本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C. elegans中的细胞蛋白毒性应激反应进行表征。
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本文内容
摘要
摘要
生物体常常暴露于不断变化的环境以及细胞内稳态的改变中，这些因素可能对其蛋白质组和生理状态产生有害影响。因此，生物体进化出了特异性的应激反应机制，以修复损伤并维持稳态。这些机制包括内质网未折叠蛋白反应（UPRER）、线粒体未折叠蛋白反应（UPRMT）、热休克反应（HSR）以及氧化应激反应（OxSR）。本文所介绍的实验方案描述了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测和表征这些信号通路激活及其生理后果的方法。首先，介绍了使用通路特异性的荧光转录报告基因进行快速的细胞水平表征、药物筛选或大规模遗传筛选（如RNAi或突变体文库筛选）。此外，还描述了若干互补性强且可靠的生理学检测方法，可用于直接评估动物对特定应激源的敏感性，从而对转录报告基因的结果进行功能性验证。综合来看，这些方法可实现对内外源性蛋白毒性干扰所引起的细胞和生理效应的快速表征。
引言
生物体对细胞内和细胞外环境变化作出响应的能力对其生存和适应至关重要。这一过程在细胞水平上通过多种保护性通路实现，以维持细胞的完整性。尽管多种细胞组分都可能受到应激相关损伤的影响，但细胞应激反应的一个主要作用是修复并维持细胞蛋白质组的稳态。然而，蛋白质被区室化分隔到称为细胞器的特定结构中，这给细胞带来了挑战，因为细胞无法依赖单一的中心化蛋白质质量控制机制来确保细胞内所有蛋白质正确折叠并具有功能。因此，为了应对蛋白质的紊乱，细胞器进化出了专门的质量控制机制，能够识别错误折叠的蛋白质，并在该区室内激活应激反应，以缓解应激状态。例如，细胞质依赖热休克反应（HSR），而内质网（ER）和线粒体则依赖其区室特异性的未折叠蛋白反应（UPR）。氧化应激反应（OxSR）则用于缓解活性氧（ROS）的毒性作用。每种应激反应均在细胞面临挑战或环境损伤时被激活，并诱导特异性的转录反应。这些反应的特征包括合成能够将错误折叠蛋白质重新折叠的分子（如分子伴侣），并将其靶向至正确的细胞器，或者通过蛋白质降解途径清除受损蛋白质。若这些应激反应无法被正常激活，将导致受损蛋白质积累、细胞功能障碍，并进一步扩展为组织系统的功能衰竭，最终导致生物体死亡。不同应激反应的功能与调控机制已在其他文献中综述1。
关于细胞应激反应调控及其活性的许多研究进展都归功于线虫Caenorhabditis elegans，这是一种在遗传学研究中广泛使用的多细胞模式生物。线虫不....
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方案
1. 标准培养温度条件 & OP50 与 HT115 对比
- 标准培养与扩增
- 在LB（表1）或其它适宜培养基中，于室温（约22–25 °C）培养OP50菌株24–48小时。应在室温下培养细菌，因为OP50为尿嘧啶营养缺陷型，若在37 °C培养，回复突变体（例如抑制子突变体）出现的频率更高。不建议长期储存OP50培养物（在4 °C下最长保存1周）。
- 为维持线虫，将约100–200 µL饱和OP50菌液接种至60 mm NGM平板（表1）；为扩增实验用动物，将1 mL饱和OP50菌液接种至100 mm平板。
- 将平板置于实验台面上过夜晾干。
注意：100 mm平板可能需要更长时间干燥，尤其是使用非透气型平板时。所有C. elegans平板应储存在密封容器中，并置于4 °C保存。平板使用不得超过6个月，否则会因干燥导致渗透压和硬度变化，从而影响线虫在平板上的生理状态。 - 常规维持时，将10–15只年轻个体（卵、L1或L2期）转移至60 mm平板。若处理的是繁殖力较低的突变体或转基因株系，可转移更多个体。对于发育或繁殖能力存在缺陷的品系，应转移更多样化的个体群体，以避免品系丢失。若培养温度为15 °C，需每周传代一次；若为20 °C，则每3–4天传代一次。
- 每传代25–30次（若每周传代一次且在15 °....
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结果
利用转录报告基因检测应激反应的激活
此处使用荧光转录报告基因，其可作为有效工具用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）中大多数应激反应的激活。绿色荧光蛋白（GFP）的表达由参与响应特定区室应激的关键转录调控因子的经典靶基因启动子驱动。常用转录报告基因的完整列表见表3。
通过错误折叠或未折叠蛋白以及脂质双分子层应激干扰内质网（ER）稳态，会激活内质网未折叠蛋白反应（UPRER），以恢复内质网的质量与功能。UPRER 包含三个不同的信号通路，由三种跨膜感受器定义：肌醇需求蛋白1（IRE1）、激活转录因子6（ATF6）以及RNA依赖性蛋白激酶（PKR）样内质网激酶（PERK），这些通路在 C. elegans7,
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讨论
本文描述了利用荧光转录报告系统和生理应激生存实验来研究 C. elegans 细胞应激反应的方法。这些报告系统均采用由参与细胞应激反应的转录因子下游靶基因启动子驱动的 GFP 表达。具体介绍了由 XBP-1s 介导的 UPRER 调控的 hsp-4p::GFP、由 ATFS-1 介导的 UPRMT 控制的 hsp-6p::GFP、由 SKN-1 介导的氧化应激反应（OxSR）调控的 gst-4p::GFP，以及由 HSF-1 介导的热休克反应调控的 hsp16.2p::GFP 和 hsp-70p::GFP。其他标准化的转录报告系统见表 3。本文所列的所有转录报告系统均具有较宽的动态范围，可通过遗传干扰或施加应激诱导化学物质来稳健地激活。此外，这些报告系统的信号均可通过敲低所用启动子上游的转录因子而受到抑制。最后，每种转录报告系统均对应一种特定的生理应激生存实验，以提供激活或抑制特定应激反应后生理效应的功能读出。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
R.BZ. 受欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金和拉里·L·希尔布卢姆基金会资助。R.H.S. 受美国国家衰老研究所（NIA）资助的项目 5F32AG032023-02 及格伦医学研究基金会博士后奖学金资助。A.F. 受 NIA 资助的项目 F32AG051355 资助。H.K.G. 受美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目 DGE1752814 资助。M.G.M. 受 NIA 资助的项目 1F31AG060660-01 资助。A.D. 受托马斯与斯泰西·西贝尔基金会、霍华德·休斯医学研究所资助，并获得 NIA 项目 4R01AG042679-04 和 5R01AG055891-02 以及 NIEHS 项目 5R01ES021667-09 的支持。我们感谢 Larry Joe、Melissa Sanchez、Naame Kelet 和 Anel Esquivel 提供的重要技术支持。我们感谢 Morimoto 实验室和线虫遗传中心 CGC（由美国国立卫生研究院研究基础设施项目 P40 OD010440 资助）提供菌株。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗霉素A | Sigma-Aldrich | A8674 | 用于线粒体应激 |
| 蛋白胨 | Fisher Scientific | DF0118072 | 用于NGM平板 |
| BD Difco颗粒琼脂 | VWR | 90000-782 | 用于NGM平板 |
| 二水氯化钙 | VWR | 97061-904 | 用于NGM平板 |
| 羧苄青霉素 | BioPioneer | C0051-25 | 用于RNAi |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | 用于NGM平板 |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | 配备488 nm光源 |
| COPAS清洗液 | Union Biometrica | 300-5072-000 | 与COPAS配合使用 |
| COPAS鞘液 | Union Biometrica | 300-5070-100 | 与COPAS配合使用 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | 472301 | 药物溶剂 |
| 无二噁烷IPTG | Denville Scientific | CI8280-4 | 用于RNAi |
| LB肉汤（Miller培养基） | Fisher Scientific | BP1426500 | 用于LB培养基 |
| M205FA体视显微镜 | Leica | 10450040 | 配备Leica DFC3000G单色CCD相机、标准Leica GFP滤光片（激发波长395-455，发射波长480 LP）和LAS X软件 |
| 七水硫酸镁 | VWR | EM-MX0070-3 | 用于NGM平板和M9培养基 |
| 百草枯 | Sigma-Aldrich | 36541 | 用于氧化应激/线粒体应激 |
| 氯化钾 | Fisher | P217-500 | 用于漂白溶液 |
| 磷酸氢二钾 | VWR | EM-PX1570-2 | 用于NGM平板 |
| 磷酸二氢钾 | VWR | EM-PX1565-5 | 用于M9培养基 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | 配备奥林巴斯4倍平场荧光物镜（NA 0.13）、标准奥林巴斯FITC滤光片（激发波长470/40；发射波长525/50；分光镜560）以及iPad Pro用于成像和运行ECHO软件 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 71289-50G | 用于成像 |
| 氯化钠 | EMD Millipore | SX0420-5 | 用于NGM平板和M9培养基 |
| 磷酸氢二钠 | VWR | 71003-472 | 用于M9培养基 |
| 叔丁基过氧化氢 | Sigma-Aldrich | 458139 | 用于氧化应激 |
| 盐酸四环素 | Sigma-Aldrich | T7660-5G | 用于RNAi |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | 用于内质网应激 |
参考文献
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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重印与许可
