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从骨骼肌活检样本中分离肌原纤维并利用纳牛顿分辨率力传感器测定其收缩功能

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DOI：

10.3791/61002

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2020年5月7日

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1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, 3IONOptix BV

本文内容

摘要

本文介绍了一种以纳牛顿分辨率评估横纹肌肌原纤维收缩特性的实验方案。该方案采用基于干涉测量法的光学力探针装置，可获得高信噪比的数据，并能够检测肌原纤维的收缩动力学特性。

摘要

横纹肌细胞对人类和动物的活动至关重要。单个肌纤维由肌原纤维组成，而肌原纤维则由串联连接的肌节构成，肌节是肌肉中最小的收缩单位。编码肌节蛋白的基因发生突变时，肌节功能障碍会导致患者出现肌无力。研究肌原纤维力学特性可以在测量单根肌纤维收缩力时，避免邻近受损肌原纤维可能带来的干扰因素，从而准确评估肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用。肌原纤维的超微结构损伤和排列紊乱可能导致收缩功能受损。如果肌原纤维存在结构性损伤，在分离过程或实验过程中很可能发生断裂。此外，对肌原纤维的研究还能在肌节几何约束存在的条件下评估肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用。例如，通过肌原纤维的测量可以阐明肌原纤维功能障碍是否为肌节蛋白突变的直接效应。另外，由于肌原纤维直径很小，灌注钙溶液或化合物几乎可以瞬间完成，这使得肌原纤维非常适合用于测量收缩过程中激活和舒张的速率。本文所述方案采用基于法布里-珀罗干涉仪原理的光学力探针，可测量纳牛顿（nN）范围内的力，并结合压电长度马达和快速步进灌注系统。该装置能够以高分辨率力测量手段研究肌原纤维的力学特性。

引言

横纹肌细胞对日常生活活动至关重要。肢体运动、呼吸功能以及心脏的泵血运动都依赖于肌细胞产生的力量。骨骼肌由肌束组成，肌束内包含成束的单根肌纤维（图1A）。这些肌纤维由肌原纤维构成，而肌原纤维则由串联排列的肌节组成（图1B,D）。肌节中含有细肌丝和粗肌丝，分别主要由肌动蛋白和肌球蛋白分子链构成（图1B）。肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用是肌肉产生力量的基础。编码肌节蛋白（如nebulin、肌动蛋白和肌钙蛋白T）的基因发生突变的患者，会因收缩功能障碍而出现肌无力1。

肌肉收缩功能的质量可以在不同组织水平上进行研究，从体内完整肌肉到体外运动实验中的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用均可作为研究对象。在过去几十年中，多个研究团队已开发出用于测定单个肌原纤维收缩功能的实验装置2,3,4,5,6,7,8,9,10。这些装置基于检测肌原纤维收缩引起悬臂激光偏转变化（即光学束偏转法）的原理（详见 Labuda 等人11）。尽管测定肌原纤维收缩功能存在一定局限性（例如，缺乏肌原纤维上游的兴奋-收缩耦联过程的动力学信息），但该方法具有多项优势：1）可在肌节几何约束存在的条件下评估肌动蛋白-肌球蛋白相互作用；2）可避免相邻肌原纤维损伤带来的潜在混杂效应（在测定单根肌纤维收缩力时，超微结构损伤和肌原纤维排列紊乱可能影响收缩功能）（图1D）；3）肌原纤维直径较小（约1 µm，图2A），且无膜结构，使得钙离子几乎可瞬时扩散至肌节内。此外，若肌原纤维存在结构损伤，通常会在分离过程或实验过程中发生断裂。因此，评估肌原纤维收缩功能是一种研究肌肉收缩基本机制的精巧方法，也有助于明确肌节蛋白突变所致肌肉疾病是否主要源于肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的异常。

本方案介绍了一种新开发的用于测定肌原纤维收缩力的装置，该装置结合了具有纳牛顿（nano-Newton）分辨率的悬臂式力探针（即Optiforce）。该力探针基于干涉测量原理。干涉测量技术使得可以使用相对刚性的悬臂，从而在悬臂几乎不发生偏转的情况下测量力，使肌原纤维的收缩状态更接近等长收缩。该探针能够以高信噪比评估单个肌原纤维产生的低水平被动和主动收缩力，这些肌原纤维可分离自不同肌肉活检样本，包括人体组织样本。本装置中集成的光学悬臂力探针基于法布里-珀罗（Fabry-Pérot）干涉仪12。该干涉仪可检测安装在套管上的镀金悬臂与一根光纤之间发生的微小位移（图3）。光纤与悬臂之间的间隙称为法布里-珀罗腔。肌原纤维通过两根涂有胶的玻璃固定纤维连接在探针与压电马达之间。肌原纤维产生的力可通过干涉仪数据进行数学推导。干涉测量基于两个或多个波（在本装置中为三个光波）的叠加或干涉原理。干涉仪发射波长为1,528.77–1,563.85 nm的激光，并通过光纤传输。在探针内部，光在以下三个界面发生反射：1）光纤与介质之间的界面（图3A）；2）介质与悬臂之间的界面（图3B）；3）悬臂金属基底与镀金层之间的界面（图3C）。界面A和B的反射取决于探针所处介质的折射率（n）。由这三个叠加反射光组成的光信号返回至干涉仪中的光电二极管。光电二极管测量光强，该光强是三个反射光叠加后形成的干涉图样的结果。当通过激活或拉伸肌原纤维产生收缩力时，肌原纤维会牵拉悬臂，这一运动改变法布里-珀罗腔的尺寸（d），从而改变腔内可容纳的波长数量。从悬臂反射的光将具有不同的相位，导致干涉图样发生变化。光电二极管将这种干涉图样强度的变化记录为电压变化。随后，结合悬臂刚度，由该电压变化计算出肌原纤维产生的力。制造商通过将连接在悬臂自由端的固定针尖压向称重天平来校准力探针，同时使悬臂的弯曲程度等于读出激光波长的整数倍13。因此，干涉测量是一种高度敏感的方法，可用于检测微小距离变化，实现纳牛顿级分辨率的力测量。该分辨率使得肌原纤维力的测定具有高信噪比。尽管传统干涉测量将测量范围限制在干涉曲线的线性部分，但使用锁相放大器并调制激光波长可克服这一限制14。这一点将在讨论部分进一步详细说明。

为了测量肌原纤维的主动张力，采用了一种快速切换灌流系统，以使肌原纤维暴露于含钙溶液中（图4A）。该快速切换灌流系统可在10毫秒内完成溶液更换。由于肌原纤维直径很小，钙离子扩散进入肌原纤维几乎瞬时完成。因此，该系统特别适用于测量激活过程中肌动蛋白-肌球蛋白结合速率以及舒张过程中解离的速率。激活速率（kACT）和舒张速率（kREL）可通过激活-舒张曲线确定。此外，通过将肌原纤维暴露于钙离子浓度逐步升高的溶液中，可测定张力-钙关系及钙敏感性。

此外，压电长度电机可实现肌原纤维的快速拉伸与缩短。这为研究肌原纤维的黏弹性特性（即被动张力），以及进行快速缩短再重新拉伸以测定张力恢复速率（kTR）提供了可能。从主动张力和被动张力实验中获得的参数可因肌节蛋白的基因突变而发生改变。

该定制装置用于测量从健康人、患者和小鼠骨骼肌中分离出的肌原纤维的主动和被动收缩特性。

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方案

获取人体活检的方案已获得荷兰VU大学医学中心机构审查委员会的批准（编号：2014/396），并已从受试者处获得书面知情同意。获取动物肌肉活检的方案已获得VU大学当地动物伦理委员会的批准（编号：AVD114002016501）

1. 准备与肌原纤维的分离

注意：使用先前描述的方法对活检组织进行甘油化处理，配制不同钙离子浓度（pCa）的溶液7,16,17，并分离肌原纤维2,18。

  1. 将储存于 -80 ˚C 的舒张液（pCa 9.0，Rx）和激活液（pCa 4.5，Act），以及抑制剂（1 M E64、1 M DTT、1 M 亮抑蛋白酶肽、1 M PMSF）解冻。
  2. 取约 1 mm3 的纹状肌活检组织样本，将其置于盛有 1:1 Rx/甘油（v/v）溶液的小培养皿中，并将培养皿放置于 4 ˚C 的冷板上。
  3. 在解剖显微镜下使用镊子对肌肉组织进行解剖，分离出单根肌纤维，但不将其从组织块中完全分离。
    注意：尽可能去除脂肪和结缔组织，以防止肌原纤维悬液受到污染。
  4. 将解剖后的组织转移至含有 1.5 mL 添加抑制剂的舒张液（每毫升含 1 µL E-64、1 µL 亮抑蛋白酶肽、1 µL DTT 和 125 µL PMSF）的 5 mL 离心管中，在约 4 ˚C 下平衡 1 小时。
  5. 在孵育期间，启动两台计算机，打开所有设备，并运行相应的软件（参见材料表）。
  6. 将力探针浸入培养皿中的超纯水中，并对探针进行校准。
    1. 在干涉仪上点击“启动向导”，并按照屏幕提示操作。点击校准后，轻敲显微镜载物台。
      注意：轻敲显微镜载物台会使悬臂发生偏转并穿过干涉条纹，从而完成探针校准。
    2. 校准完成后，将探针继续浸没在培养皿的超纯水中。
  7. 初始化压电马达位置。请根据以下步骤之一进行操作。
    1. 当压电马达用于 kTR 张力实验时，将长度设为 0 µm。
      信号发生器设置详见表 1 和 图 5A。
    2. 当压电马达用于被动张力实验时，将长度设为 50 µm。
      信号发生器设置详见表 1。
      注意：两步之间的区别在于压电长度马达的初始位置。为拉伸肌原纤维，压电马达需向外拉动，以增加两个固定针之间的距离并延长肌原纤维；为松弛肌原纤维，压电马达需向内推动，以减小两个固定针之间的距离并缩短肌原纤维。
  8. 准备显微镜载玻片。用移液器吸取 150 µL 聚羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA）溶液（5% poly-HEMA 溶于 95% 乙醇，w/v），滴加在载玻片上，并均匀铺展至整个表面。
    注意：若将肌原纤维悬液滴加在未包被的载玻片上，沉降至底部的肌原纤维会粘附于玻片表面，导致无法进行后续粘胶固定。
  9. 用 pCa 溶液填充注射器（参见 图 4A），并预启动灌流系统。
    注意：在这些步骤中，所有管路均需预先充满相应溶液，以确保彻底排除管路中的气泡。
    1. 用舒张液（Rx）填充流室背景流的进液管路（图 3、4A）。
    2. 如需使用，用超纯水冲洗 manifold 以去除空气。操作时，将装有超纯水的注射器连接至出口端，反向冲洗。同时封闭 manifold 上未使用的端口。
    3. 启动各个 pCa 溶液注射器，使其对应的管路充满 pCa 溶液，随后将注射器连接至 manifold 和 Ɵ-玻璃管。
    4. 通过数据采集面板软件（参见 材料表）点击按钮“1+6”（图 6A），打开阀门 1 和 6，使舒张液（pCa 9.0）和激活液（pCa 4.5）流入 Ɵ-玻璃管；当 Ɵ-玻璃管充满后关闭阀门（图 6B）。

2. 肌原纤维的安装

  1. 用聚HEMA（poly-HEMA）包被显微镜载玻片，以防止肌原纤维黏附到玻璃表面。
  2. 准备用于组织匀浆的匀浆器（见材料表）。用洁净的纸巾清洁内部转子杆，组装匀浆器，先在酒精中以15秒/次的速度旋转1次，再在超纯水中重复3次，每次15秒。随后在冰上用松弛液预冲洗匀浆器1次，每次15秒。
  3. 将匀浆器转子杆放入步骤1.4所述含有肌肉组织的离心管中，在保持离心管处于冰上的同时，以速度5旋转15秒，以撕裂肌肉组织并获得肌原纤维悬液。
  4. 用移液器吸取约50 µL肌原纤维悬液和约250 µL松弛液，滴加至组织浴槽中已包被poly-HEMA的显微镜载玻片上，形成液滴。用盖子盖住浴槽以防止灰尘污染，并静置5–10分钟，使肌原纤维沉降至底部。
    注意：悬液与松弛液的比例取决于分离效果，因此需根据实际情况调整。例如，若肌原纤维得率较低且悬液中可用的肌原纤维较少，则可增加肌原纤维悬液的体积，减少松弛液的用量（如75 µL肌原纤维悬液和225 µL松弛液）。心脏和骨骼肌组织因其明显的横纹结构易于识别。使用10倍或40倍物镜时，单个肌原纤维也可观察到该横纹模式。若悬液中存在其他组织，可通过视觉选择肌原纤维。可跳过5–10分钟的等待时间，但会增加固定肌原纤维的操作难度。
  5. 用胶水（虫胶+乙醇；120 mg虫胶溶于2 mL 70%乙醇）包被固定针。操作时，将胶水在65 ˚C加热30–60秒，取约6 μL滴加至新的未包被载玻片上。将每根固定针的尖端浸入胶水中，重复操作直至可见一层胶膜形成。使用显微操作器将探针和压电驱动的固定针垂直向上移动，为放置组织浴槽腾出空间。随后移除含有胶水的载玻片。
  6. 固定肌原纤维
    1. 将含有肌原纤维悬液且已包被poly-HEMA的显微镜载玻片置于组织浴槽中，并放置于显微镜载物台上。使用40倍物镜寻找合适的肌原纤维。如有必要，移动或旋转组织浴槽，使肌原纤维处于便于固定的位点。
      注意：应选择具有清晰横纹结构、长度约为30 µm的肌原纤维。如步骤3.1和3.2.1中详细所述，可在固定肌原纤维前检测其长度和肌节长度。避免固定已断裂的肌原纤维，因其在收缩过程中极易断裂。
    2. 将流动室滑入组织浴槽上方，正对含有肌原纤维的液滴（即步骤2.4中滴加至载玻片上的液滴），并缓慢下放，但需在接触液滴前停止。
    3. 降低压电驱动的固定针，将其压在肌原纤维底端。轻微上提，检查肌原纤维是否已附着于针尖。
    4. 将流动室下放至足够深度，使探针上的固定针能够触及底部，同时确保探针本身不接触流动室。
    5. 将探针上的固定针压在肌原纤维顶端。轻微上提，检查肌原纤维是否已附着于针尖。
    6. 尽可能将肌原纤维从浴槽底部提起，同时确保在物镜不接触玻片底部的前提下仍能保持聚焦。

3. 启动实验

  1. 使用显微操作器、相机和系统控制器软件（图7A，参见材料表）测量肌节长度。移动压电装置和/或力探针，将肌原纤维的初始肌节长度设定为 2.5 µm。
    注：2.5 µm 的肌节长度可确保肌球蛋白头部与肌动蛋白之间达到最佳重叠。
  2. 使用系统控制器软件的容器功能测量肌原纤维的长度和宽度（图7B、C）。
    注：旋转相机时，可能会发生水平和/或垂直倾斜。为检查相机的对准情况，可使用水平仪确认相机仅为旋转而未倾斜。
    1. 使用显微镜载物台将肌原纤维置于视频图像中央。
    2. 从肌原纤维一侧到另一侧绘制一个矩形框。测量长度时，务必在矩形框内包含胶滴的深色边缘（图2A），因为图像处理基于对比度。
    3. 按下“开始”按钮，在系统控制器软件（参见材料表）中开始记录数据，5 秒后按下“暂停”按钮停止数据记录。此时长度已记录在数据中。
    4. 测量宽度时，首先将相机旋转 90˚（参见材料表），然后利用肌原纤维自身边缘的对比度进行测量。
    5. 按下“开始”按钮，在系统控制器软件（参见材料表）中开始记录数据，5 秒后按下“暂停”按钮停止数据记录。此时宽度已记录在数据中。
  3. 若需测定肌原纤维的主动张力，则需使用灌流装置。若是，则继续进行步骤 3.4；若仅测定被动张力，则跳过步骤 3.4–4.1.3.7，直接进入步骤 4.2。
  4. 定位并初始化灌流装置。
    注：此步骤仅在产生主动力时需要。进行被动张力实验时，请直接进入步骤 4.2。
    1. 将快速步进电机的位置设定为 4 V（图5B）。
    2. 将灌流支架沿桌面滑动，使其左下角与桌面上的标记胶带对齐。
      注：操作时注意不要触碰力探针或压电电机。
    3. 使用操纵器通过肉眼粗略定位 Ɵ 玻璃管。
    4. 通过目镜观察，并使用操纵器小心地将 Ɵ 玻璃管移向肌原纤维。
    5. 使用操纵器将 Ɵ 玻璃管的上通道与肌原纤维对齐，并通过系统控制器软件执行快速步进（信号发生器参数设置见表1）来检查位置（图2B–C，参见材料表）。
      注：确保在快速步进的激活阶段，下通道能与肌原纤维对齐（图2B–C）。
  5. 打开 Rx 的背景流动（图4A），在流动室中建立层流背景流。
    注：背景流动对于防止 Ɵ 玻璃管中 pCa 溶液流动引起的湍流是必要的。
    1. 使用鲁尔阀杠杆开启流动室的流入。
      1. 向流出泵发送以下参数以开始排出流动室中的液体，防止流动室溢出（图9）：阀门 = 浴液阀（2）；微步模式 = 微步；活塞目标 = 48,000；活塞速度 = 38–40（任意单位）。
        注：务必始终确保液面稳定。肌原纤维和悬臂均不得变干。宁可稍有溢出，也不可流量不足。
  6. 使用热电温度控制器（图8，参见材料表）设定目标温度：输入所需温度并按下“开始”按钮。通过热电温度控制器软件中的曲线图确认达到目标温度后，继续后续操作。
    注：在室温下进行实验时，无需使用热电温度控制器。

4. 实验方案

  1. 确定需要执行的主动收缩力实验方案。
    注意：根据研究所需的数据，可进行多种类型的主动收缩力实验：步骤 4.1.1，测量在钙离子饱和浓度 [Ca2+] 下的最大收缩力；步骤 4.1.2，在步骤 4.1.1 基础上增加测定力-钙曲线（Force-pCa 曲线）以评估钙敏感性；步骤 4.1.3，在步骤 4.1.1 或 4.1.2 基础上增加短缩-重拉伸实验，以测定张力重建速率。
    1. 测量最大主动收缩力。
      1. 在系统控制软件中点击“开始”按钮，启动数据记录（参见材料表）。
      2. 在数据采集面板软件中勾选“1+6”按钮（参见材料表），打开阀门 1 和 6，启动 Ɵ-玻璃管中松弛液和激活液的流动（图 6A）。
      3. 在干涉仪上选择并点击“重置量程”按钮，重置干涉仪的测量范围，使基线收缩力为 0 V（参见材料表）。
      4. 当收缩力曲线稳定后，执行 Ɵ-玻璃管快速切换（步长 = 100 µm）。
        信号发生器的设置参数见表 1（图 5C）。系统控制软件中将记录并显示一条类似于图 4D 的激活-松弛曲线。
      5. 点击“暂停”按钮，暂停系统控制软件中的数据记录。
      6. 若不再进行后续激活实验，则取消勾选“1+6”按钮以关闭阀门 1 和 6，停止 Ɵ-玻璃管中的液体流动（图 6B）；点击“终止”按钮停止注射泵（图 9，参见材料表）；关闭鲁尔阀以停止背景液流。
    2. 力-钙曲线（Force-pCa 曲线）
      注意：本步骤与步骤 4.1.1 类似，用于获取最大主动收缩力，但需使用不同 pCa 值的溶液进行多次激活实验。
      1. 在系统控制软件中点击“开始”按钮，启动数据记录。
      2. 在数据采集面板软件中打开阀门 1 和 2，启动松弛液和 pCa 6.2 溶液通过 Ɵ-玻璃管的流动。
      3. 在干涉仪上选择并点击“重置量程”按钮，重置干涉仪的测量范围，使基线收缩力为 0 V。
      4. 当收缩力曲线稳定后，执行 Ɵ-玻璃管快速切换（步长 = 100 µm）。
        信号发生器的设置参数见表 1。
      5. 点击“暂停”按钮，暂停系统控制软件中的数据记录。
      6. 依次对阀门 1 和 3（pCa 5.8）、阀门 1 和 4（pCa 5.6）、阀门 1 和 5（pCa 5.4）、阀门 1 和 6（pCa 4.5）重复执行步骤 4.1.2.1–4.1.2.4。
      7. 若不再进行后续激活实验，则取消勾选“1+6”按钮以关闭阀门 1 和 6，停止 Ɵ-玻璃管中的液体流动（图 6A）；点击“终止”按钮停止注射泵（图 9）；关闭鲁尔阀以停止背景液流。
    3. 测量张力重建速率（kTR）。
      注意：本步骤与步骤 4.1.1（测量最大主动收缩力）类似，但包含部分修改和额外操作。
      1. 计算使肌原纤维松弛 15% 所需的压电元件移动量，并将该值输入信号发生器（图 5D，表 1）。
      2. 在系统控制软件中点击“开始”按钮，启动数据记录。
      3. 在数据采集面板软件中打开阀门 1 和 6（图 6A），启动松弛液和 pCa 4.5 溶液通过 Ɵ-玻璃管的流动。
      4. 在干涉仪上选择并点击“重置量程”按钮，重置干涉仪的测量范围，使基线收缩力为 0 V。
      5. 当收缩力曲线稳定后，执行 Ɵ-玻璃管快速切换（步长 = 100 µm）。
        信号发生器的设置参数见表 1。
      6. 当收缩力达到平台期时，使用压电元件执行短缩-重拉伸操作。
        信号发生器的设置参数见（图 5D，表 1）。系统控制软件中将记录并显示一条类似于图 4E 的激活-松弛曲线。
        注意：可自定义实验程序以自动完成上述步骤。
      7. 点击“暂停”按钮，暂停系统控制软件中的数据记录。
      8. 若不再进行后续激活实验，则取消勾选“1+6”按钮以关闭阀门 1 和 6，停止 Ɵ-玻璃管中的液体流动（图 6B）；点击“终止”按钮停止注射泵（图 9）；关闭鲁尔阀以停止背景液流。
  2. 进行被动收缩力测量。
    1. 执行连续拉伸。
      1. 计算拉伸肌原纤维所需的压电元件移动量，并将该值输入信号发生器（表 1）。
        注意：以上仅为示例参数。应根据肌节长度计算拉伸幅度和持续时间。这些参数的设定对于确保不同肌原纤维单位肌节的拉伸速度一致至关重要。
      2. 在系统控制软件中点击“开始”按钮，启动数据记录。
      3. 在干涉仪上选择并点击“重置量程”按钮，重置干涉仪的测量范围，使基线收缩力为 0 V。
      4. 在系统控制软件中使用信号发生器控制压电元件，执行连续拉伸。示例信号发生器设置见表 1。
      5. 拉伸完成后，使用压电元件将肌原纤维缩短至松弛长度（表 1）。
    2. 执行阶梯式拉伸。
      1. 在系统控制软件中点击“开始”按钮，启动数据记录。
      2. 在干涉仪上选择并点击“重置量程”按钮，重置干涉仪的测量范围，使基线收缩力为 0 V。
      3. 在系统控制软件中使用信号发生器控制压电元件，执行阶梯式拉伸。示例信号发生器设置见表 1（图 5E）。
    3. 拉伸完成后，使用压电元件将肌原纤维缩短至松弛长度。示例信号发生器设置见表 1。
  3. 点击“暂停”按钮，暂停系统控制软件中的数据记录。
  4. 在系统控制软件中点击“停止”按钮，结束数据记录。
  5. 在系统控制软件中点击“文件”和“保存数据”按钮，保存实验数据。

5. 清洁

  1. 取出已测量的肌原纤维，并准备下一个肌原纤维。
    1. 操作时，通过40倍物镜观察目镜，小心撕下肌原纤维。
    2. 将力探针和压电驱动器上移。将θ-玻璃完全向上、向右并向后移动。然后上移并滑出流室。取下组织浴槽。
    3. 清洁固定针时，先用10倍物镜和目镜将其调至清晰视野。将刷子浸入乙醇中，小心刷去针上的胶水并清除干净。
      注意：请注意，胶水可能需要一段时间才能完全清除。
    4. 用超纯水冲洗流室和组织浴槽。
    5. 将探针放入盛有超纯水的小培养皿中，确保探针完全浸没。
  2. 实验结束后，按上述方法清洁装置，并执行以下附加步骤。
    1. 排空流浴管路中的液体。向流出注射泵发送参数（见材料表，图9）。阀门 = 浴槽阀门（2）；微步模式 = 正常；推杆目标 = 0；推杆速度 = 30。
      注意：当管路排空后，终止该指令。
    2. 多次初始化泵（图9B）。
    3. 排空注射器。关闭所有鲁尔阀，打开所有阀门，将管路从注射器针头取下，将特定pCa溶液的管路置于针头下方，然后打开鲁尔阀。使用压力塞加快排液速度。
    4. 将管路重新连接至注射器针头。用约5 mL超纯水填充注射器。在θ-玻璃下方放置一个杯子。打开所有阀门，并打开压力阀以冲洗系统。
    5. 关闭系统。关闭计算机、干涉仪和压电控制器的电源模块。

6. 数据分析

  1. 通过打开数据文件并选择所需片段，将系统控制器软件（参见材料表）中的数据轨迹导出至电子表格软件或剪贴板。将导出显示的轨迹（例如，原始力信号、肌节长度和压电位置）。
  2. 使用选定的软件（例如，MATLAB）进行分析。

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结果

使用系统控制软件记录并打开数据轨迹（参见材料表）。将完整的轨迹或选定的片段导出至剪贴板或文本文件，以便使用所需的软件进行进一步分析。通过自定义软件或手动切换阀门以控制不同溶液的流动。使用自定义的 MATLAB 脚本分析激活速率、张力重建速率和舒张速率。最大主动力以及被动力实验中的峰值力和平台期力直接从系统控制软件的力轨迹中获取。安装肌原纤维后（图2），选择所需的实验方案。

最大活性张力与钙-小鼠和人类骨骼肌活检标本中分离出的肌原纤维的力敏感性
在 图 4A 用于主动收缩力实验的实验装置示意图如图所示。图中展示了从健康人股四头肌分离的肌原纤维在主动收缩力实验中的力信号曲线。该肌原纤维依次用不同pCa值（pCa 6.2、5.8、5.6、5.4、4.5）的溶液激活5次（所示数据为 图4B）。本实验中...

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讨论

本文描述了一种用于评估从人类或动物骨骼肌组织中分离的肌原纤维收缩功能的实验方案。该实验装置的力分辨率此前已由 Chavan 等人报道。12简而言之，该噪声主要由检测光纤与悬臂之间形成的法布里-珀罗腔长度的随机波动所决定，这些波动在读出信号输出端（以 V 表示）产生主导部分的噪声；将此噪声乘以偏转灵敏度（以 m/V 表示）和悬臂的弹簧常数（以 N/m 表示），即可得到力噪声。在本实验装置中，读出信号输出端在空气中的均方根（rms）噪声在每秒采集 1,000 个数据点（sample/s）的采样频率下约为 2 mV。在典型的肌原纤维测量中，使用弹簧常数约为 0.7 N/m 的插芯顶端探针（偏转灵敏度） ∼300 nm/V）。该均方根值对应的悬臂梁偏转分辨率为 0.6 nm，相当于约 0.37 nN 的力灵敏度。力探针通过将固定针尖抵住称重天平并同时使悬臂梁的弯曲程度等于读出激光波长的整数倍来进行校准。13该校准方法包含了悬臂和固定针的刚度，以及由于肌原纤维收缩的速度和幅度可能导致的悬臂和固定针扭矩变化。目前已有基于检测从悬臂反射的激光信...

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披露

Michiel Helmes 是 IONOptix 公司的股东兼共同所有人。

致谢

本项目由 AFM-Telethon 和 A Foundation Building Strength for Nemaline Myopathies 资助。作者谨向本文所提及产品的开发者 IONOptix Inc. 表示感谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bio Spec Products, Inc.985370-XL用于分离肌原纤维
定制编码Matlab
定制制造包含通过串行连接进行控制的Labview程序；用于控制阀门
定制制造用于冷却帕尔帖模块
定制制造
定制制造铝制组织腔室
定制制造用于控制阀门；包含通过USB控制的PC软件
IonOptix系统控制器软件：具有用于压电和快速步进的高级信号发生器的数据记录软件
IonOptixMCS100用于记录肌节长度
IonOptix包含：Optiforce（干涉仪）、微操作器、信号接口、压电马达及控制器。基于MyoStretcher设计
IonOptix力探针
KoolanceADT-EX004S
KoolanceEX2-755用于冷却帕尔帖模块
Microsoft数据注册
OlympusIX71
OlympusTH4-200
Sigma-Aldrich529265聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）；用于显微镜载玻片的涂层，防止组织粘连
Sigma-Aldrich78471溶于乙醇后形成胶水的晶体
TE Technology, Inc.TE-63-1.0-1.3用于冷却组织流动腔室
TE Technology, Inc.TC-720包含通过USB控制的PC软件
Tecan Trading AG20736652
Tecan Trading AG20739263与快速步进灌注系统联用的注射泵，用于诱导背景流；组织流动腔室的流出端
Thermo scientific2441081
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)已停产替代型号：SF-77CST/VCS-77CSP
Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.)TG150-4用于灌注组织
1台PC用于IonWizard，另1台PC用于其他软件

参考文献

  1. Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy. J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).
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  20. Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
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