，避免肾脏周围残留过多液体。
  9. 将样本在37 °C、5% CO2的细胞培养孵箱中孵育2–24小时，使其贴附于膜上。
    注意：小号插入式储液槽上最多可放置八个E11.5期小鼠胚胎肾脏或肾类器官。若需移植较大的胚胎组织片段，或在CAM上较大区域接种细胞-水凝胶混合物，则建议使用大号储液槽。
  10. 从细胞培养孵箱中取出按照已发表方法制备的8日龄卵外培养鸡胚12,13。
  11. 将微型储液槽转移至CAM上，使移植物面向CAM，膜覆盖其上。将微型储液槽置于CAM的周边区域，避免覆盖鸡胚本体。
    注意：若使用由12孔板Transwell插入物制成的小型微型储液槽，每个CAM上最多可放置三个。
  12. 向微型储液槽中加入500 µL（6孔板插入物）或300 µL（12孔板插入物）培养基。
  13. 在鸡胚CAM上最多培养9天，每天更换微型储液槽中的培养基。
    注意：移植后24–48小时内即可观察到样本的血管化现象。

2. 定制设计培养板的制备及FiZD培养体系的建立

  1. 在6孔板底部钻出直径为20 mm的孔。
    注意：进行FiZD实验时，请使用孔深为16 mm的6孔板（见材料表中的说明）。
  2. 使用电动钻配合沉头钻头、手术刀或锋利的刀片，对孔的边缘（尤其是上表面）进行打磨抛光。
  3. 将6孔板在70%乙醇中灭菌至少1小时。
  4. 用高压灭菌的双蒸水清洗6孔板，并在无菌条件下晾干。
  5. 用70%乙醇彻底清洗22 mm × 22 mm的玻璃盖玻片，或按照Saarela等11发表的方案进行清洁处理。
  6. 使用无毒组织胶将盖玻片粘附于6孔板孔的上表面。在孔周围涂抹胶水，然后轻轻放置盖玻片以覆盖孔洞，待胶水自然干燥。
  7. 在体视显微镜下检查6孔板，必要时清除盖玻片表面多余的干胶。
    注意：确保盖玻片表面无胶残留，以保证样品受压均匀。
  8. 将聚苯乙烯微珠（粒径70 µm）与等体积的水凝胶混合。每孔加入50–100 µL即可满足需求。
    注意：水凝胶与聚苯乙烯微珠的混合物应置于冰上保存。
  9. 在解剖显微镜下将Transwell小室放置好，确保膜面朝上。
  10. 将样品（如离体胚胎肾脏或肾类器官）均匀地排列在膜上。
  11. 小心地将水凝胶/聚苯乙烯微珠混合物添加至样品旁边，避免损伤脆弱组织。
  12. 翻转Transwell小室，使带有样品的膜面朝下。
  13. 轻轻将小室放入经改造的6孔板的孔中，并轻压使其固定，使样品被压缩至微珠水平。
    注意：使用显微镜观察压缩过程的进展。
  14. 用一只手轻轻按住小室使其紧贴孔底，并使用电烙铁在小室边缘的三个位置加热熔化塑料，从而将小室固定在板上。
  15. 小室固定后，向孔中加入2 mL培养基（DMEM/10% FBS/1%青霉素-链霉素），并以相同方式继续组装板中的其余孔。
  16. 将完成组装的6孔板转移至倒置显微镜的载物台培养箱中，进行活细胞延时成像。
  17. 根据适当的实验设置对样品进行延时成像。
    注意：延时成像过程中无需更换培养基，但可通过Transwell小室侧面的孔轻松完成换液操作。

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结果

本研究中展示的鸡胚尿囊膜（CAM）培养方案通过将肾类器官和胚胎肾异种移植到鸡胚CAM上，实现了高效的血管化（图1，视频1）。含有培养基的微型储液装置为供体组织提供营养，并在充分血管化前的阶段防止其干燥。该方法为供体来源的内皮细胞生长提供了适宜条件。因此，移植后肾脏和类器官中的肾血管系统主要（但并非完全）由供体特异性细胞构成（图2B、C、F）。与肾组织培养相比，移植至CAM的肾脏和肾类器官中获得了更为成熟的肾小球血管结构（图2D、E）。

FiZD-方案是一种用于对离体胚胎肾脏和肾类器官进行长期延时成像的方法，适用于高分辨率共聚焦显微镜。在Trowell设计的经典器官型培养方案14中，样品被放置在由金属网格支撑的多孔滤膜上，并维...

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讨论

本文介绍了两种详细方案，优化了经典的肾脏器官型培养方法，能够实现血管化、延长发育以及对离体胚胎肾脏和类器官进行理想的四维（即三维成像与时间）成像。本节重点阐述了方法中的关键步骤，并讨论了常见问题的解决方案。

其他CAM培养方法与这种改进的鸡胚CAM培养方法之间的显著区别在于，在将胚胎肾脏和肾类器官移植到CAM时，使用了定制的微型储液槽。改良的Transwell小室底部膜将样品紧压在鸡胚CAM上并固定其位置，小室的侧壁则作为培养基的储液槽，防止移植物干燥。强烈推荐将异种移植物接种于体外培养的鸡胚CAM，因为该方法可暴露更大面积的CAM，便于放置微型储液槽，并易于直观地观察血管化过程12，13。

鸡胚尿囊膜（CAM）培养方法的一个缺点是，进行异种移植的时间窗口仅限于鸡胚尿囊膜发挥功能的第8至9天，之后尿囊膜开始退化。因此，需要更长时间发育的移植物应通过异种移植至其他组织（例如小鼠肾包膜）来实现血管化

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了芬兰科学院（Suomen Akatemia，资助号：206038、121647、250900、260056；卓越研究中心资助 2012–2017 年 251314）、Munuaissäätiö—芬兰肾脏与肝脏协会、Sigrid Juseliuksen Säätiö、Victoriastiftelsen、芬兰瑞典文化基金会、诺和诺德（Novo Nordisk）、Syöpäjärjestöt（芬兰癌症协会）、欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013；资助号 FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608）以及“地平线2020”玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动创新培训网络“RENALTRACT”项目（项目编号 642937）的资助。作者感谢 Paula Haipus、Johanna Kekolahti-Liias 和 Hannele Härkman 提供的技术支持。

图3、图4和视频2经《发育》（Development）许可重印。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调式铲形钻头Bosch2609255277用于钻取直径为 20 mm 的孔
自动鸡蛋翻转器OLBA B.V., 荷兰AT-42用于卵外培养前的鸡蛋孵化
细胞培养箱松下13090543温度设定为 37° C，湿度 90%，5% CO2
细胞培养箱SANYO10070347鸡胚 CAM 培养专用培养箱。温度设定为 37° C，湿度 90%，5% CO2
Cellstar 6 孔板GreinerM9062孔深 16 mm，与插入物匹配
Dremel 旋转工具用圆形锯片DremelSC690
共聚焦显微镜蔡司LSM780
Corning Transwell 多孔板，带可渗透聚碳酸酯膜插入物Corning10301031适用于 6 孔板。孔径 40 µm
锪孔钻头Craftomat, Bauhaus22377902用于抛光（20.5 mm，1/4"，高速钢）
一次性玻璃毛细管Blaubrand7087 33
一次性手术刀Swann-Morton0501
解剖显微镜奥林巴斯SZ61
钻孔机BoschGSR 18 V-EC Professional
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）SigmaD777高糖
紧凑型 S84 鸡蛋孵化箱Grumbach, 德国8012用于卵外培养前的鸡蛋孵化。温度设定为 38° C，相对湿度高于 60%
乙醇（70%）VWR
受精鸡蛋Haaviston Siitoskanala, Panelia, 芬兰Hy-Line White 和 Nick Chick
胎牛血清HyCloneSH3007003HI Thermo Scientific
DUMONT #5 镊子Dumont#5SF
玻璃盖玻片Menzel-GläserMenzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0##22x22 mm
Histoacryl 胶水贝朗1050052
MatrigelCorning356230
载物台培养箱OkolabBoldline，定制
PBS -/-Corning20-031-CV
PBS +/+BiowestX0520-500用于清洗微型储液槽
青霉素和链霉素SigmaP4333
聚苯乙烯微珠Corpuscular1000263-10直径 70 µm
旋转多用途工具系统Dremel4000
电烙铁WellerTCP S也可使用加热的玻璃毛细管
Thincert 12 孔细胞培养插入物，带 0.4 µm 孔径聚苯乙烯膜Greiner Bio-One665641
Thincert 6 孔细胞培养插入物，带 0.4 µm 孔径聚苯乙烯膜Greiner Bio-One657610

参考文献

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