使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征

摘要

荧光寿命成像可监测、量化并区分活体、衰老及应激状态下的秀丽隐杆线虫（C. elegans）疾病模型中蛋白质的聚集倾向。

摘要

淀粉样纤维与多种神经退行性疾病相关，例如亨廷顿病、帕金森病或阿尔茨海默病。这些淀粉样纤维能够螯合内源性亚稳态蛋白以及蛋白质稳态网络（PN）的组分，从而加剧细胞内的蛋白质错误折叠。目前可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具十分有限。本文介绍一种荧光寿命显微成像（FLIM）技术的操作方案，可非侵入性地监测并定量特定细胞（如神经元）中淀粉样纤维化的进程，适用于研究衰老过程以及蛋白质稳态网络受到扰动时的情况。FLIM技术不受荧光团表达水平的影响，能够在无需额外染色或光漂白的情况下对聚集过程进行分析。当荧光团靠近淀粉样结构时会发生淬灭，导致荧光寿命缩短；这种淬灭程度与淀粉样蛋白的聚集程度直接相关。FLIM是一种多功能技术，可用于在活体条件下以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或遗传背景下的纤维化过程。

引言

蛋白质聚集在衰老和疾病过程中均会发生。导致形成和沉积大分子淀粉样蛋白或无定形包涵体的通路难以追踪，其动力学过程同样难以解析。由于编码序列内的内在突变，蛋白质可能发生错误折叠，遗传性疾病即属此类情况。此外，维持蛋白质可溶性和正确折叠的蛋白质稳态网络（PN）若发生功能障碍，也会导致蛋白质错误折叠，这种情况在衰老过程中尤为常见。PN 包括分子伴侣和降解机制，负责蛋白质的生物合成、折叠、转运和降解¹。

C. elegans 因其寿命短、基因型一致且易于进行遗传操作，已成为研究衰老和疾病的模型生物。目前已构建出多种转基因 C. elegans 品系，可在易感组织中表达人类致病蛋白。重要的是，许多携带易聚集蛋白的品系能够重现淀粉样变性疾病的关键特征，即形成大的包涵体。得益于 C. elegans 通体透明的特性，这些蛋白聚集体可在活体中以非侵入性和非破坏性的方式被直接观察²。将任何目的蛋白（POI）与荧光蛋白融合表达，可使其定位、转运过程、相互作用网络及整体命运得以研究。

我们提出了一种通过荧光寿命成像显微技术（FLIM）在活体且衰老的C. elegans中监测致病蛋白聚集的实验方案。FLIM是一种基于荧光分子寿命而非其发射光谱的强大技术。寿命（tau, τ）定义为光子从激发态返回基态所需的平均时间。特定分子的寿命通过时间相关单光子计数（TCSPC）的时间域技术进行计算。在TCSPC-FLIM中，通过使用短而高频的激光脉冲激发荧光分子，并测量发射光子相对于脉冲到达探测器的时间，从而获得荧光衰减函数。在扫描样品时，每个像素生成一个三维数据阵列：该阵列包含光子在其x,y空间坐标上的分布及其时间衰减曲线的信息。因此，特定样品可转化为一幅寿命分布图，揭示有关蛋白质结构、结合状态及微环境的信息^3,4。每种荧光蛋白都具有固有且精确界定的寿命，通常为几纳秒（ns），取决于其理化性质。重要的是，荧光分子的寿命不受其浓度、荧光强度或成像方法的影响。然而，在生物系统中，它可能受到pH值、温度、离子浓度、氧饱和度以及相互作用伙伴等环境因素的影响。寿命也对分子内部结构变化和取向敏感。将荧光分子与目标蛋白（POI）融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光分子被包围或封装在紧密结合的环境中时（例如淀粉样结构中的反平行β折叠片层），会通过非辐射途径损失能量，这一过程称为淬灭⁵。荧光分子的淬灭导致其表观寿命缩短。当蛋白处于可溶状态时，其寿命将更接近原始的较高值；相反，当蛋白开始聚集时，其寿命必然向较低值偏移^6,7。因此，可以在活体C. elegans中不同年龄阶段监测任何形成淀粉样蛋白的聚集倾向。

本文介绍了一种用于分析包含不同多聚谷氨酰胺（CAG，Q）重复序列（Q40、Q44 和 Q85）的融合蛋白聚集的实验方案。我们展示了该技术可同样适用于多种荧光蛋白标记，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红色荧光蛋白（mRFP）；并可用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的所有组织，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白质稳态研究背景下，荧光寿命成像（FLIM）是一种观察分子伴侣耗竭后变化的有力工具。通过RNA干扰技术敲低关键分子伴侣之一——热休克蛋白1（hsp-1），可导致蛋白质过早错误折叠。而由衰老、疾病或分子伴侣功能缺陷所引起的蛋白聚集负荷增加，则表现为荧光寿命的降低。

方案

1. C. elegans 的同步化

1. 通过碱性次氯酸盐溶液处理或在 20 °C 下简单产卵 4 小时，使 C. elegans 同步化⁸。
2. 按照标准操作流程，在接种了 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）平板上，于 20 °C 培养并维持线虫的生长⁹。将线虫培养至所需发育阶段或指定日龄。
   注：在本方案中，年轻成虫在生命第 4 天进行成像，老年线虫在生命第 8 天进行成像。

2. 通过喂食实现RNAi介导的分子伴侣机器敲低

注意：通过将相应的RNAi载体喂食线虫，实现对热休克蛋白1（hsp-1）分子伴侣的敲低¹⁰。hsp-1 RNAi质粒来自Ahringer文库（克隆编号：F26D10.3）。

1. 在含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria Bertani (LB) 培养基中，将表达 hsp-1 RNAi 质粒的 HT115 (DE3) E. coli 培养 6 小时至过夜。
2. 制备新鲜的含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；1 mM）和氨苄青霉素（25 µg/mL）的 NGM 琼脂平板，并接种 hsp-1 RNAi 细菌。将平板晾干，并在室温下诱导 1–3 天。
3. 将同步化的线虫卵置于 siRNA 平板上使其孵化，或放置成年雌雄同体线虫，在 20 °C 下产卵 4 小时后移除成虫。将线虫培养至所需年龄或发育阶段。
   注意：第二代线虫可能表现出更强的基因敲低表型。此处描述的 siRNA 实验方案和条件为通用方法，并已针对 hsp1 进行调整。通过 siRNA 对特定克隆/基因进行的 RNA 干扰需由最终使用者自行建立并优化。需要注意的是，并非所有 siRNA 的效率相同，因此建议通过定量反转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）或蛋白质印迹法（Western blot）进行定量，以检测基因敲低的效果。

3. 显微镜载玻片的制备

1. 成像当天，首先准备成像载玻片。将琼脂糖溶于ddH₂O中，配制成3%（w/v）浓度的溶液，并稍作冷却。
2. 剪去1 mL移液器吸头的尖端，吸取约200 µL熔化的琼脂糖。将琼脂糖滴加至一块洁净的玻璃载片上，立即盖上另一块载玻片，注意避免产生气泡。静置使其干燥后，轻轻取下上层载玻片。最终得到表面均匀的琼脂糖载玻片，用于放置线虫。
   注意：每张载玻片可用于成像5–10条线虫。载玻片可提前制备，并在湿润的盒子中保存数小时，以防止琼脂糖干燥。

4. 将线虫固定到显微镜载玻片上

注意：荧光寿命成像（FLIM）需要将线虫固定。请在成像设备（如显微镜、激光器、探测器）准备就绪后进行此步骤。

1. 使用铂金丝挑取所需年龄的线虫，转移至新鲜的未接种培养板上，让其爬行以去除体表多余的OP50细菌。
2. 制备麻醉剂（叠氮化钠或左旋咪唑）以固定线虫。将 500 mM NaN₃ 4 °C 避光保存，并用新鲜的 ddH₂O 稀释₂O 至终浓度为 250 mM。若使用左旋咪唑（levamisole），将 20 mM 储存液稀释至 2 mM 工作液于 ddH₂O 中。₂O.
   警告：叠氮化钠（NaN₃）₃具有高毒性。操作时需佩戴手套和护目镜，并在通风橱中进行。
3. 在体视显微镜下操作，将10 µL麻醉剂滴加到琼脂糖垫上，轻轻转移5–10条线虫至液滴中。使用睫毛尖将线虫彼此分离，使其保持靠近但互不接触，以便在图像采集过程中更易于定位线虫。
4. 将线虫轻轻加盖盖玻片。封片后1小时内进行测量。
   注意：这两种麻醉剂最终都会导致死亡 秀丽隐杆线虫线虫在成像过程中必须完全保持静止，因为寿命图像是从每个像素记录的。任何移动都会影响 x,y 参数设置会阻止对同一激发像素的寿命读取。

5. FLIM 数据的采集

注意：在本方案中，荧光团的寿命通过时间域TCSPC方法获取。荧光寿命成像（FLIM）需要激光器以设定且恒定的重复频率产生光脉冲。重复频率因激光器类型而异，用户需明确该参数。寿命测量通过安装在常规显微镜旁的探测器和电子设备实现。在本方案中，分别使用两家企业提供的探测器和软件，在三种不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行mRFP、CFP和YFP寿命的测量（见材料表）。开始实验前，请确认激发/发射滤光片配置正确，并尽量减少背景信号或背光干扰。在开展任何实验之前，应先评估所选荧光团的光稳定性。若荧光团在短时间内于线虫组织内发生漂白，则不适用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）的FLIM测量。

1. 打开 FLIM 采集软件。该 FLIM 软件还可用于控制共聚焦显微镜。找到用于启用探测器输出的选项卡/按钮，并点击启用输出（Enable Outputs）。
2. 采集仪器响应函数（IRF），该函数用于描述仪器系统的定时精度。
   注意：建议在装载线虫之前完成此步骤。
   1. 如有条件，移除激发/发射滤光片。
   2. 在物镜上方放置一个空白盖玻片，并找到其表面。记录来自盖玻片的散射信号，持续时间不少于 30 秒。
      注意：对于几纳秒量级的荧光寿命，采集软件可自动估算 IRF 的偏移量。建议始终进行 IRF 的采集。
3. 将载有已固定 C. elegans 的载玻片放置于载物台上。使用 10 倍放大倍数的物镜在透射光模式下定位线虫在载玻片上的位置。
4. 取下载玻片，将物镜切换至 63 倍放大倍数，并添加所需的浸没介质（例如油）。将载玻片重新放回载物台，并再次定位线虫。
5. 在采集软件中找到针孔管理器（Pinhole Manager）并将其打开至最大（Maximum）。开始扫描样品，选择感兴趣区域（例如头部、上半身），并聚焦于其最大投影平面。
6. 监控激光脉冲频率以及软件界面上显示的另外三个参数：恒定分数判别器（CFD）、时间-幅度转换器（TAC）和模数转换器（ADC）。
   注意：激光的最大门控值应为 1 × 10⁸ 个单光子计数，该数值代表激光所能提供的最大光子数。CFD 提供探测器接收到单光子脉冲相对于激光脉冲的时间信息，该值通常约为 1 × 10⁵。TAC 用于区分一个光子被探测到的时间与下一个激光脉冲之间的时间差。最后，ADC 将 TAC 输出的电压信号转换为可存储的数字信号¹¹。CFD、TAC 和 ADC 的数值应大致相近，以确保荧光团发射的光子不会丢失。正确评估这些参数可保证采集到足够数量的光子，从而生成准确的寿命图谱。
7. 在 FLIM 软件界面上预览所检测到的光子数量：ADC 值应在 1 × 10⁴ 至 1 × 10⁵ 之间。如有必要，可调整焦平面或提高激光功率以采集更多光子。
   注意：通常情况下，每秒记录的光子数不应超过激光重复频率的 1%。
8. 在菜单栏中选择设置采集参数的选项卡，选中扫描同步输入（scan sync in）以启用单光子检测功能。
9. 将采集设置为固定时间或固定光子数量。例如，采集 2 分钟的寿命衰减曲线，或直到单个像素达到 2,000 次单光子事件。点击开始（Start）以启动采集。
   注意：不同荧光团需要不同的激发与发射激光及滤光片设置。根据样品的亮度，也可调整激光功率，这不会影响荧光寿命。本实验方案采用以下激发/发射设置：YFP ex500/em520-50 nm，mRFP ex561/em580-620 nm。CFP 测量采用脉冲双光子激光，激发波长为 800 nm，发射波长为 440 nm。获取 FLIM 图谱所需的时间和光子计数需根据每种实验装置和具体实验目的通过经验确定。

6. 使用 FLIMfit 软件分析 FLIM 数据

注意：使用伦敦帝国理工学院开发的 FLIMfit 软件工具进行数据分析¹²（见图1）。

1. 打开软件，通过文件 | 加载FLIM数据导入FLIM数据文件。加载来自同一实验条件的所有样本，即使这些样本来自不同的实验批次或不同的生物学重复。
2. 如有必要，可通过分割 | 分割管理器从任意FLIM图像中分割出单个线虫。将裁剪工具拖动至目标区域周围，直至该区域被高亮显示。完成后，点击确定。
   注意：所有图像均需进行分割。
3. 选择C. elegans强度图像中的一小块区域（图1，箭头1）。该区域的衰减曲线将显示在界面右侧的大衰减窗口中（图1，箭头2）。
   注意：衰减曲线可线性或对数形式显示。
4. 按照步骤6.5–6.8所述，设置正确的参数，通过软件算法外推荧光寿命。
5. 在数据选项卡中（图1，箭头3）：
   1. 设置一个任意的积分最小值，以排除过暗而无法获得良好拟合的像素。根据C. elegans样本的不同，该值通常在40–300之间。尝试输入不同数值，直至获得满意的预览效果。
   2. 设置时间最小值和时间最大值，将FLIM信号限制在该时间范围内，所有早于或晚于该阈值的事件将被排除。
      注意：例如，在分析mRFP时，排除早于800 ps和晚于4,000 ps的事件。这些数值取决于所用荧光团的寿命，需由用户自行确定。
   3. 请勿更改预设的光子计数/光子值（1）。
   4. 输入采集过程中所用激光器的重复频率（单位：MHz）。
      注意：在本实验方案中，使用了不同重复频率的激光器。用于CFP寿命采集的双光子激光器重复频率为80 MHz，YFP为40 MHz，mRFP为78.01 MHz。这些数值根据所分析的样本分别输入至FLIMfit软件中。
   5. 输入门控最大值，以排除所有饱和像素。
      注意：在C. elegans的寿命测量中，该值设为一个较大的数值（例如，1 × 10⁸）。
6. 在寿命选项卡中，选择拟合方式（例如，逐像素拟合）。参见图1，箭头4。
   注意：逐像素拟合将对每个像素单独进行衰减拟合；逐图像拟合将对每幅图像进行全局拟合，并为每幅图像提供一个寿命值；全局拟合将对整个数据集进行单一拟合，为所有图像提供一个统一的寿命值。
7. 除非已知所选荧光衰减为多指数衰减且具有多个寿命，否则请勿更改其他任何参数，仅可调整指数数量（No. Exp）。
   注意：在本实验方案中，该功能用于计算双指数CFP荧光团的寿命。
8. 通过IRF菜单上传仪器响应函数（IRF）：IRF | 加载IRF。为估算IRF偏移量，选择IRF | 估算IRF偏移量。一组数值将自动显示在IRF选项卡中。一旦确定，请勿更改该选项卡中的其他任何参数。
9. 所有参数设置完成后，点击拟合数据集（图1，箭头5）。算法将对衰减曲线进行拟合，并为每幅图像确定一个寿命值。
   注意：拟合结果以蓝色线条标出，应与所有事件点重合。当所有事件点均沿拟合曲线分布时，表明获得了良好的拟合。
10. 点击软件界面右上角菜单中的参数选项卡（图1，箭头6），选择统计量：w_mean（加权平均），并确认chi2值尽可能接近1。
    注意：chi2值接近1表明拟合结果准确。所选图像的寿命值将以tau_1形式显示。
11. 导出所需信息：文件 | 导出强度图像/拟合结果表格/图像/直方图。保存用于计算寿命的数据设置：文件 | 保存数据设置。
    注意：所使用的参数将被保存，以便将来分析相同类型的样本时使用。

7. FLIM 数据的图形化表示

注意：来自不同样品的寿命可以通过多种方式直观表示。请选择以纳秒或皮秒为单位表示寿命值。

1. 通过直接从 FLIMfit 导出衰减曲线，展示拟合的质量和曲线的准确性。
2. 通过绘制光子计数频率与寿命值的直方图，表示光子的分布情况。
3. 最后，进行统计学比较时，若需比较两个或多个样本，将寿命值及其平均值的标准偏差以散点图柱状图形式呈现，并执行所需的统计分析。

结果

本实验方案展示了如何在活体 C. elegans 中精确监测聚集物的形成过程，无论是在其自然衰老过程中，还是在受到外界压力条件下。我们选用了四种不同的转基因线虫品系，分别表达含有40Q、44Q或85Q重复序列的多聚谷氨酰胺蛋白。这些蛋白在不同组织中合成，并与不同的荧光蛋白融合。C. elegans 品系分别在体壁肌中表达Q40-mRFP（mQ40-RFP），在神经系统中表达Q40-CFP（nQ40-CFP），以及在肠道中表达Q44-YFP或Q85-YFP（iQ44-YFP和iQ85-YFP）¹³。为了说明衰老如何促进蛋白聚集，我们分别在生命第4天（年轻期）和第8天（老年期）收集了这些多聚Q品系的聚集情况。为了展示蛋白质稳态系统（PN）功能缺陷的影响，我们在mQ40-RFP和nQ40品系中进行了hsp-1基因的敲低实验。

通过FLIMfit软件对寿命值进...

讨论

本文所述方案介绍了一种基于显微镜的技术，用于在 C. elegans 模型系统中鉴定聚集态蛋白。通过测量与荧光团融合的蛋白的荧光寿命衰减，荧光寿命成像（FLIM）可准确表征聚集态和可溶态蛋白的存在。当融合蛋白开始聚集时，其记录的平均寿命将从较高值向较低值偏移¹⁶。由此可通过寿命的降低程度推断聚集倾向：寿命越低，表明系统中聚集态蛋白的含量越高。因此，该方法可用于追踪衰老、疾病或蛋白质稳态网络（PN）功能障碍对任意蛋白聚集倾向的影响。

为了突出该技术的多功能性，我们的结果明确表明，无论组织或荧光团类型如何，荧光寿命成像（FLIM）均能够识别不同多聚谷氨酰胺（polyQ）结构的构象变化。尤为重要的是，FLIM 已成功应用于线虫（C. elegans）中其他易聚集蛋白的表征，例如 α-突触核蛋白¹⁷。此外，可在 C. elegans 中施加任意应激因素，并实时追踪任意目标蛋白（POI）的去折叠与聚集过程。渗透压、金属离子、氧化还原或化学应激均...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂-琼脂 Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM 组分
Ahringer文库 hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
氨苄青霉素	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	抗生素
B&H DCS-120 SPC-150	贝克尔 & Hickl GmbH		FLIM 采集软件
B&H SPC830-SPC 图像	贝克尔 & Hickl GmbH		FLIM 采集软件
BD Bacto 蛋白胨	BD生物科学	211677	NGM 组分
秀丽隐杆线虫 iQ44-YFP	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）	OG412
秀丽隐杆线虫 iQ85-YFP			Morimoto 实验室惠赠
秀丽隐杆线虫 mQ40-RFP			莫里莫托实验室惠赠
秀丽隐杆线虫 nQ40-CFP			Morimoto 实验室惠赠
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	盖玻片
异丙基-β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	徕卡相机股份公司		体视显微镜安装
Leica TCS SP5	徕卡相机股份公司		共聚焦显微镜
盐酸左旋咪唑	AppliChem GmbH	A4341	麻醉剂
OP50 大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM 采集软件
叠氮化钠	卡尔·罗斯有限责任公司	K305.1	麻醉剂
氯化钠	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM 组分
标准物镜äger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	载玻片
通用琼脂糖	生物 & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	卡尔·蔡司股份公司		共聚焦显微镜
蔡司 LSM510-Meta NLO	卡尔·蔡司股份公司		共聚焦显微镜