荧光寿命成像可监测、量化并区分活体、衰老及应激状态下的秀丽隐杆线虫（C. elegans）疾病模型中蛋白质的聚集倾向。
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方法文章
使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
淀粉样纤维与多种神经退行性疾病相关，例如亨廷顿病、帕金森病或阿尔茨海默病。这些淀粉样纤维能够螯合内源性亚稳态蛋白以及蛋白质稳态网络（PN）的组分，从而加剧细胞内的蛋白质错误折叠。目前可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具十分有限。本文介绍一种荧光寿命显微成像（FLIM）技术的操作方案，可非侵入性地监测并定量特定细胞（如神经元）中淀粉样纤维化的进程，适用于研究衰老过程以及蛋白质稳态网络受到扰动时的情况。FLIM技术不受荧光团表达水平的影响，能够在无需额外染色或光漂白的情况下对聚集过程进行分析。当荧光团靠近淀粉样结构时会发生淬灭，导致荧光寿命缩短；这种淬灭程度与淀粉样蛋白的聚集程度直接相关。FLIM是一种多功能技术，可用于在活体条件下以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或遗传背景下的纤维化过程。
引言
蛋白质聚集在衰老和疾病过程中均会发生。导致形成和沉积大分子淀粉样蛋白或无定形包涵体的通路难以追踪，其动力学过程同样难以解析。由于编码序列内的内在突变，蛋白质可能发生错误折叠，遗传性疾病即属此类情况。此外，维持蛋白质可溶性和正确折叠的蛋白质稳态网络（PN）若发生功能障碍，也会导致蛋白质错误折叠，这种情况在衰老过程中尤为常见。PN 包括分子伴侣和降解机制，负责蛋白质的生物合成、折叠、转运和降解1。
C. elegans 因其寿命短、基因型一致且易于进行遗传操作，已成为研究衰老和疾病的模型生物。目前已构建出多种转基因 C. elegans 品系，可在易感组织中表达人类致病蛋白。重要的是，许多携带易聚集蛋白的品系能够重现淀粉样变性疾病的关键特征，即形成大的包涵体。得益于 C. elegans 通体透明的特性，这些蛋白聚集体可在活体中以非侵入性和非破坏性的方式被直接观察2。将任何目的蛋白（POI）与荧光蛋白融合表达，可使其定位、转运过程、相互作用网络及整体命运得以研究。
我们提出了一种通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）在活体且衰老的C. elegans中监测致病蛋白聚集的实验方案。FLIM是一种基于荧光分子寿命而非其发射光谱的强大技术。寿命（tau, τ）定义为光....
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方案
1. C. elegans 的同步化
- 通过碱性次氯酸盐溶液处理或在 20 °C 下简单产卵 4 小时，使 C. elegans 同步化8。
- 按照标准操作流程，在接种了 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）平板上，于 20 °C 培养并维持线虫的生长9。将线虫培养至所需发育阶段或指定日龄。
注：在本方案中，年轻成虫在生命第 4 天进行成像，老年线虫在生命第 8 天进行成像。
2. 通过喂食实现RNAi介导的分子伴侣机器敲低
注意：通过将相应的RNAi载体喂食线虫，实现对热休克蛋白1（hsp-1）分子伴侣的敲低10。hsp-1 RNAi质粒来自Ahringer文库（克隆编号：F26D10.3）。
- 在含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria Bertani (LB) 培养基中，将表达 hsp-1 RNAi 质粒的 HT115 (DE3) E. coli 培养 6 小时至过夜。
- 制备新鲜的含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IP....
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结果
本实验方案展示了如何在活体 C. elegans 中精确监测聚集物的形成过程，无论是在其自然衰老过程中，还是在受到外界压力条件下。我们选用了四种不同的转基因线虫品系，分别表达含有40Q、44Q或85Q重复序列的聚谷氨酰胺蛋白。这些蛋白在不同组织中合成，并与不同的荧光蛋白融合。这些 C. elegans 品系分别在体壁肌中表达Q40-mRFP（mQ40-RFP），在神经系统中表达Q40-CFP（nQ40-CFP），或在肠道中表达Q44-YFP或Q85-YFP（iQ44-YFP和iQ85-YFP）13。为了说明衰老如何促进蛋白聚集，我们在线虫生命的第4天（年轻期）和第8天（老年期）分别收集了这些聚Q品系的聚集情况。为了展示蛋白质稳态系统（PN）功能缺陷的影响，我们在mQ40-RFP品系和nQ40品系中进行了 hsp-1 基因的敲低实验。
通过FLIMfit.......
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讨论
本文所述方案介绍了一种基于显微镜的技术，用于在 C. elegans 模型系统中鉴定聚集态蛋白。通过测量与荧光团融合的蛋白的荧光寿命衰减，荧光寿命成像（FLIM）可准确表征聚集态和可溶态蛋白的存在。当融合蛋白开始聚集时，其记录的平均寿命将从较高值向较低值偏移16。由此可通过寿命的降低程度推断聚集倾向：寿命越低，表明系统中聚集态蛋白的含量越高。因此，该方法可用于追踪衰老、疾病或蛋白质稳态网络（PN）功能障碍对任意蛋白聚集倾向的影响。
为了突出该技术的多功能性，我们的结果明确表明，无论组织或荧光团类型如何，荧光寿命成像（FLIM）均能够识别不同多聚谷氨酰胺（polyQ）结构的构象变化。尤为重要的是，FLIM 已成功应用于线虫（C. elegans）中其他易聚集蛋白的表征，例如 α-突触核蛋白17。此外，可在 C. elegans 中施加任意应激因素，并实时追踪任意目标蛋白（POI）的去折叠与聚集过程。渗透压、金属离子、氧化还原或化学应激均.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究所用的肌肉组织表达Q40-mRFP的线虫品系由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。神经元表达Q40-CFP品系由Morimoto实验室慷慨赠予。本研究获得德国研究基金会（DFG，项目号KI-1988/5-1，授予JK；NeuroCure卓越集群向MLP提供NeuroCure博士生奖学金）、欧洲分子生物学组织（EMBO，向MLP提供短期访问学者奖学金）以及生物学家协会（向CG和MLP提供差旅资助）的经费支持。我们同时感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心先进光学显微成像平台，为YFP构建体的成像提供了设备支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂-琼脂 Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM 组分 |
| Ahringer文库 hsp-1 siRNA | Source BioScience UK Limited | F26D10.3 | |
| 氨苄青霉素 | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.3 | 抗生素 |
| B&H DCS-120 SPC-150 | 贝克尔 & Hickl GmbH | FLIM 采集软件 | |
| B&H SPC830-SPC 图像 | 贝克尔 & Hickl GmbH | FLIM 采集软件 | |
| BD Bacto 蛋白胨 | BD生物科学 | 211677 | NGM 组分 |
| 秀丽隐杆线虫 iQ44-YFP | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | OG412 | |
| 秀丽隐杆线虫 iQ85-YFP | Morimoto 实验室惠赠 | ||
| 秀丽隐杆线虫 mQ40-RFP | 莫里莫托实验室惠赠 | ||
| 秀丽隐杆线虫 nQ40-CFP | Morimoto 实验室惠赠 | ||
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | 盖玻片 |
| 异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Carl Roth GmbH + Co. KG | 2316.4 | |
| Leica M165 FC | 徕卡相机股份公司 | 体视显微镜安装 | |
| Leica TCS SP5 | 徕卡相机股份公司 | 共聚焦显微镜 | |
| 盐酸左旋咪唑 | AppliChem GmbH | A4341 | 麻醉剂 |
| OP50 大肠杆菌 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | OP50 | |
| PicoQuant PicoHarp300 | PicoQuant GmbH | FLIM 采集软件 | |
| 叠氮化钠 | 卡尔·罗斯有限责任公司 | K305.1 | 麻醉剂 |
| 氯化钠 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM 组分 |
| 标准物镜äger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | 载玻片 |
| 通用琼脂糖 | 生物 & Sell GmbH | BS20.46.500 | |
| Zeiss AxioObserver.Z1 | 卡尔·蔡司股份公司 | 共聚焦显微镜 | |
| 蔡司 LSM510-Meta NLO | 卡尔·蔡司股份公司 | 共聚焦显微镜 |
参考文献
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....
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重印与许可
