使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征

蛋白质聚集发生在衰老和疾病。导致大型淀粉样蛋白或非晶体内含物形成和沉积的路径难以遵循，它们的动力学同样难以解开。蛋白质可能由于编码序列中的内在突变而错折叠，如遗传疾病。蛋白质也折叠不当，因为保持蛋白质解病网络（PN）保持其可溶性和正确折叠是受损的，就像老化期间一样。PN包括分子护护和降解机，负责蛋白质的生物成因、折叠、贩运和降解^1。

由于寿命短、等源性以及易于遗传操作，Elegans已成为研究衰老和疾病的模型。几种在脆弱组织中表达人类致病蛋白质的C.elegans转基因菌株已经产生。重要的是，许多含有容易聚集的蛋白质的菌株重述淀粉样蛋白紊乱的特征，即大内含物的形成。多亏了C.elegans的透明身体，这些骨料可以在体内、非侵入性和非破坏性²中可视化。与氟磷融合产生任何感兴趣的蛋白质 （POI） 可以调查其位置、贩运、交互网络和一般命运。

我们通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）来监测生命和衰老C.elegans中致病蛋白的聚集情况。FLIM 是一种基于荧光素寿命的强大技术，而不是其发射光谱。生存期（tau，*）定义为光子从兴奋状态衰减到其接地状态所需的平均时间。给定分子的寿命使用时间相关单光子计数 （TCSPC） 的时域技术计算。在TCSPC-FLIM中，荧光衰减功能是通过用短、高频激光脉冲刺激荧光光，并测量发射的光子到达时间到探测器的脉冲。扫描样本时，会为每个像素创建一个三维数据数组:数组包括有关光子在其x、y空间坐标及其时间衰减曲线中的分布的信息。因此，给定的样本成为揭示蛋白质结构、结合和环境^信息,的终身^图。每个荧光蛋白都有内在和精确定义的寿命，通常只有几纳秒（ns），取决于其物理化学性质。重要的是，荧光磷的寿命与其浓度、荧光强度和成像方法无关。然而，在生物系统中，它受到环境因素的影响，如pH、温度、电子浓度、氧饱和度及其相互作用伙伴。使用寿命对内部结构变化和方向也十分敏感。将荧光磷与POI融合会导致其寿命发生变化，从而提供有关融合蛋白行为的信息。当荧光波被包围或封装在紧密结合的环境中，如淀粉样蛋白结构的反平行β片时，它非辐射性地失去能量，这个过程称为淬火^5。荧光道的淬火导致其明显寿命缩短。当可溶性时，蛋白质的寿命将更接近其原始、更高的价值。相反，当蛋白质开始聚集时，其寿命将不可避免地转移到较低的值^66，7。7因此，在活的C.elegans的不同年龄监测任何淀粉样蛋白的聚集倾向成为可能。

在这里，我们描述了一种协议，用于分析融合蛋白的聚合，该蛋白包含不同的多谷氨酰胺（CAG，Q）拉伸（Q40、Q44和Q85）。我们说明了该技术如何同样应用于不同的荧光蛋白，如青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和单体红荧光蛋白（mRFP）;和在C.elegans的所有组织中，包括神经元、肌肉和肠道。此外，在蛋白酶的上下文中，FLIM是观察分子护工消耗时变化的非常有用的工具。通过RNA干扰击倒关键分子伴之一，热休克蛋白1（hsp-1）会产生蛋白质过早的误折叠。由于老化、疾病或陪护器不足而增加的聚合载荷，然后作为荧光寿命的缩短来衡量。

1. C. 埃勒甘的同步

1. 通过碱性次氯酸盐溶液处理或通过简单的卵子在20°C⁸下铺4小时，同步C.elegans。
2. 根据标准程序^9，在用OP50大肠杆菌种子的线虫生长介质（NGM）板上生长并保持线虫在20°C。将线虫老化到所需的发育阶段或一天。
   注意:在这个协议中，年轻人在第4天被成像，旧线虫在生命的第8天被成像。

2. RNAi 通过喂食对伴郎机械进行敲击

注:通过将相应的RNAi载体喂给线虫^10，对热冲击蛋白1（hsp-1）的伴子进行击倒。hsp-1 RNAi 质粒是从 Ahringer 库（克隆 ID:F26D10.3）获得的。

1. 生长HT115 （DE3）大肠杆菌，在 Luria Bertani （LB） 介质中，在含有 50 μg/mL 氨基霉素的介质中，将hsp-1 RNAi 质粒表达 6 小时到过夜。
2. 准备含有同丙基β-D-1-硫酰氨基（IPTG;1 mM）和氨基霉素（25微克/米L）和含有hsp-1 RNAi细菌的种子的新鲜NGM agar板。将板晾干，并在室温下诱导 1-3 天。
3. 将同步的卵子放在siRNA板上，然后离开孵化，或放置肉汁线虫，允许在20°C下产卵4小时，然后再取出。长线虫，直到所需的年龄或阶段。
   注:第二代线虫可能呈现更强烈的击倒表型。此处描述的 siRNA 协议和条件是一般性的，并适应hsp1。通过特定克隆/基因的siRNA的RNA干扰需要由最终用户建立和优化。需要注意的是，并非所有siRNA都具有相同的效率，因此建议通过定量反向转录聚合酶链反应（RT-qPCR）或西式斑点进行定量定量测试击倒的功效。

3. 准备显微镜幻灯片

1. 在成像当天，首先准备成像幻灯片。在 ddH₂O 中熔化琼脂，浓度为 3%（w/v），稍稍冷却。
2. 切掉 1 mL 移液器尖端的尖端，取大约 200 μL 的熔融琼脂。将阿加松移到干净的玻璃滑道上，并立即将第二个滑道放在顶部，避免形成任何气泡。待干燥并轻轻取下顶部玻璃滑块。结果是一个玻璃幻灯片与均匀的琼脂表面，线虫将被定位。
   注:每张幻灯片将用于在 5-10 线线之间成像。幻灯片可以准备和储存几个小时在一个腐殖质的盒子，以防止琼脂干涸。

4. 将线虫安装到显微镜幻灯片上

注:FLIM要求线虫被固定。一旦成像设置（例如显微镜、激光器、探测器）可供使用，即可执行此步骤。

1. 使用铂线采摘，将所需年龄的线虫放在一个新的非种子板上，让他们爬行，从他们体内去除多余的OP50细菌。
2. 准备麻醉化合物（氧化钠或列维索）以固定线虫。在 4 °C 的暗中保持 500 mM NaN₃库存，并在新鲜的 ddH₂O 中稀释至最终浓度为 250 mM。如果使用 levamisole，在 ddH₂O 中将 20 mM 库存稀释为 2 mM 工作溶液。
   注意:氧化钠（NaN_3）是剧毒的。使用手套和防护眼镜，在通风罩下工作。
3. 在立体显微镜下工作，将10μL的麻醉化合物滴放在琼脂垫上，轻轻将5-10线虫转移到其中。使用睫毛尖端分隔线虫。将它们紧密地放在一起，但不接触，以便在图像采集期间更轻松地定位线虫。
4. 小心地用盖玻片覆盖线线。安装后在 1 小时内进行测量。
   注:两种麻醉剂最终将杀死C.埃勒根。线虫在成像过程中必须完全不可移动，因为生存期的地图是从每个像素记录的。x、y参数的任何移动都阻止在同一激发像素下读取生存期。

5. 获取 FLIM 数据

注:在此协议中，氟磷的寿命通过时域 TCSPC 方法获得。FLIM 要求激光以一组和恒定的重复率生成光脉冲。重复率因激光类型而异，用户需要知道。使用传统显微镜安装的探测器和电子设备可实现终身测量。在该协议中，测量在三个不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行测量，分别由两个不同的公司（材料表）提供探测器和软件，用于获取mRFP、CFP和YFP寿命。检查正确的发射/激励滤镜是否到位，并在启动前最小化任何背景或监控背光。在开始任何实验之前，确定所选荧光波的光稳定性。如果荧光磷在线虫组织内在短时间内漂白，则不适合在C.elegans中进行FLIM测量。

1. 打开 FLIM 获取软件。FLIM 软件还允许控制共聚焦显微镜。找到选项卡/按钮以启用探测器的输出，然后按"启用输出"。
2. 获取仪器响应功能 （IRF），该功能描述了仪器装置的时序精度。
   注:在安装线虫之前，最好执行此步骤。
   1. 如果可用，请拆下激励/发射过滤器。
   2. 将空盖玻片放在目标上方并查找其表面。记录从盖玻片获得的散射信号至少 30 s。
      注:对于几纳秒的使用寿命，采集软件可以自动估计 IRF 偏移。始终建议获取 IRF。
3. 将带有安装的 C. elegans 的幻灯片放在舞台上。在传输模式下使用 10 倍放大镜，并本地化滑道上的线虫位置。
4. 拆下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜，并应用所需的浸入介质（例如机油）。替换舞台上的幻灯片并本地化线虫。
5. 在采集软件上找到针孔管理器，并将其打开至最大值。开始扫描样本，选择感兴趣的区域（例如头部、上半身），并专注于其最大投影平面。
6. 监控激光脉冲速率和软件接口上存在的三个其他值:恒定分数鉴别器（CFD）、振幅时间（TAC） 和模拟到数字转换器（ADC）。
   注: 激光的最大门应为 1 x 10⁸单个光子计数。此数字表示激光提供的光子的最大数量。CFD 提供有关通过探测器参考激光脉冲接收单个光子脉冲的信息。此值应约为 1 x 10⁵。TAC 区分检测到一个光子的时间和下一个激光脉冲。最后，ADC将TAC电压转换为可存储器信号^11。CFD、TAC 和 ADC 都应具有类似的值，以确保氟磷发出的光子不会丢失。正确评估这些参数可确保收集足够的光子以创建准确的生存期贴图。
7. 在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量:ADC 值应介于 1 x 10⁴和 1 x 10^{5 之间}。如有必要，将焦点转移到不同的平面上，或增加激光功率以收集更多的光子。
   注:通常，每秒记录的光子数量不应超过激光重复率的 1%。
8. 在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。
9. 将采集设置为固定的时间量或固定数量的光子。例如，获取生存期衰减曲线 2 分钟，或直到单个像素达到 2，000 个单个事件的光子计数。按"开始"开始采集。
   注:不同的荧光源需要不同的激励和发射激光器和过滤器。根据样品的亮度，激光功率也可以调整，不会干扰寿命。这些协议使用以下激励/发射设置:YFP ex500/em520-50 nm，mRFP ex561/em580-620 nm。使用 ex800/em440 nm 进行 CFP 测量时使用了脉冲双光子激光器。需要为每个设置和每个实验目的建立获取 FLIM 地图所需的时间和光子计数量。

6. 使用 FLIMfit 软件分析 FLIM 数据

注:使用伦敦帝国学院¹²开发的 FLIMfit 软件工具进行数据分析（参见图 1）。

1. 打开软件并通过文件导入 FLIM 数据文件 |加载 FLIM 数据。加载一个条件中的所有样品，即使在不同的会话和从不同的生物重复获得。
2. 如有必要，通过分割从任何 FLIM 图片中分割单个线虫|分段管理器。围绕感兴趣区域拖动裁剪工具，直到突出显示。完成后，按"确定"。
   注:必须对所有图像进行分割。
3. 选择出现C. elegans基于强度的图像的小区域（图 1，箭头 1）。该区域衰减曲线将显示在界面右侧的大衰变窗口中（图 1，箭头 2）。
   注: 衰减可以线性显示或以对数方式显示。
4. 设置正确的参数，以便通过软件的算法推断生存期，如步骤 6.5-6.8 中所述。
5. 在"数据"选项卡上（图 1，箭头 3）:
   1. 设置任意的"集成最小值"以排除任何太暗而无法产生良好拟合的像素。根据C. elegans样本，此值从 40-300 不等。输入不同的值，直到达到令人满意的预览。
   2. 选择时间最小值和时间最大值，将 FLIM 信号限制为这些值。将排除在此阈值之前和之后出现的所有事件。
      注:例如，对于 mRFP 的分析，排除了 800 ps 之前和 4，000 ps 之后的事件。这些值取决于荧光器的生存期，需要由最终用户确定。
   3. 请勿更改预设的计数/光子1。
   4. 输入采集过程中使用的激光的重复率（以MHz为单位）。
      注:对于目前的协议，使用不同的激光器与不同的重复率。用于采集CFP寿命的两个光子激光具有80兆赫的重复率，YFP激光在40兆赫时重复，mRFP的重复率为78.01 MHz。根据分析的样本，这些值被输入到FLIMfit中。
   5. 输入门最大值以排除所有饱和像素。
      注: 对于C. elegans的生命周期测量，此值设置为任何大数（例如，1 x 10^8）。
6. 在"生存期"选项卡上，选择要使用的全局拟合件（例如，像素拟合）。参见图 1，箭头 4。
   注:像素拟合将产生贴切到每个单个像素。图像拟合将生成每个单个图像的全局拟合，并显示每个图像的单个生存期值。全局拟合将在整个数据集中生成单个拟合。为所有图像提供单个生存期值。
7. 除No.如果已知所选荧光衰变是多指数的，并且表现出超过一个寿命，则 Exp 选择。
   注:在本协议中，此函数用于计算双指数 CFP 荧光磷的使用寿命。
8. 通过 IRF 菜单上传 IRF: IRF |负载 IRF.要估计 IRF 移位，请选择IRF |估计 IRF 移位。IRF选项卡上将自动显示一组值。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。
9. 设置所有参数后，按"拟合数据集"（图 1，箭头 5）。该算法将生成适合衰减曲线的算法，并为每个图像建立生存期值。
   注: 生成的拟合（以蓝线突出显示）应与所有事件重叠。当所有事件沿配合对齐时，获得良好的配合。
10. 单击位于软件界面右上角菜单中的参数选项卡（图 1，箭头 6），然后选择"统计:w_mean（加权平均值）并检查chi2值是否尽可能接近 1。
    注: 接近一个的 chi2可确保配合的准确性。因此，所选图像的生存期值以tau_1的形式显示。
11. 导出任何感兴趣的信息:文件 |导出强度图像/拟合结果表/图像/直方图。保存用于计算生存期的数据设置:文件|保存数据设置。
    注: 所使用的参数将被保存，以便将来分析所选样本。

7. FLIM 数据的图形表示

注: 从不同样本收集的生存期可以以不同的方式直观地表示。选择该选择以纳秒或 pco 秒表示生存期值。

1. 通过直接从 FLIMfit 导出衰变曲线来显示拟合的质量和曲线的精度。
2. 通过在直方图中绘制光子计数的频率和生存值来表示光子的分布。
3. 最后，为了进行统计比较，如果比较两个或多个样本，则在散点图条图中放置生存值加上平均值的标准差。执行任何所需的统计分析。

该协议展示了如何准确监测在生物的C.elegan人中聚合物种的形成，无论是在自然老化期间还是在承受压力时。我们选择了四种不同的转基因线虫菌株，用于表达40Q、44Q或85Q重复的多谷氨酰胺蛋白。这些蛋白质在不同的组织中合成，并融合到不同的荧光波中。C. elegans菌株要么在体壁肌肉 （mQ40-RFP） 中表示 Q40-mRFP，在神经系统（nQ40-CFP）中表达 Q40-CFP，要么在肠道中 Q44-YFP 或 Q85-YFP（iQ44-YFP 和 iQ85-YFP）13。为了说明衰老如何促进聚合，我们收集了年轻线虫的这些多Q菌株的终生，在生命的第4天，和老线虫，在第8天。为了显示 PN 缺陷的影响，我们在 mQ40-RFP 和 nQ40 菌株中进行了hsp-1的击倒。

一旦通过 FLIMfit 软件推断寿命值，获得的数据显示，由于谷氨酰胺负载、老化或应力，聚合时，任何聚Q构造的生命周期明显减少。FLIM通过记录其寿命的变化，区分可溶性蛋白质分数和聚合物种及其过渡。

在第 4 天，mQ40-RFP 的平均荧光寿命为 1.69 ns（图 2）。老化后，出现更聚合的物种，在生命图像中显示为低寿命的foci，并将直方图转移到寿命缩短（图2A）。通过绘制线虫年龄内每个获得的图像的平均荧光寿命，荧光寿命显著缩短，因此聚合物种的积累变得可见（图2B）。PN的蛋白质折叠能力在C.elegans14生命的第4天后下降，而容易聚集的蛋白质进一步被误折叠成淀粉样蛋白和非晶态骨料。除PN外，某种蛋白质的内在聚合倾向在聚集形成的进展中起着重要的作用。通过比较iQ44-YFP和iQ85-YFP的行为来分析这一点。iQ85的较长Q拉伸更容易聚集，并且在生命的第4天已经出现荧光寿命变化（图3A）。事实上，在第4天，为iQ85观测到foci形成，而在iQ44中仍然不存在。然而，当老化时，iQ44也表现出foci形成，从而减少荧光寿命。由于iQ85在成年早期就已经显示出聚合体，因此在衰老时聚合的进展不太明显，但显著性（图3B）。最后，我们没有检测到在nQ40-CFP应变中形成，也没有减少荧光寿命（图4A）。对于这种菌株，在老化时平均荧光寿命只有细微的、非显著的变化（图4B），这可能是由于神经元由于未知的原因不太容易受到影响。

击倒hsp-1对 mQ40 和 nQ40 表示线虫的 PN 提出了挑战。RNAi 介导的hsp-1损耗导致聚合显著增加（图 5和图6）。Q40表示在体壁肌肉往往形成少量的大皮，周围非聚合物质。这导致直方图中出现两个可区分的峰值（约 1.7 ns 和 1.4 ns，参见图 5A）。老年人和RNAi治疗线虫在低寿命峰值中表现出强劲增长，最终减少了平均荧光寿命（图5B）。与肌肉中Q40的这种双相行为相比，神经元Q40表现出更加多样化的聚集行为。我们不能直接关联foci形成与聚合，如在肌肉表达应变（图6A）。由于FLIM提供了一个评估聚合程度的机会，直方图显示，没有明显的峰值，但荧光寿命的广泛分布，指向不同寡聚物和高阶聚合的复杂组成。尽管如此，通过绘制平均荧光寿命（图6 B），可以评估聚合的总体程度（图6B），表明hsp-1的击倒导致了聚合的提升。

需要注意的是，无聚变伙伴和生物系统外部的氟脑生物的使用寿命更高。由于生命周期主要受其环境影响，因此在 C. elegans组织中，YFP 和 RFP 的寿命略有缩短。因此，重要的是获得可溶性POI在线虫内的使用寿命作为适当的控制。然后，可以比较寿命较高的可溶性分数和寿命较低的聚合分数。在这里，寿命的减少与肌肉和肠道细胞内可见肌的形成有关。尽管如此，一小部分的烟叶没有减少荧光寿命（参见图2和图3，白色箭头）。此功能突出显示了如何在特定时空点聚合融合构造的一部分，以及未绑定蛋白质的存在和可用性。神经元Q40-CFP菌株的调查出现了更复杂的情况。CFP本质上拥有两种独特的荧光寿命。虽然 CFP 是 Fürster 共振能量转移 （FRET）15测量的理想荧光波，结合 YFP，不建议将其用于监测C. elegans中的聚合体形成。

图 1:FLIMFit 软件界面的屏幕截图。用于计算荧光寿命的软件的屏幕截图。窗口描述在文本中定义设置并执行生存期计算后接口。编号箭头是指协议中的特定步骤。请点击此处查看此图形的较大版本。

图2:肌肉Q40-RFP的荧光寿命随年龄下降。（A） 代表地图的C. elegans表达肌肉 Q40-RFP 在生命的第 4 天或第 8 天由 FLIMfit 生成。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。

图3:肠道Q44-YFP和肠道Q85-YFP的荧光寿命随年龄下降。（A） 代表地图的C. elegans表达肠道Q44-YFP或肠道Q85-YFP在生命的第4天或第8天由FLIMfit产生。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。

图4:神经元Q40-CFP的荧光寿命不随年龄变化而变化。（A）代表的 C. elegans表达神经元 Q40-CFP 在 FLIMfit 生成的生命的第 4 天或第 8 天。提供荧光寿命、荧光强度和两者合并的图像（所有样本中都指示第二个生存期 +2）。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命。请点击此处查看此图形的较大版本。

图5:肌肉Q40-RFP的荧光寿命在hsp-1击倒后减少。（A） 代表地图的C. elegans表达肌肉 Q40-RFP 在生命的第 4 天或第 8 天由 FLIMfit 生成。将显示荧光寿命和强度图的合并。在这两个时间点，线虫生长在细菌表示一个空载体（控制）或细菌表示hsp-1RNAi构造。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图分别显示生命第 4 天或第 8 天所有分析动物的加权平均荧光寿命，分别具有对照或hsp-1 RNAi。请点击此处查看此图形的较大版本。

图6:神经元Q40-CFP的荧光寿命在hsp-1下击后减少。（A）代表的 C. elegans表达神经元 Q40-CFP 在 FLIMfit 生成的生命的第 4 天。将显示荧光寿命和强度图的合并。显示的线虫生长在表达空载体（控制）的细菌或表达hsp-1 RNAi构造的细菌上。比例尺 = 25 μm. 直方图显示所有分析的线虫的测量寿命分布，分为 100 个类别。（B） 条形图显示所有被分析动物在第 4 天的加权平均荧光寿命，控制 RNAi 或hsp-1 RNAi。请点击此处查看此图形的较大版本。

作者没有什么可透露的。