Method Article

使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征

DOI:

10.3791/61004

⸱

March 27th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund Berlin, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Molecular Neuroscience Group, Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 4Cell Biology, University of Bremen

In This Article

Summary

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荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。

Abstract

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淀粉样纤维与一些神经退行性疾病有关，如亨廷顿舞蹈症、帕金森氏症或阿尔茨海默氏症。这些淀粉样蛋白纤维能隔离内源性转移稳定蛋白以及蛋白酶网络（PN）的成分，从而加剧细胞中的蛋白质错折叠。可用于评估动物体内淀粉样蛋白聚集过程的工具数量有限。我们提出了荧光寿命显微镜（FLIM）的协议，允许监测和定量特定细胞（如神经元）中的淀粉样蛋白纤维化，以非侵入性的方式，随着老化的进展和扰动PN。FLIM 独立于荧光道的表达水平，能够分析聚合过程，而无需任何进一步的染色或漂白。当荧光波在淀粉样结构附近时，荧光波会发出淬火，从而导致荧光寿命的缩短。淬火与淀粉样蛋白的聚合直接相关。FLIM 是一种多功能技术，可应用于以非侵入性方式比较不同淀粉样蛋白、环境刺激或体内遗传背景的纤维化过程。

Introduction

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蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解1。

由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性2中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。

我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧....

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Protocol

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1. C. 埃勒甘的同步

  1. 通过碱性次氯酸盐溶液处理或通过简单的卵子在20°C8下铺4小时，同步C.elegans。
  2. 根据标准程序9，在用OP50大肠杆菌种子的线虫生长介质（NGM）板上生长并保持线虫在20°C。将线虫老化到所需的发育阶段或一天。
    注意:在这个协议中，年轻人在第4天被成像，旧线虫在生命的第8天被成像。

2. RNAi 通过喂食对伴郎机械进行敲击

注:通过将相应的RNAi载体喂给线虫10，对热冲击蛋白1（hsp-1）的伴子进行击倒。hsp-1 RNAi 质粒是从 Ahringer 库（克隆 ID:F26D10.3）获得的。

  1. 生长HT115 （DE3）大肠杆菌，在 Luria Bertani （LB） 介质中，在含有 50 μg/mL 氨基霉素的介质中，将hsp-1 RNAi 质粒表达 6 小时到过夜。
  2. 准备含有同丙基β-D-1-硫酰氨基（IPTG;1 mM）和氨基霉素（25微克/米L）和含有hsp-1 RNAi细菌的种子的新鲜NG....

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Results

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该协议展示了如何准确监测在生物的C.elegan人中聚合物种的形成，无论是在自然老化期间还是在承受压力时。我们选择了四种不同的转基因线虫菌株，用于表达40Q、44Q或85Q重复的多谷氨酰胺蛋白。这些蛋白质在不同的组织中合成，并融合到不同的荧光波中。C. elegans菌株要么在体壁肌肉 （mQ40-RFP） 中表示 Q40-mRFP，在神经系统（nQ40-CFP）中表达 Q40-CFP，要么在肠道中 Q44-YFP 或 Q85-YFP（iQ44-YFP 和 iQ85-YFP）13。为了说明衰老如何促进聚合，我们收集了年轻线虫的这些多Q菌株的终生，在生命的第4天，和老线虫，在第8天。为了显示 PN 缺陷的影响，我们在 mQ40-RFP 和 nQ40 菌株中进行了hsp-1的击倒。

一旦通过 FLIMfit 软件推断寿命值，获得的数据显示，由于谷氨酰胺负载.......

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Discussion

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此处介绍的协议描述了一种基于显微镜的技术，用于识别C. elegans模型系统中的聚合物种。FLIM可以通过测量荧光寿命衰变，准确描述融合到荧光磷的聚合和可溶性物种的存在。当融合蛋白开始聚合其记录的平均寿命将从更高值转移到较低的值16。然后，聚合的倾向可以通过寿命的下降来推断:寿命越低，系统中聚合蛋白物种的存在就越高。因此，有可能跟随PN的老化、疾病或损伤对任何蛋白质的聚集倾向的影响。

为了突出该技术的多功能性，我们的结果表明，FLIM 能够识别各种聚Q结构的结构变化，而不管组织或荧光波。重要的是，FLIM已经成功地应用于C.elegans中其他容易聚集的蛋白质的表征，如β-核核素17。此外，可以将任何应力因子应用于C. elegans，并遵循任何 POI 的展开和聚合。渗透、金属电、氧化还原或化学应力都可促进毒性失衡，在使用FLIM的C.elegans中可以成功地监测这些不平衡。反过来也是可能的:由于存在有益化合物.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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由国家卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的CGC提供的肌肉-Q40-mRFP菌株。神经元Q40-CFP是森本实验室的一种礼物。我们承认DFG（KI-1988/5-1到JK，神经Cure博士奖学金由神经Cure卓越集群到MLP），EMBO（短期奖学金MLP）和生物学家公司（旅行赠款CG和MLP）为资助。我们还感谢柏林马克斯·德尔布吕克分子医学中心的高级光显微镜成像设施，该设施为图像 YFP 结构提供了设置。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
琼脂-琼脂 Kobe ICarl Roth GmbH + Co. KG5210.2NGM 成分
Ahringer 文库 hsp-1 siRNA来源 BioScience UK LimitedF26D10.3
氨苄青霉素Carl Roth GmbH + Co. KGK029.3抗生素
B&H DCS-120 SPC-150贝克尔 &Hickl GmbHFLIM 收购软件
B&H SPC830-SPC 图像贝克尔 &Hickl GmbHFLIM 收购软件
BD Bacto 蛋白胨BD-Bionsciences211677NGM 组件
秀丽隐杆线虫 iQ44-YFP遗传学中心 （CGC）OG412
C. 秀丽隐杆线虫 iQ85-YFP森本实验室的善意礼物
秀丽隐杆线虫 mQ40-RFP森本实验室的亲切礼物
C. elegans nQ40-CFP来自森本实验室的善意礼物
Deckgläser-18x18mmCarl Roth GmbH + Co. KG0657.2盖玻片
异丙基-β;-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）Carl Roth GmbH + Co. KG2316.4
徕卡 M165 FC徕卡相机 AG安装立体显微镜
徕卡 TCS SP5徕卡相机 AG共聚焦显微镜
盐酸左旋咪唑AppliChem GmbHA4341麻醉剂
OP50 大肠杆菌CAENORHABDITIS GENETICS CENTER （CGC）OP50
PicoQuant PicoHarp300PicoQuant GmbHFLIM 收购软件
叠氮化钠Carl Roth GmbH + Co. KGK305.1麻醉剂
钠Carl Roth GmbH + Co. KG3957.2NGM 组件
Standard-ObjektträgerCarl Roth GmbH + Co. KG0656.1载玻片
Universal AgaroseBio &Sell GmbHBS20.46.500
蔡司 AxioObserver.Z1卡尔蔡司 AG共聚焦显微镜
蔡司 LSM510-Meta NLO卡尔蔡司 AG共聚焦显微镜
秀丽隐杆线虫 来自氯化

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
  2. Kikis, E. A. The struggle by Caenorhabditis elegans to maintain proteostasis during aging and disease. Bio....

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