使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征

Summary

荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。

Abstract

淀粉样纤维与一些神经退行性疾病有关，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。这些淀粉样蛋白纤维能隔离内源性转移稳定蛋白以及蛋白酶网络（PN）的成分，从而加剧细胞中的蛋白质错折叠。可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具数量有限。我们提出了荧光寿命显微镜（FLIM）的协议，允许监测和定量特定细胞（如神经元）中的淀粉样蛋白纤维化，以非侵入性的方式，随着老化的进展和扰动PN。FLIM 独立于荧光道的表达水平，能够分析聚合过程，而无需任何进一步的染色或漂白。当荧光波在淀粉样结构附近时，荧光波会发出淬火，从而导致荧光寿命的缩短。淬火与淀粉样蛋白的聚合直接相关。FLIM 是一种多功能技术，可应用于以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或体内遗传背景的纤维化过程。

Introduction

蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解^1。

由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性²中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。

我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧光衰减功能是通过用短、高频激光脉冲刺激荧光光，并测量发射的光子到达时间到探测器的脉冲。扫描样本时，会为每个像素创建一个三维数据数组:数组包括有关光子在其x、y空间坐标及其时间衰减曲线中的分布的信息。因此，给定的样本成为揭示蛋白质结构、结合和环境^信息,的终身^图。每个荧光蛋白都有内在和精确定义的寿命，通常只有几纳秒（ns），取决于其物理化学性质。重要的是，荧光磷的寿命与其浓度、荧光强度和成像方法无关。然而，在生物系统中，它受到环境因素的影响，如pH、温度、电子浓度、氧饱和度及其相互作用伙伴。使用寿命对内部结构变化和方向也十分敏感。将荧光磷与POI融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光波被包围或封装在紧密结合的环境中，如淀粉样蛋白结构的反平行β片时，它非辐射性地失去能量，这个过程称为淬火^5。荧光道的淬火导致其明显寿命缩短。当可溶性时，蛋白质的寿命将更接近其原始、更高的价值。相反，当蛋白质开始聚集时，其寿命将不可避免地转移到较低的值^66，7。7因此，在活的C.elegans的不同年龄监测任何淀粉样蛋白的聚集倾向成为可能。

在这里，我们描述了一种协议，用于分析融合蛋白的聚合，该蛋白包含不同的多谷氨酰胺（CAG，Q）拉伸（Q40、Q44和Q85）。我们说明了该技术如何同样应用于不同的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红荧光蛋白（mRFP）;和在C.elegans的所有组织中，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白酶的上下文中，FLIM是观察分子护工消耗时变化的非常有用的工具。通过RNA干扰击倒关键分子伴之一，热休克蛋白1（hsp-1）会产生蛋白质过早的误折叠。由于老化、疾病或陪护器不足而增加的聚合载荷，然后作为荧光寿命的缩短来衡量。

Protocol

1. C. 埃勒甘的同步

1. 通过碱性次氯酸盐溶液处理或通过简单的卵子在20°C⁸下铺4小时，同步C.elegans。
2. 根据标准程序^9，在用OP50大肠杆菌种子的线虫生长介质（NGM）板上生长并保持线虫在20°C。将线虫老化到所需的发育阶段或一天。
   注意:在这个协议中，年轻人在第4天被成像，旧线虫在生命的第8天被成像。

2. RNAi 通过喂食对伴郎机械进行敲击

注:通过将相应的RNAi载体喂给线虫^10，对热冲击蛋白1（hsp-1）的伴子进行击倒。hsp-1 RNAi 质粒是从 Ahringer 库（克隆 ID:F26D10.3）获得的。

1. 生长HT115 （DE3）大肠杆菌，在 Luria Bertani （LB） 介质中，在含有 50 μg/mL 氨基霉素的介质中，将hsp-1 RNAi 质粒表达 6 小时到过夜。
2. 准备含有同丙基β-D-1-硫酰氨基（IPTG;1 mM）和氨基霉素（25微克/米L）和含有hsp-1 RNAi细菌的种子的新鲜NGM agar板。将板晾干，并在室温下诱导 1-3 天。
3. 将同步的卵子放在siRNA板上，然后离开孵化，或放置肉汁线虫，允许在20°C下产卵4小时，然后再取出。长线虫，直到所需的年龄或阶段。
   注:第二代线虫可能呈现更强烈的击倒表型。此处描述的 siRNA 协议和条件是一般性的，并适应hsp1。通过特定克隆/基因的siRNA的RNA干扰需要由最终用户建立和优化。需要注意的是，并非所有siRNA都具有相同的效率，因此建议通过定量反向转录聚合酶链反应（RT-qPCR）或西式斑点进行定量定量测试击倒的功效。

3. 准备显微镜幻灯片

1. 在成像当天，首先准备成像幻灯片。在 ddH₂O 中熔化琼脂，浓度为 3%（w/v），稍稍冷却。
2. 切掉 1 mL 移液器尖端的尖端，取大约 200 μL 的熔融琼脂。将阿加松移到干净的玻璃滑道上，并立即将第二个滑道放在顶部，避免形成任何气泡。待干燥并轻轻取下顶部玻璃滑块。结果是一个玻璃幻灯片与均匀的琼脂表面，线虫将被定位。
   注:每张幻灯片将用于在 5-10 线线之间成像。幻灯片可以准备和储存几个小时在一个腐殖质的盒子，以防止琼脂干涸。

4. 将线虫安装到显微镜幻灯片上

注:FLIM要求线虫被固定。一旦成像设置（例如显微镜、激光器、探测器）可供使用，即可执行此步骤。

1. 使用铂线采摘，将所需年龄的线虫放在一个新的非种子板上，让他们爬行，从他们体内去除多余的OP50细菌。
2. 准备麻醉化合物（氧化钠或列维索）以固定线虫。在 4 °C 的暗中保持 500 mM NaN₃库存，并在新鲜的 ddH₂O 中稀释至最终浓度为 250 mM。如果使用 levamisole，在 ddH₂O 中将 20 mM 库存稀释为 2 mM 工作溶液。
   注意:氧化钠（NaN_3）是剧毒的。使用手套和防护眼镜，在通风罩下工作。
3. 在立体显微镜下工作，将10μL的麻醉化合物滴放在琼脂垫上，轻轻将5-10线虫转移到其中。使用睫毛尖端分隔线虫。将它们紧密地放在一起，但不接触，以便在图像采集期间更轻松地定位线虫。
4. 小心地用盖玻片覆盖线线。安装后在 1 小时内进行测量。
   注:两种麻醉剂最终将杀死C.埃勒根。线虫在成像过程中必须完全不可移动，因为生存期的地图是从每个像素记录的。x、y参数的任何移动都阻止在同一激发像素下读取生存期。

5. 获取 FLIM 数据

注:在此协议中，氟磷的寿命通过时域 TCSPC 方法获得。FLIM 要求激光以一组和恒定的重复率生成光脉冲。重复率因激光类型而异，用户需要知道。使用传统显微镜安装的探测器和电子设备可实现终身测量。在该协议中，测量在三个不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行测量，分别由两个不同的公司（材料表）提供探测器和软件，用于获取mRFP、CFP和YFP寿命。检查正确的发射/激励滤镜是否到位，并在启动前最小化任何背景或监控背光。在开始任何实验之前，确定所选荧光波的光稳定性。如果荧光磷在线虫组织内在短时间内漂白，则不适合在C.elegans中进行FLIM测量。

1. 打开 FLIM 获取软件。FLIM 软件还允许控制共聚焦显微镜。找到选项卡/按钮以启用探测器的输出，然后按"启用输出"。
2. 获取仪器响应功能 （IRF），该功能描述了仪器装置的时序精度。
   注:在安装线虫之前，最好执行此步骤。
   1. 如果可用，请拆下激励/发射过滤器。
   2. 将空盖玻片放在目标上方并查找其表面。记录从盖玻片获得的散射信号至少 30 s。
      注:对于几纳秒的使用寿命，采集软件可以自动估计 IRF 偏移。始终建议获取 IRF。
3. 将带有安装的 C. elegans 的幻灯片放在舞台上。在传输模式下使用 10 倍放大镜，并本地化滑道上的线虫位置。
4. 拆下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜，并应用所需的浸入介质（例如机油）。替换舞台上的幻灯片并本地化线虫。
5. 在采集软件上找到针孔管理器，并将其打开至最大值。开始扫描样本，选择感兴趣的区域（例如头部、上半身），并专注于其最大投影平面。
6. 监控激光脉冲速率和软件接口上存在的三个其他值:恒定分数鉴别器（CFD）、振幅时间（TAC） 和模拟到数字转换器（ADC）。
   注: 激光的最大门应为 1 x 10⁸单个光子计数。此数字表示激光提供的光子的最大数量。CFD 提供有关通过探测器参考激光脉冲接收单个光子脉冲的信息。此值应约为 1 x 10⁵。TAC 区分检测到一个光子的时间和下一个激光脉冲。最后，ADC将TAC电压转换为可存储器信号^11。CFD、TAC 和 ADC 都应具有类似的值，以确保氟磷发出的光子不会丢失。正确评估这些参数可确保收集足够的光子以创建准确的生存期贴图。
7. 在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量:ADC 值应介于 1 x 10⁴和 1 x 10^{5 之间}。如有必要，将焦点转移到不同的平面上，或增加激光功率以收集更多的光子。
   注:通常，每秒记录的光子数量不应超过激光重复率的 1%。
8. 在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。
9. 将采集设置为固定的时间量或固定数量的光子。例如，获取生存期衰减曲线 2 分钟，或直到单个像素达到 2，000 个单个事件的光子计数。按"开始"开始采集。
   注:不同的荧光源需要不同的激励和发射激光器和过滤器。根据样品的亮度，激光功率也可以调整，不会干扰寿命。这些协议使用以下激励/发射设置:YFP ex500/em520-50 nm，mRFP ex561/em580-620 nm。使用 ex800/em440 nm 进行 CFP 测量时使用了脉冲双光子激光器。需要为每个设置和每个实验目的建立获取 FLIM 地图所需的时间和光子计数量。

6. 使用 FLIMfit 软件分析 FLIM 数据

注:使用伦敦帝国学院¹²开发的 FLIMfit 软件工具进行数据分析（参见图 1）。

1. 打开软件并通过文件导入 FLIM 数据文件 |加载 FLIM 数据。加载一个条件中的所有样品，即使在不同的会话和从不同的生物重复获得。
2. 如有必要，通过分割从任何 FLIM 图片中分割单个线虫|分段管理器。围绕感兴趣区域拖动裁剪工具，直到突出显示。完成后，按"确定"。
   注:必须对所有图像进行分割。
3. 选择出现C. elegans基于强度的图像的小区域（图 1，箭头 1）。该区域衰减曲线将显示在界面右侧的大衰变窗口中（图 1，箭头 2）。
   注: 衰减可以线性显示或以对数方式显示。
4. 设置正确的参数，以便通过软件的算法推断生存期，如步骤 6.5-6.8 中所述。
5. 在"数据"选项卡上（图 1，箭头 3）:
   1. 设置任意的"集成最小值"以排除任何太暗而无法产生良好拟合的像素。根据C. elegans样本，此值从 40-300 不等。输入不同的值，直到达到令人满意的预览。
   2. 选择时间最小值和时间最大值，将 FLIM 信号限制为这些值。将排除在此阈值之前和之后出现的所有事件。
      注:例如，对于 mRFP 的分析，排除了 800 ps 之前和 4，000 ps 之后的事件。这些值取决于荧光器的生存期，需要由最终用户确定。
   3. 请勿更改预设的计数/光子1。
   4. 输入采集过程中使用的激光的重复率（以MHz为单位）。
      注:对于目前的协议，使用不同的激光器与不同的重复率。用于采集CFP寿命的两个光子激光具有80兆赫的重复率，YFP激光在40兆赫时重复，mRFP的重复率为78.01 MHz。根据分析的样本，这些值被输入到FLIMfit中。
   5. 输入门最大值以排除所有饱和像素。
      注: 对于C. elegans的生命周期测量，此值设置为任何大数（例如，1 x 10^8）。
6. 在"生存期"选项卡上，选择要使用的全局拟合件（例如，像素拟合）。参见图 1，箭头 4。
   注:像素拟合将产生贴切到每个单个像素。图像拟合将生成每个单个图像的全局拟合，并显示每个图像的单个生存期值。全局拟合将在整个数据集中生成单个拟合。为所有图像提供单个生存期值。
7. 除No.如果已知所选荧光衰变是多指数的，并且表现出超过一个寿命，则 Exp 选择。
   注:在本协议中，此函数用于计算双指数 CFP 荧光磷的使用寿命。
8. 通过 IRF 菜单上传 IRF: IRF |负载 IRF.要估计 IRF 移位，请选择IRF |估计 IRF 移位。IRF选项卡上将自动显示一组值。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。
9. 设置所有参数后，按"拟合数据集"（图 1，箭头 5）。该算法将生成适合衰减曲线的算法，并为每个图像建立生存期值。
   注: 生成的拟合（以蓝线突出显示）应与所有事件重叠。当所有事件沿配合对齐时，获得良好的配合。
10. 单击位于软件界面右上角菜单中的参数选项卡（图 1，箭头 6），然后选择"统计:w_mean（加权平均值）并检查chi2值是否尽可能接近 1。
    注: 接近一个的 chi2可确保配合的准确性。因此，所选图像的生存期值以tau_1的形式显示。
11. 导出任何感兴趣的信息:文件 |导出强度图像/拟合结果表/图像/直方图。保存用于计算生存期的数据设置:文件|保存数据设置。
    注: 所使用的参数将被保存，以便将来分析所选样本。

7. FLIM 数据的图形表示

注: 从不同样本收集的生存期可以以不同的方式直观地表示。选择该选择以纳秒或 pco 秒表示生存期值。

1. 通过直接从 FLIMfit 导出衰变曲线来显示拟合的质量和曲线的精度。
2. 通过在直方图中绘制光子计数的频率和生存值来表示光子的分布。
3. 最后，为了进行统计比较，如果比较两个或多个样本，则在散点图条图中放置生存值加上平均值的标准差。执行任何所需的统计分析。

Results

该协议展示了如何准确监测在生物的C.elegan人中聚合物种的形成，无论是在自然老化期间还是在承受压力时。我们选择了四种不同的转基因线虫菌株，用于表达40Q、44Q或85Q重复的多谷氨酰胺蛋白。这些蛋白质在不同的组织中合成，并融合到不同的荧光波中。C. elegans菌株要么在体壁肌肉 （mQ40-RFP） 中表示 Q40-mRFP，在神经系统（nQ40-CFP）中表达 Q40-CFP，要么在肠道中 Q44-YFP 或 Q85-YFP（iQ44-YFP 和 iQ85-YFP）¹³。为了说明衰老如何促进聚合，我们收集了年轻线虫的这些多Q菌株的终生，在生命的第4天，和老线虫，在第8天。为了显示 PN 缺陷的影响，我们在 mQ40-RFP 和 nQ40 菌株中进行了hsp-1的击倒。

一旦通过 FLIMfit 软件推断寿命值，获得的数据显示，由于谷氨酰胺负载...

Discussion

此处介绍的协议描述了一种基于显微镜的技术，用于识别C. elegans模型系统中的聚合物种。FLIM可以通过测量荧光寿命衰变，准确描述融合到荧光磷的聚合和可溶性物种的存在。当融合蛋白开始聚合其记录的平均寿命将从更高值转移到较低的值^16。然后，聚合的倾向可以通过寿命的下降来推断:寿命越低，系统中聚合蛋白物种的存在就越高。因此，有可能跟随PN的老化、疾病或损伤对任何蛋白质的聚集倾向的影响。

为了突出该技术的多功能性，我们的结果表明，FLIM 能够识别各种聚Q结构的结构变化，而不管组织或荧光波。重要的是，FLIM已经成功地应用于C.elegans中其他容易聚集的蛋白质的表征，如β-核核素^17。此外，可以将任何应力因子应用于C. elegans，并遵循任何 POI 的展开和聚合。渗透、金属电、氧化还原或化学应力都可促进毒性失衡，在使用FLIM的C.elegans中可以成功地监测这些不平衡。反过来也是可能的:由于存在有益化合物...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂-琼脂 Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM 成分
Ahringer 文库 hsp-1 siRNA	来源 BioScience UK Limited	F26D10.3
氨苄青霉素	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	抗生素
B&H DCS-120 SPC-150	贝克尔 &Hickl GmbH		FLIM 收购软件
B&H SPC830-SPC 图像	贝克尔 &Hickl GmbH		FLIM 收购软件
BD Bacto 蛋白胨	BD-Bionsciences	211677	NGM 组件
秀丽隐杆线虫 iQ44-YFP	遗传学中心 （CGC）	OG412
C. 秀丽隐杆线虫 iQ85-YFP			森本实验室的善意礼物
秀丽隐杆线虫 mQ40-RFP			森本实验室的亲切礼物
C. elegans nQ40-CFP			来自森本实验室的善意礼物
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	盖玻片
异丙基-β;-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
徕卡 M165 FC	徕卡相机 AG		安装立体显微镜
徕卡 TCS SP5	徕卡相机 AG		共聚焦显微镜
盐酸左旋咪唑	AppliChem GmbH	A4341	麻醉剂
OP50 大肠杆菌	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER （CGC）	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM 收购软件
叠氮化钠	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	麻醉剂
钠	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM 组件
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	载玻片
Universal Agarose	Bio &Sell GmbH	BS20.46.500
蔡司 AxioObserver.Z1	卡尔蔡司 AG		共聚焦显微镜
蔡司 LSM510-Meta NLO	卡尔蔡司 AG		共聚焦显微镜