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方法文章

生理应激反应的测量 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/61001

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2020年5月21日

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1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文通过检测荧光转录报告基因的激活以及生物体对生理应激的敏感性，对线虫C. elegans中的细胞蛋白毒性应激反应进行表征。

摘要

生物体常常暴露于不断变化的环境以及细胞内稳态的改变中，这些因素可能对其蛋白质组和生理状态产生有害影响。因此，生物体进化出了特异性的应激反应机制，以修复损伤并维持稳态。这些机制包括内质网未折叠蛋白反应（UPRER）、线粒体未折叠蛋白反应（UPRMT）、热休克反应（HSR）以及氧化应激反应（OxSR）。本文所介绍的实验方案描述了在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测和表征这些信号通路激活及其生理后果的方法。首先，介绍了使用通路特异性的荧光转录报告基因进行快速的细胞水平表征、药物筛选或大规模遗传筛选（如RNAi或突变体文库筛选）。此外，还描述了若干互补性强且可靠的生理学检测方法，可用于直接评估动物对特定应激源的敏感性，从而对转录报告基因的结果进行功能性验证。综合来看，这些方法可实现对内外源性蛋白毒性干扰所引起的细胞和生理效应的快速表征。

引言

生物体对细胞内和细胞外环境变化作出响应的能力对其生存和适应至关重要。这一过程在细胞水平上通过多种保护性通路实现，以维持细胞的完整性。尽管多种细胞组分都可能受到应激相关损伤的影响，但细胞应激反应的一个主要作用是修复并维持细胞蛋白质组的稳态。然而，蛋白质被区室化分隔到称为细胞器的特定结构中，这给细胞带来了挑战，因为细胞无法依赖单一的中心化蛋白质质量控制机制来确保细胞内所有蛋白质正确折叠并具有功能。因此，为了应对蛋白质的紊乱，细胞器进化出了专门的质量控制机制，能够识别错误折叠的蛋白质，并在该区室内激活应激反应，以缓解应激状态。例如，细胞质依赖热休克反应（HSR），而内质网（ER）和线粒体则依赖其区室特异性的未折叠蛋白反应（UPR）。氧化应激反应（OxSR）则用于缓解活性氧（ROS）的毒性作用。每种应激反应均在细胞面临挑战或环境损伤时被激活，并诱导特异性的转录反应。这些反应的特征包括合成能够将错误折叠蛋白质重新折叠的分子（如分子伴侣），并将其靶向至正确的细胞器，或者通过蛋白质降解途径清除受损蛋白质。若这些应激反应无法被正常激活，将导致受损蛋白质积累、细胞功能障碍，并进一步扩展为组织系统的功能衰竭，最终导致生物体死亡。不同应激反应的功能与调控机制已在其他文献中综述1。

关于细胞应激反应调控及其活性的许多研究进展都归功于线虫Caenorhabditis elegans，这是一种在遗传学研究中广泛使用的多细胞模式生物。线虫不仅可用于研究应激反应在细胞水平上的激活，还可用于研究其在个体水平上的表现；研究人员已利用线虫探讨基因扰动或药物和污染物暴露对其生长和存活的影响。线虫具有繁殖周期短、遗传背景一致、身体透明、遗传操作简便以及实验操作容易等优点，使其成为此类研究的理想模型。此外，线虫对应激的生理反应相对较快（数小时至数天内），且其细胞信号通路在进化上高度保守，因此线虫在应激抗性研究中是一种重要的研究工具。

通常使用两种 E. coli 菌株作为食物来源来培养 C. elegans：标准菌株 OP50（一种 B 型菌株，历史上大多数实验均使用该菌株）2 和 HT115（一种 K-12 型菌株，几乎所有的 RNAi 实验均使用该菌株）3,4。需要注意的是，OP50 与 HT115 两种细菌饮食之间存在显著差异。研究表明，以不同细菌为食会导致线虫在代谢谱、线粒体 DNA 拷贝数以及包括寿命在内的多种主要表型上产生显著差异5。其中部分差异归因于在 OP50 细菌上生长所导致的维生素 B12 缺乏，这种缺乏可引起线粒体稳态障碍，并增加对病原体和应激的敏感性。所有这些表型缺陷均被证实可通过在 HT115 细菌上培养而得到缓解，因为 HT115 细菌含有更高水平的维生素 B126。因此，建议所有关于生理应激反应的实验均应在 HT115 细菌上进行，无论是否需要 RNAi 条件。然而，由于在 OP50 上维持线虫培养较为简便，所有常规培养（即线虫的维持与扩增）均可在 OP50 上进行，只要在同步化后（即漂白后孵化，无论是否进行 L1 期阻滞）将线虫转移至 HT115 上直至实验开始，则本文所述实验范式中未观察到显著差异。

本文描述了利用两种功能性方法对细胞应激反应活性进行表征。需要注意的是，所展示的实验方案主要聚焦于细胞应激反应及其对蛋白质稳态的影响。首先，采用荧光转录报告系统，该系统由内源性基因启动子调控，这些启动子可特异性地响应不同类型的细胞应激而被激活。这些荧光转录报告系统基于应激反应中天然存在的特定基因的转录诱导。例如，HSP-4 是一种热休克蛋白，与人类分子伴侣 HSPA5/BiP 同源，在内质网（ER）应激时被激活，并定位于内质网以缓解应激状态。在内质网应激条件下（例如，暴露于衣霉素），由 hsp-4 启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP）会大量合成，可通过荧光显微镜观察或通过线虫的大颗粒流式细胞术进行定量检测7。类似地，线粒体分子伴侣 hsp-6（与哺乳动物 HSPA9 同源）的启动子被用于监测线粒体未折叠蛋白反应（UPRMT8）的激活；而细胞质分子伴侣 hsp-16.2（与人类晶状体蛋白 alpha 基因同源）的启动子则用于评估热休克反应（HSR）的活性9。这些报告系统可快速表征在各种干扰条件下被激活的信号通路。

通常，本文所介绍的报告基因通过显微镜成像进行检测，从而获得应激反应激活情况的定性结果。然而，尽管成像技术能够提供上述报告基因在信号强度和组织定位方面的信息，其定量分析并不总是准确或可靠。虽然可以利用图像分析工具对荧光信号进行定量，但这些方法通量相对较低，且由于成像的动物数量较少，样本量较小。由于 C. elegans 易于快速获得大量个体，因此成为利用大型颗粒流式细胞仪检测荧光应激报告基因激活的理想模式系统。大型颗粒流式细胞仪能够基于尺寸和荧光信号对大量活体动物进行记录、分析和分选。利用该方法，可对数千条线虫获得其荧光强度、体型大小以及空间（二维）信息。该系统由 FlowPilot 软件控制，可实现对测量参数的实时数据采集与分析。本文提供了利用显微成像和大型颗粒流式细胞仪进行定量分析的两种方法，用于检测应激反应的激活情况。

除了报告基因分析外，还可以通过生理应激检测来测量动物对压力的敏感性或耐受性。该方法通过将动物暴露于能够激活特定细胞应激通路的应激环境中来实现。本文提供了多种用于测定整体动物对特定类型应激源敏感性的方法。

通过使用化学试剂衣霉素（tunicamycin）对C. elegans施加内质网（ER）应激，该试剂可阻断N-连接糖基化，导致错误折叠的蛋白质在内质网中积累10。在C. elegans中，暴露于衣霉素会导致内质网功能发生显著紊乱，并显著缩短寿命11。通过测定线虫在含衣霉素培养板上的存活情况，可定量评估其对内质网应激的敏感性。例如，那些异位诱导内质网未折叠蛋白反应（UPRER）从而增强对内质网中蛋白质错误折叠应激耐受能力的线虫，相较于野生型线虫，在衣霉素处理下的存活率更高12。

通过将秀丽隐杆线虫（C. elegans）暴露于化学试剂百草枯，可对其施加氧化应激和线粒体应激。百草枯是一种常用的除草剂，可在线粒体中特异性地引发超氧阴离子的生成13。由于线粒体来源的活性氧（ROS）具有特定的定位，百草枯实验常被用作一种"线粒体"应激检测方法。然而，超氧阴离子可被线粒体中的超氧化物歧化酶（SODs）迅速转化为过氧化氢14。过氧化氢随后可从线粒体中扩散出来，在细胞的其他区室中引发氧化应激。因此，我们将百草枯生存实验描述为同时检测对线粒体应激和氧化应激的敏感性（其他氧化应激实验方法可参见文献15）。

通过将秀丽隐杆线虫（C. elegans）置于升高的温度下，可对其进行耐热性检测。线虫的环境适宜温度约为15–20 °C，当温度超过25 °C时即会引发热应激16,17。耐热性检测通常在30–37 °C范围内进行，因为在此温度下线虫会出现显著的细胞缺陷，且生存检测可在24小时内完成16,18。本文提供了两种进行耐热性检测的替代方法：在34 °C下培养和在37 °C下培养。结合RNA干扰介导的基因敲低或化学药物文库的标准筛选方法，本文所述的实验方案可用于开展大规模筛选研究。

该方案可分为四个主要步骤：秀丽隐杆线虫的培养及成像前准备（第1和第2节）、利用荧光显微镜对转录报告基因进行成像（第3至第5节）、使用大颗粒流式细胞仪对报告基因进行定量检测（第6节）以及用于测量应激敏感性的生理学实验（ 秀丽隐杆线虫 （第7节）

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方案

1. 标准培养温度条件 & OP50 与 HT115 对比

  1. 标准培养与扩增
    1. 在LB（表1）或其它适宜培养基中，于室温（约22–25 °C）培养OP50菌株24–48小时。应在室温下培养细菌，因为OP50为尿嘧啶营养缺陷型，若在37 °C培养，回复突变体（例如抑制子突变体）出现的频率更高。不建议长期储存OP50培养物（在4 °C下最长保存1周）。
    2. 为维持线虫，将约100–200 µL饱和OP50菌液接种至60 mm NGM平板（表1）；为扩增实验用动物，将1 mL饱和OP50菌液接种至100 mm平板。
    3. 将平板置于实验台面上过夜晾干。
      注意：100 mm平板可能需要更长时间干燥，尤其是使用非透气型平板时。所有C. elegans平板应储存在密封容器中，并置于4 °C保存。平板使用不得超过6个月，否则会因干燥导致渗透压和硬度变化，从而影响线虫在平板上的生理状态。
    4. 常规维持时，将10–15只年轻个体（卵、L1或L2期）转移至60 mm平板。若处理的是繁殖力较低的突变体或转基因株系，可转移更多个体。对于发育或繁殖能力存在缺陷的品系，应转移更多样化的个体群体，以避免品系丢失。若培养温度为15 °C，需每周传代一次；若为20 °C，则每3–4天传代一次。
    5. 每传代25–30次（若每周传代一次且在15 °C培养，约6个月）应重新解冻一次新鲜保存的线虫。
    6. 为扩增培养，可将一整块60 mm平板上的线虫分割转移至100 mm平板。作为参考，具有野生型繁殖力的线虫可将一整块60 mm平板分割为4–6份，于20 °C培养2天或15 °C培养3天，即可获得完全覆盖的100 mm平板，且不会达到饥饿状态。

2. 使用漂白法对线虫进行分期/同步化

  1. 用于同步线虫的漂白方案
    1. 使用 M9 缓冲液（表 1）将产卵成虫（充满卵的成年线虫）从琼脂平板上冲洗下来。为进行实验，应从非同步化的线虫群体（即步骤 1.1.6 中的块状线虫）开始漂白处理，因为通过反复漂白同步可能导致显著的遗传漂变。
    2. 用玻璃移液管将线虫/M9 混合液转移至 15 mL 圆锥形离心管中；多个平板的线虫可收集至同一根 15 mL 圆锥形离心管中。
    3. 以 1,000 x g 离心 30 秒，沉淀线虫。吸除上清 M9 液体。除非存在严重污染或大量细菌团块，否则无需彻底洗去残留细菌。若存在此类情况，可用 M9 缓冲液进行多次洗涤。
    4. 配制新鲜的漂白液（表 1）。漂白液可在 4 °C 保存数天，但建议使用新鲜配制的漂白液，因为陈旧漂白液可能导致漂白效率下降，造成漂白不均，从而在清除所有成虫残骸前即损伤卵。
    5. 向线虫样品中加入 2–10 mL 漂白液（约每 0.1 mL 线虫沉淀加入 1 mL 漂白液）。颠倒混匀漂白液与线虫混合物约 5 分钟（不得超过 10 分钟；注意漂白时间可能因实验室条件而异，需根据具体情况优化）。剧烈震荡以加速成虫残骸溶解，并最大程度保护卵的完整性。定期在解剖显微镜下观察，或透过光源查看离心管，确认成虫残骸是否完全溶解，仅剩卵存在。
    6. 以 1,000 x g 离心 30 秒使卵沉淀，随后吸除上清液。卵的离心速度可高于成虫而不破坏其结构完整性；因此，若对离心速度不确定，可使用高达 2,500 x g 的速度离心，不会影响卵的生理状态。
    7. 加入 M9 缓冲液至总体积 15 mL，颠倒混匀以去除卵表面残留的漂白液。
    8. 重复步骤 2.1.6–2.1.7（洗涤/沉淀过程）2–3 次，以彻底去除漂白液。
    9. 用移液器将卵/M9 混合液转移至琼脂平板上，于 15–20 °C 培养以用于后续实验。为估算所需使用的线虫数量，可通过移液 5 µL 卵混合液至琼脂平板或载玻片上，计数卵的数量后除以 5，从而估算每 1 µL 体积中的卵数。取三次独立计数的平均值可提高准确性。为避免饥饿，推荐每板卵数的参考值见 表 2。
    10. 如需更精确的时间同步，可通过将卵/M9 混合液置于 20 °C 旋转器上最多 24 小时，使 L1 期幼虫处于滞育状态。对于野生型线虫，L1 滞育不超过 48 小时未观察到生理缺陷。然而，对饥饿敏感的突变体（如溶酶体或自噬相关突变体）在 L1 滞育条件下表现极差，因此不建议对已知对饥饿敏感的突变体采用此同步方法。若需对无法进行 L1 滞育的线虫实现更高同步性，可采用第 2.2 节所述的产卵法。
  2. 用于同步线虫的产卵方案
    注：作为漂白法的替代方法，可采用产卵实验。当漂白处理无法提供足够同步性时，可使用产卵法，因为成虫体内卵囊中的卵发育时间差异可达 8–12 小时。在实验要求线虫发育阶段尽可能一致，但又无法进行 L1 滞育（例如饥饿敏感突变体）的情况下，推荐使用产卵实验。然而需注意，由于产卵方案操作较为耗时，难以适用于大规模实验。
    1. 将 4–12 条产卵成虫（见步骤 2.2.2 后注释）转移至标准的接种 OP50 或 HT115 菌株的 NGM 平板上（参见上文第 1 节关于菌株选择的建议）。根据实验规模，可使用多个平板。务必准确记录每个平板上的线虫数量，以便后续步骤 2.2 使用。
    2. 将线虫置于实验所需温度（15–20 °C）下培养 4–8 小时。
      注：线虫在平板上停留的时间长短将决定最早与最晚产下的卵之间的时间差，因此可根据需要调整孵育时间。由于较短的孵育时间意味着每条线虫产卵时间减少，应增加每板线虫数量以确保产下足够数量的卵。尽管线虫产卵行为通常呈短暂爆发式而非匀速，但具有野生型繁殖力的线虫平均每小时产卵约 5 枚19。若目标是培养至成虫第 1 天阶段，应控制每板产卵数 <100 枚以避免饥饿（每板推荐线虫数量的更多细节参见 表 2）。
    3. 从平板上移除成虫。必须确保所有成虫均被清除，否则残留成虫将继续产卵，导致群体不同步和/或平板内食物耗尽引发饥饿。

3. 用于转录报告基因成像的线虫培养条件

  1. 线虫培养
    1. 将含有pL4440 RNAi质粒（EV）和/或携带针对目标基因的RNAi表达盒的HT115细菌接种至LB培养基中，培养基中添加100 µg/mL羧苄青霉素和20 µg/mL四环素。
    2. 在37 °C摇床培养箱中过夜（约16小时）培养至饱和状态。
    3. 在60 mm NGM RNAi平板上点加200 µL饱和菌液，在100 mm NGM RNAi平板上点加1,000 µL饱和菌液。于室温（约22 °C）避光条件下过夜晾干（用铝箔 loosely 覆盖）。
    4. 将携带荧光报告基因的同步化转基因线虫群体（完整列表见表3）转移至接种了相应细菌的NGM RNAi平板上。
    5. 在15–20 °C条件下培养至实验所需发育阶段，具体阶段如下所述。
  2. 实验用线虫发育阶段的注意事项
    1. 除需要L4期动物的实验外，转录报告基因实验应在成虫第1天进行。根据WormAtlas资料，在20 °C条件下，自卵孵化起约2.5天（约56小时）可获得L4期线虫（www.wormatlas.org）。
    2. 对于"成虫第1天"，应使用接种卵后在20 °C培养约3–4天（约65–96小时）的线虫。
      注：该时间范围解释如下：约65小时（20 °C）时线虫开始"产卵"，此为真正的"成虫"状态；96小时时线虫进入WormAtlas所描述的"产卵高峰期"，此时成虫为怀卵成虫，卵囊饱满。此后线虫被视为超过第1天，可能开始出现表型差异，因此建议本方案中所有实验均在此"第1天"阶段内进行，最早可从65小时开始，最晚至96小时结束。在本方案所述实验中，使用65–96小时范围内的线虫未观察到显著差异。
    3. 对于单次实验的重复组，建议采用相近的时间点以提高可重复性（例如，所有实验均在接种卵后约65小时或约96小时进行）。
      注：某些转基因或突变线虫生长速度较慢。对此有两种建议方案：1）采用分批同步化，即在不同时间点进行漂白处理，以便在同一时间进行实验。当实验本身的技术变异性大于同步化操作可能引入的变异性时，推荐此方法（例如，持续时间较长的生存实验若不能同时进行，结果可能受影响）；2）采用分批分析，即在相同时间点进行漂白处理，但实验在不同时间点进行。此方法适用于操作简单、本身变异性较小的实验（例如，RNAi诱导的应激反应实验）。

4. 诱导应激反应

  1. 使用 hsp-4p::GFP 作为 UPRER 激活的读出指标
    1. 利用 RNAi 诱导内质网应激
      1. 按照第 3 节所述方法，在 NGM RNAi 平板上接种靶向目标基因的 RNAi 细菌（见表 1）。使用空载体（EV）作为基础 UPRER 水平的对照，使用 tag-335 基因的 RNAi 干扰（该基因编码内质网驻留蛋白 N-连接糖基化的酶；其 RNAi 干扰效果与衣霉素处理相似）作为在内质网应激条件下激活 UPRER 的阳性对照。
      2. 采用第 2 节中描述的方法同步化 hsp-4p::GFP 报告动物。
      3. 根据表 2推荐的标准将卵接种到 RNAi 平板上。
      4. 将卵在 20 °C 下孵育约 3–4 天（约 65–96 小时），以便在成虫第 1 天进行实验。对于 UPRER 实验，当在不同温度下培养时，hsp-4::GFP 报告基因的基础荧光存在差异。因此，所有实验均应在 20 °C 下进行。
    2. 利用化学试剂诱导内质网应激
      1. 采用第 2 节中描述的方法同步化 hsp-4p::GFP 报告动物，并在 20 °C 下培养至 L4 阶段。将动物转移至 M9 液体的离心管中。让线虫自然沉降（重力沉降约 2–3 分钟，或 1,000 x g 离心 30 秒），然后去除 M9 液体。
      2. 将衣霉素用 M9 缓冲液稀释至 25 ng/mL（从 1 mg/mL 储液进行 1:40 稀释）。作为对照，同时将等体积的 DMSO 用 M9 缓冲液稀释。
      3. 向线虫中加入 25 ng/mL 衣霉素/M9 溶液或对照 DMSO/M9 溶液（1.5 mL 离心管使用 400–500 µL，15 mL 锥形管使用 2 mL）。在 20 °C 下于旋转平台上孵育 3–4 小时。
        注：衣霉素也可直接稀释到线虫/M9 混合液中。
      4. 让线虫沉降后，去除 M9/TM 溶液，并用 1 mL M9 缓冲液洗涤一次。
      5. 将动物转移至 NGM 平板或 NGM RNAi 平板，在 20 °C 下恢复过夜（约 15–20 小时），直至达到成虫第 1 天，再进行荧光显微镜观察（见第 5 节）。过夜恢复是为了使 GFP 蛋白积累至可检测水平。
      6. 或者，可通过将 L4 阶段动物转移至含有 25 ng/µL 衣霉素的琼脂平板中孵育 16–24 小时来诱导 hsp-4p::GFP 表达。由于应激时间更长，该方法对 hsp-4p::GFP 的诱导更强，因此其动态范围远低于上述实验方法。
  2. 使用 hsp-6p::GFP 作为 UPRMT 激活的读出指标
    1. 利用 RNAi 诱导线粒体应激
      1. 按照第 4.1.1 节相同方案激活 UPRMT，但使用针对线粒体基因（如 cox-5b/cco-1，即细胞色素 c 氧化酶亚基 5B；其敲低会抑制电子传递链活性）的 RNAi 干扰。通过干扰电子传递链功能来激活 UPRMT 时，RNAi 干扰需在早期发育阶段进行20。因此，本实验应从孵化开始即进行 RNAi 处理。
    2. 利用化学试剂诱导线粒体应激
      1. 按照第 3 节所述方法制备接种了靶向目标基因的 RNAi 细菌的平板。即使在不涉及 RNAi 干扰的实验中也应使用 HT115 菌株（见第 1 节）。确保为步骤 4.2.2.5 准备好 NGM RNAi 平板（或 NGM RNAi + DMSO0.2）和 NGM RNAi + 抗霉素 A 平板（见表 1）。
      2. 采用第 2 节中描述的方法同步化 hsp-6p::GFP 或 hsp-60p::GFP 报告动物。
      3. 根据表 2推荐的标准将卵接种到选定的接种平板上。由于抗霉素 A 溶于 DMSO，因此应从孵化起就在 NGM RNAi + DMSO0.2 平板上培养动物。
      4. 将卵在 20 °C 下孵育 2 天（约 56 小时）至 L4 阶段。或者，也可在 15 °C 下培养 3 天（约 75 小时）。
      5. 将线虫从 NGM RNAi + DMSO0.2 平板转移至 NGM RNAi + 抗霉素 A 平板作为处理组，或继续留在 NGM RNAi + DMSO0.2 平板作为对照组。小规模实验可使用挑针手动转移，大规模实验建议用 M9 缓冲液洗涤动物，离心沉降后去除 M9，再接种至 NGM RNAi + 抗霉素 A 平板。
      6. 继续孵育约 20 小时后，在成虫第 1 天进行成像（见第 5 节）。
  3. 使用 gst-4p::GFP 作为氧化应激反应的读出指标。
    1. 利用 RNAi 诱导氧化应激反应（OxSR）
      1. 或者，可按照第 4.1.1 节所述方案，通过 RNAi 干扰 wdr-23 基因（该基因编码 skn-1 的负调控因子，因此其敲低可诱导氧化应激反应）来诱导 gst-4p::GFP 表达。
    2. 通过暴露于化学氧化剂叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导氧化应激反应
      1. 按照第 3 节所述方法制备接种了靶向目标基因的 RNAi 细菌的平板。即使在不涉及 RNAi 干扰的实验中也应使用 HT115 菌株（见第 1 节）。
      2. 采用第 2 节中描述的方法同步化 gst-4p::GFP 报告动物。
      3. 根据表 2推荐的标准将卵接种到选定的接种平板上。务必准备比所需数量更多的平板，因为药物处理过程会导致超过 >10–20% 的动物死亡。用于成像时，起始数量应大于 >100 只动物；用于分选时，起始数量应大于 >1,000 只动物。
      4. 将卵在 20 °C 下孵育 2 天（约 56 小时）至 L4 阶段。或者，也可在 15 °C 下培养 3 天（约 75 小时）。
      5. 将 L4 阶段动物从平板上洗下，并按每种条件分装至两个 15 mL 锥形管中。吸除液体至至少 1 mL，然后加入等体积新鲜配制的 2 mM TBHP 溶液。总液体体积至少保持在 2 mL，因为体积过低在离心时可能导致线虫大量死亡。药物处理前不要洗涤，因为平板上残留的细菌有助于防止线虫在孵育期间过度饥饿。
      6. 在 20 °C 下于旋转器上孵育 4 小时。
      7. 通过 1,000 x g 离心洗涤线虫，吸除 M9 + TBHP 混合液，并替换为 15 mL 新鲜 M9 缓冲液。重复洗涤一次。
      8. 将线虫接种至 EV RNAi 平板，在 20 °C 下恢复过夜（约 16–24 小时）。也可选择在相应的 RNAi 平板上恢复，但实验表明在 EV RNAi 平板上恢复无显著差异，因此为方便实验操作可采用此方式。恢复后对成虫第 1 天的动物进行成像。
        注：过夜恢复是为了使 GFP 蛋白积累至可检测水平。若不进行恢复，则无法检测到 GFP 信号。若需较短时间恢复，可采用第 4.3.3 节所述方法。
    3. 通过暴露于化学氧化剂百草枯（PQ）诱导氧化应激反应
      1. 重复第 4.2.2 节的所有步骤，获得每种条件下两组 L4 阶段的 gst-4p::GFP 动物，分别置于 15 mL 锥形管中。
      2. 吸除液体至至少 1 mL，然后加入等体积新鲜配制的 100 µM PQ 溶液。与第 4.3.2.5 步类似，建议最小体积为 2 mL。
      3. 在 20 °C 下于旋转器上孵育 2 小时。
      4. 通过 1,000 x g 离心洗涤线虫，吸除 M9 + PQ 混合液，并替换为 15 mL 新鲜 M9 缓冲液。重复洗涤一次。
      5. 将线虫接种至 EV RNAi 平板，在 20 °C 下恢复 2 小时，恢复后立即进行成像。
        注：2 小时恢复是观察到 GFP 诱导所需的最短恢复时间。
  4. 使用 hsp-16.2p::GFP 和 hsp-70p::GFP 作为热休克反应（HSR）激活的读出指标。
    1. 通过暴露于高温诱导热休克反应
      1. 按照第 3 节所述方法制备接种了靶向目标基因的 RNAi 细菌的平板。即使在不涉及 RNAi 干扰的实验中也应使用 HT115 菌株（见引言部分）。
      2. 采用第 2 节中描述的方法同步化 hsp-16.2p::GFP 或 hsp-70p::GFP 报告动物。
      3. 根据表 2推荐的标准将卵接种到选定的接种平板上。务必准备两倍于所需数量的平板，因为一半样本将用于高温处理以诱导热休克，另一半则作为未热休克的对照。
      4. 将卵在 20 °C 下孵育约 3–4 天（约 65–96 小时），以便在成虫第 1 天进行实验。热休克实验中不应在 15 °C 下培养线虫，因为在 15 °C 或 20 °C 下经历热休克的动物之间差异极小。
      5. 将实验组动物转移至 34 °C 培养箱中处理 2 小时。将平板单层放置（即不可堆叠），以确保热量在平板间最快且最均匀地分布。
      6. 将热休克处理后的动物转移至 20 °C 培养箱中恢复 2 小时，然后立即进行成像（见第 5 节）。如需更强的 GFP 诱导，可延长恢复时间。
        注：2 小时恢复是观察到 GFP 诱导所需的最短恢复时间。

5. 使用体视显微镜或低倍宽场/复式显微镜进行成像

  1. 荧光显微镜观察用线虫的制备
    1. 用移液器吸取5–10 µL的100 mM叠氮化钠，滴加至标准NGM平板（即无细菌）表面。
      注意：叠氮化钠浓度可低至10 mM，但在100 mM时观察到最稳定的固定效果，且对荧光信号无明显影响。
    2. 在解剖显微镜下，从实验平板中挑选10–20只线虫，转移至叠氮化钠液滴中。线虫落入叠氮化钠后应迅速停止运动，叠氮化钠本身将在数秒内挥发。
    3. 待叠氮化钠完全挥发后，将线虫按所需成像布局排列整齐，使所有线虫的前后端方向一致。立即进行成像。
      注意：在使用叠氮化钠麻痹后15分钟内，表3中所有转录报告基因的信号均未观察到变化。
  2. 使用体视显微镜进行图像采集
    注意：本方案使用配备Leica DFC3000G单色CCD相机、标准Leica GFP滤光片（激发波长395–455，发射波长480 LP）及LAS X软件的Leica M205FA显微镜。推荐的曝光时间设置见表4。
    1. 启动LAS X程序。
    2. 创建新项目：打开采集选项卡，点击打开项目，然后点击文件夹以新建项目。可通过右键单击文件夹并选择重命名，或按下F2键来重命名该项目。在采集选项卡中，还可调整曝光时间和变倍至所需设置。
    3. 将线虫样品置于物镜下，使用明场模式找到合适的焦平面，以尽量减少荧光漂白。样品中心应为卵列清晰可见且无模糊的区域。将曝光时间、变倍、焦距和明场聚光镜调整至所需设置。
    4. 点击捕获图像按钮获取图像。
    5. 将图像保存为.lif（Leica图像文件）格式，该格式可保存所有原始图像和元数据。也可通过右键单击图像（或项目），在另存为选项中选择TIFF导出TIFF文件。此操作将保存所有通道（如明场和GFP）以及任何修改（如对比度调整将被保存至TIFF中）。
  3. 荧光图像的定量分析
    1. 若需进行定量分析，应采集三维图像。可通过点击右上角标有"z"的z切片选项实现。若该框呈红色，则表示z切片功能已激活。
    2. 通过在左下角可调选项中设置范围和切片厚度来优化z切片。尽可能使用系统优化按钮以获得最佳设置。
    3. 采集图像，并按上述第5.2节所述方式保存图像。排列线虫时应保持适当间距，以便后续测量。
    4. 将TIFF图像导入所选成像软件（如ImageJ）。
    5. 在ImageJ中，从分析菜单选择设置测量，勾选以下选项：面积、平均灰度值、积分密度、显示标签。
    6. 使用感兴趣区域（ROI）工具绘制ROI，逐个测量每只线虫。从分析菜单中选择测量或按M键。在无虫区域绘制背景ROI，并以相同方式测量背景。复制或保存结果窗口中显示的测量数据。
    7. 从每个ROI的积分密度中减去背景积分密度。某ROI的背景强度定义为背景平均灰度值与该ROI面积的乘积。
  4. 使用复式/宽场显微镜进行图像采集
    注意：本方案在使用复式/宽场显微镜观察转录报告基因时，采用配备Olympus 4x Plan Fluorite NA 0.13物镜、标准Olympus FITC滤光片（激发波长470/40；发射波长525/50；分光镜560）以及iPad Pro作为相机和ECHO软件控制终端的Revolve ECHO R4显微镜。推荐的曝光时间设置见表4。
    1. 使用触摸板启动控制程序，创建新相册并命名文件。
    2. 将平板置于物镜下，利用基线（EV/对照处理）和阳性对照设置曝光时间和荧光强度，使信号可见但不饱和。
    3. 保存明场图像和GFP/FITC图像。

6. 使用大颗粒流式细胞仪对报告基因进行定量测量

注意：用于大颗粒流式细胞仪分析的线虫培养与制备可遵循与荧光成像样本制备相同的方案（第1-5节），但需使用更多的动物样本。每个实验条件需使用>500只线虫，因为在操作过程中会损失部分个体，部分个体在定量分析时无法通过过滤标准，还有一些个体可能无法被流式细胞仪准确检测。将准备分选的线虫用5-10 mL M9溶液从培养板上冲洗下来，收集至15 mL圆锥形离心管中，用于后续在流式细胞仪上进行分选。

  1. 使用大型颗粒流式细胞仪进行分选设置
    1. 开启流式细胞仪前
      1. 确保鞘液瓶未空。至少在使用分选仪前数小时，从250倍浓缩液中配制好鞘液，因为鞘液中含有少量去垢剂，可能产生气泡，导致采集过程中出现伪影。
      2. 确保所有废液容器未满。
    2. 开启流式细胞仪
      1. 开启空气压缩机，将其调至自动模式。检查压力表，压力应约为30 psi。
      2. 开启仪器。使用位于仪器左侧电源线旁边的电源开关。
      3. 开启激光器。对于大多数实验，488 nm光源通常已足够；但如果红色荧光需要更高激发能量，则需使用561 nm光源。
      4. 打开FlowPilot软件；仪器应发出一系列咔嗒声，以开启不同阀门。
      5. 在软件窗口中点击启动以开启激光器。在氩激光器控制弹出窗口中点击运行，使激光器开启并达到约12 mW功率。488 nm光源强度将升至约12。
      6. 点击完成以关闭窗口。
    3. 继续操作前的软件检查
      1. 检查压力表——查看窗口底部显示的四个压力值。数值应接近初始设置（鞘液：5.5–5.7；样本：5.7–6.0；分选器：3.1–3.3；清洗：8.5–8.7）。若数值相近，则勾选压力正常旁的复选框。
      2. 检查流路系统——为确保鞘液/样本在流式池中流动时无气泡或碎屑阻塞，多次点击清洗。
      3. 检查鞘液流速——为此，收集鞘液60秒。在手动控制中先切换关闭分选，再切换开启鞘液以启动鞘液流动。用15 mL离心管收集60秒，流速应为~9–10 mL/min。
    4. 使用流式细胞仪前的清洗
      1. 将约3–5 mL的10%次氯酸钠溶液加入收集“杯”中，点击采集。运行约30秒后点击中止，并用真空泵吸除多余液体。
      2. 用去离子水冲洗收集“杯”，并用真空泵吸除。重复2次。
      3. 将约3–5 mL COPAS清洗液加入收集“杯”中，点击采集。运行约30秒后点击中止，并用真空泵吸除多余清洗液。
      4. 用去离子水冲洗收集“杯”，并用真空泵吸除。重复2次。
      5. 将约3–5 mL M9溶液加入收集“杯”中，点击采集。运行约30秒后点击停止，并用真空泵吸除多余M9溶液。
  2. 在分选仪上运行样本
    1. 根据引起目标转录报告基因最强激活的条件，调整激光PMT功率和大小门控。推荐设置见表4。
    2. 将准备好的线虫加入“杯”中。点击采集。注意观察，确保所有液体未被完全吸入仪器，否则流式细胞仪将吸入空气并在检测器中产生气泡。
    3. 当样本量较少和/或已收集足够动物时，点击中止。
    4. 点击设置 | 数据存储 | 仅门控数据。此操作将仅根据大小限制保存数据。点击存储门控数据以保存门控数据，点击清除以删除数据。
    5. 用去离子水冲洗收集“杯”，并用真空泵吸除。重复2次。
    6. 对剩余样本重复步骤6.2.1–6.2.5。
  3. 校准/质量控制——如需要
    注意：此步骤需使用提供的42 µM GYR荧光微球进行对照运行，以校准488 nm激光器。
    1. 按压样本杯顶部的金属唇缘以移除通气管。拧开盖子，用注射器从样本杯中吸出液体。
    2. 使用前充分混匀对照微球瓶，取数毫升加入样本杯中。盖上盖子，并通过按压使通气管重新卡入到位。
    3. 在软件中进入工具选项，点击运行对照微球。
    4. 对于对照微球，将PMT值重置为：绿色 - 325；黄色 - 365；红色 - 575。
    5. 点击采集。鞘液应先开启，随后样本开启。一旦微球开始通过流式池，屏幕底部将显示流速。理想情况下，流速应在5/秒至15/秒之间。若流速过低或为零，需手动顺时针旋转样本阀以提高流速；若流速过高，则手动逆时针旋转样本阀以降低流速。
      注意：通常在“微球保护”模式下，读取500个微球后自动关闭。数据可被清除后重新读取。
    6. 读数完成后，检查五个参数是否呈现清晰的单峰，以及CV值。变异系数（CV）应<15%。同时，确保三个不同荧光通道的CV值彼此接近。
    7. 记录质量控制检查结果：在文件选项卡下，点击另存为屏幕图像。
  4. 清洗与关机
    1. 使用真空泵从样本杯中移除样本，并重复第4.1.4节操作。
    2. 将约3–5 mL去离子水加入收集“杯”中，点击采集，运行约30秒后点击中止。在样本杯中保留少量去离子水。
    3. 清空样本回收杯和废液瓶。
    4. 关闭软件。在文件选项卡下点击退出。在弹出菜单中点击不冲洗直接关闭。
    5. 关闭激光器，关闭仪器，然后关闭空气压缩机。关闭外壳以覆盖仪器。

7. 测量秀丽隐杆线虫（C. elegans）应激敏感性的生理检测方法

  1. 使用衣霉素处理检测内质网应激敏感性
    1. 制备NGM RNAi DMSO平板，点种靶向目的基因的RNAi细菌，操作同第3节。即使在不涉及RNAi敲降的实验中，也使用HT115细菌（见第1节）。同时记得接种NGM RNAi TM平板（见 表1）接种足够数量的平板：准备约5-7套NGM RNAi DMSO平板和约2-3套NGM RNAi TM平板。
    2. 使用第2节中所述的方法同步选定的动物。
    3. 将卵接种至选用的 NGM RNAi DMSO 平板，接种条件遵循推荐标准 表2务必准备所需培养板数量的两倍，因为一半的样品将被转移至NGM RNAi TM培养板。
    4. 在20 °C下孵育卵约3-4天（~65-96 h），至成虫第1天。
    5. 第1天，通过将动物转移至不同的培养板上开始寿命实验。为了节约培养板（因为TM成本较高），每个条件使用8块培养板，每板放置15只动物，每个条件共计120只动物。这样既能保证每板动物数量适中，便于评分，也能为统计分析提供足够样本量，即使存在部分数据删失情况。
    6. 在最初的5-7天内，每天将成年动物转移到新的培养板上，与子代分离，直至子代不再可见。在此期间，应剔除出现“袋状”表型、阴门突出或破裂、或沿培养板壁爬行的个体，这些死亡现象与内质网应激敏感性无关。需要注意的是，TM处理会导致动物发育停滞，因此每2-3天转移1-2次即可，以减少制备含TM培养板的成本。野生型动物在DMSO中的平均寿命约为15–17天，在衣霉素（tunicamycin）中的平均寿命为12–14天。
    7. 在动物停止产生后代后，每隔1-2天记录一次寿命，直至所有动物被判定为死亡或删失。为获得更高分辨率，在成虫期第6至14天期间每天进行TM处理。
  2. 使用百草枯暴露测量线粒体和氧化应激敏感性
    1. 准备含有靶向目标基因的RNAi细菌的平板，方法同第3节。即使在不涉及RNAi敲低的实验中，也使用HT115细菌（见引言）。
    2. 使用第2节中所述的方法同步选定的动物。
    3. 将卵接种至按推荐标准选择的NGM RNAi诱导平板上 表1每个条件需要约60–100只动物，请据此做好准备。
    4. 在 20 °C 下孵育卵约 3–4 天（~65–96 h），至成虫第 1 天。
    5. 在M9溶液中配制新鲜的100 mM百草枯溶液。
    6. 将50–75 µL含百草枯的M9培养基加入平底96孔板中所需数量的孔内。通常建议每种条件设置约8–10个孔，每孔含有约8–10只动物。这样每种品系总共约80只动物，每孔动物数量清晰可辨。
    7. 每种条件下挑选 8–10 只动物，转移至含有 M9+百草枯的孔中。使用挑针而非移液器将动物转移至孔中，以避免体积差异及百草枯浓度的意外改变。
    8. 每2小时对每个孔中动物的死亡情况进行评分。轻轻敲击培养板，活体动物会因此剧烈扭动或弯曲。需注意，有时活体动物可能暂时瘫痪，导致被误判为死亡。因此，若某时间点记录的活体动物数量多于前一时间点，则很可能此前有动物被误判，应予以修正（例如，若在第4小时有2/10的动物被记为死亡，而在第6小时仅有1/10动物死亡，则第4小时的记录应更正为1/10动物死亡）。
  3. 利用高温暴露测量热敏感性
    1. 准备含有靶向目的基因的RNAi细菌的平板，方法同第3节。即使在不涉及RNAi敲低的实验中，也使用HT115细菌（见第1节）。
    2. 使用第2节中描述的方法同步选定的动物。
    3. 将卵接种到符合推荐标准的已铺板培养皿中 表1每个条件需准备60–100只动物用于热耐受实验。进行热耐受实验时，为获得最佳同步效果，应采用L1期停滞或产卵实验，因为实验动物的年龄差异会对结果造成显著变异。
    4. 在 20 °C 下培养动物约 3–4 天（约 65–96 小时），以在成虫第 1 天进行实验。热激实验中不得在 15 °C 下培养线虫，因为动物在 15 °C 与 20 °C 下经历热激时存在轻微差异。
    5. 第1天，将动物转移至单独的培养板上进行准备。通常建议每板放置约10–15只动物，共4–6板，总计60只动物。这样可使每板动物数量便于评分，同时尽量减少动物从高温环境中取出的时间。
    6. 将动物放入37 °C培养箱中，并每2小时观察一次。由于在5小时之前几乎不发生死亡，因此从第5小时开始在37 °C下进行热耐受性评分。中位热耐受通常在约9小时达到，因此第7、9和11小时是关键时间点；但由于不同培养箱及实验室之间的差异，各实验室可能需要对此进行优化调整。此外，任何有助于减少变异性的方法均有帮助（例如，避免叠放培养板、将培养板置于同一培养箱内的相同区域、尽量减少培养箱的开关次数、每次仅取出尽可能少的培养板以缩短动物暴露于37 °C以外环境的时间等）。完整操作指南请参见21).
    7. 作为步骤7.3.6的替代方案，将动物置于34 °C而非37 °C。在34 °C条件下，中位热耐受时间为略超过14小时，因此12、14和16小时是34 °C热耐受实验的关键时间点。

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结果

利用转录报告基因检测应激反应的激活
此处使用荧光转录报告基因，其可作为有效工具用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）中大多数应激反应的激活。绿色荧光蛋白（GFP）的表达由参与响应特定区室应激的关键转录调控因子的经典靶基因启动子驱动。常用转录报告基因的完整列表见表3。

通过错误折叠或未折叠蛋白以及脂质双分子层应激干扰内质网（ER）稳态，会激活内质网未折叠蛋白反应（UPRER），以恢复内质网的质量与功能。UPRER 包含三个不同的信号通路，由三种跨膜感受器定义：肌醇需求蛋白1（IRE1）、激活转录因子6（ATF6）以及RNA依赖性蛋白激酶（PKR）样内质网激酶（PERK），这些通路在 C. elegans7,

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讨论

本文描述了利用荧光转录报告系统和生理应激生存实验来研究 C. elegans 细胞应激反应的方法。这些报告系统均采用由参与细胞应激反应的转录因子下游靶基因启动子驱动的 GFP 表达。具体介绍了由 XBP-1s 介导的 UPRER 调控的 hsp-4p::GFP、由 ATFS-1 介导的 UPRMT 控制的 hsp-6p::GFP、由 SKN-1 介导的氧化应激反应（OxSR）调控的 gst-4p::GFP，以及由 HSF-1 介导的热休克反应调控的 hsp16.2p::GFP 和 hsp-70p::GFP。其他标准化的转录报告系统见表 3。本文所列的所有转录报告系统均具有较宽的动态范围，可通过遗传干扰或施加应激诱导化学物质来稳健地激活。此外，这些报告系统的信号均可通过敲低所用启动子上游的转录因子而受到抑制。最后，每种转录报告系统均对应一种特定的生理应激生存实验，以提供激活或抑制特定应激反应后生理效应的功能读出。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

R.BZ. 受欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金和拉里·L·希尔布卢姆基金会资助。R.H.S. 受美国国家衰老研究所（NIA）资助的项目 5F32AG032023-02 及格伦医学研究基金会博士后奖学金资助。A.F. 受 NIA 资助的项目 F32AG051355 资助。H.K.G. 受美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目 DGE1752814 资助。M.G.M. 受 NIA 资助的项目 1F31AG060660-01 资助。A.D. 受托马斯与斯泰西·西贝尔基金会、霍华德·休斯医学研究所资助，并获得 NIA 项目 4R01AG042679-04 和 5R01AG055891-02 以及 NIEHS 项目 5R01ES021667-09 的支持。我们感谢 Larry Joe、Melissa Sanchez、Naame Kelet 和 Anel Esquivel 提供的重要技术支持。我们感谢 Morimoto 实验室和线虫遗传中心 CGC（由美国国立卫生研究院研究基础设施项目 P40 OD010440 资助）提供菌株。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗霉素ASigma-AldrichA8674用于线粒体应激
蛋白胨Fisher ScientificDF0118072用于NGM平板
BD Difco颗粒琼脂VWR90000-782用于NGM平板
二水氯化钙VWR97061-904用于NGM平板
羧苄青霉素BioPioneerC0051-25用于RNAi
胆固醇Sigma-Aldrich57-88-5用于NGM平板
COPAS BiosorterUnion Biometrica350-5000-000配备488 nm光源
COPAS清洗液Union Biometrica300-5072-000与COPAS配合使用
COPAS鞘液Union Biometrica300-5070-100与COPAS配合使用
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-Aldrich472301药物溶剂
无二噁烷IPTGDenville ScientificCI8280-4用于RNAi
LB肉汤（Miller培养基）Fisher ScientificBP1426500用于LB培养基
M205FA体视显微镜Leica10450040配备Leica DFC3000G单色CCD相机、标准Leica GFP滤光片（激发波长395-455，发射波长480 LP）和LAS X软件
七水硫酸镁VWREM-MX0070-3用于NGM平板和M9培养基
百草枯Sigma-Aldrich36541用于氧化应激/线粒体应激
氯化钾FisherP217-500用于漂白溶液
磷酸氢二钾VWREM-PX1570-2用于NGM平板
磷酸二氢钾VWREM-PX1565-5用于M9培养基
RevolveECHO75990-514配备奥林巴斯4倍平场荧光物镜（NA 0.13）、标准奥林巴斯FITC滤光片（激发波长470/40；发射波长525/50；分光镜560）以及iPad Pro用于成像和运行ECHO软件
叠氮化钠Sigma-Aldrich71289-50G用于成像
氯化钠EMD MilliporeSX0420-5用于NGM平板和M9培养基
磷酸氢二钠VWR71003-472用于M9培养基
叔丁基过氧化氢Sigma-Aldrich458139用于氧化应激
盐酸四环素Sigma-AldrichT7660-5G用于RNAi
衣霉素Sigma-AldrichT7765-50MG用于内质网应激

参考文献

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