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方法文章

人眼供体后段中调控眼内压与颅内压的跨层自主系统模型

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DOI：

10.3791/61006

⸱

2020年4月24日

 ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center, 2Mechanical Engineer Consultant, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin

本文内容

摘要

我们描述并详细说明了经筛板自主系统的使用。该系统利用人体眼球后段，独立调节眼内压（眼内）和视神经周围颅内压（颅内压），从而产生一种模拟青光眼性视神经病变特征的经筛板压力梯度。

摘要

目前尚缺乏一种能够利用颅内压（ICP）和眼内压（IOP）在体外靶向疾病病因的新型临床前人类模型，以识别与青光眼发病机制相关的多种致病范式。 既往已成功建立并应用体外人眼前段灌注器官培养模型，作为发现青光眼发病机制和测试治疗方法的有效技术。在体外人类器官系统上开展的临床前药物筛选和研究，其结果更易于向临床研究转化。本文详细描述了一种新型体外人眼跨层压模型——跨层自主系统（translaminar autonomous system, TAS）的构建与操作方法。TAS模型可利用人供体后段组织独立调控ICP和IOP，从而以临床前方式研究疾病发病机制，并有助于减少眼科研究中活体动物的使用。与体外实验模型相比，视神经乳头（ONH）组织的结构、复杂性和完整性在体外TAS模型中亦可得以维持。

引言

最近的调查数据显示，全球约有2.85亿人患有视力障碍，其中包括3900万盲人1。2010年，世界卫生组织记录指出，在列出的九种主要致盲原因中，有三种发生于眼球后段1。后段眼病涉及视网膜、脉络膜和视神经2。视网膜和视神经是大脑中枢神经系统（CNS）的延伸部分。视网膜神经节细胞（RGC）的轴突因需穿过视神经乳头（ONH）形成视神经而易受损伤3。由于存在一种称为筛板（lamina cribrosa, LC）的三维结缔组织梁网结构，ONH仍是RGC 轴突最脆弱的部位4。在青光眼中，ONH是RGC轴突最早受到损害的部位5,6,7，并且已有研究在高眼压和青光眼模型中探讨了ONH内的基因表达变化8,9,10。RGC轴突在ONH处的易损性与眼内腔（即眼内压，IOP）和外部视神经周围蛛网膜下腔（即颅内压，ICP）之间的压力差有关11。LC区域分隔这两个腔隙，维持正常的压力梯度，其中IOP通常为10–21 mmHg，ICP为5–15 mmHg12。两个腔室之间通过筛板产生的压力差称为跨筛板压力梯度（translaminar pressure gradient, TLPG）13。青光眼的主要危险因素之一是眼内压升高14。

眼内压（IOP）升高会增加筛板区域内部及跨区域的应变6,15,16。在人类和动物模型中的实验观察表明，视神经乳头（ONH）是轴突损伤的初始部位17,18。IOP相关应力和应变导致ONH处发生青光眼性损伤的生物力学范式，也影响着青光眼的病理生理过程19,20,21。尽管在人类中，压力诱导的变化会机械性地损伤视网膜神经节细胞（RGC）轴突22，但缺乏筛板内胶原板的啮齿类动物也可能发生青光眼7,23。此外，眼内压升高仍是原发性开角型青光眼患者最显著的危险因素，而正常眼压性青光眼患者即使没有眼内压升高，也会发展为青光眼性视神经病变。同时，也存在一部分眼压升高患者并未出现视神经损伤。已有研究提示，脑脊液压力（CSFp）可能在青光眼发病机制中发挥作用。证据表明，与正常个体相比，青光眼患者的颅内压（ICP）降低至约5 mmHg，从而导致跨筛板压力增加，并在疾病发展中起关键作用24,25。先前在犬类模型中已证实，通过调控IOP和CSFp的变化，可引起视盘显著移位26。在猪眼模型中升高CSFp也显示出筛板（LC）区域及筛后神经组织内的主应变增加。RGCs和LC区域所受应变增加会导致轴突运输受阻以及RGCs的丢失27。RGCs的进行性退变与神经营养支持丧失28,29、炎症过程/免疫调节的激活30,31以及凋亡效应因子的参与29,32,33,34,35相关。此外，轴突损伤（图3）会对RGCs产生有害影响，引发再生失败36,37,38,39。尽管IOP的影响已被广泛研究，但针对异常跨筛板压力变化的研究仍十分有限。目前大多数青光眼治疗策略集中于稳定IOP。然而，尽管降低IOP可延缓疾病进展，却无法逆转视野缺损，也不能防止RGCs的完全丧失。深入理解青光眼中与压力相关的神经退行性变化，对于预防RGC死亡至关重要。

现有证据表明，由于创伤性或神经退行性视觉障碍患者体内发生的各种机械性、生物学或生理学变化所导致的跨层压力波动，可能引起显著的视力丧失。目前尚不存在真正可用于研究体外人眼视神经乳头（ONH）内青光眼生物力学损伤的临床前人眼后段模型。在眼科学中，对眼部后段的观察与治疗仍面临巨大挑战27。眼部后段存在多种物理和生物学屏障，包括高清除率、血-视网膜屏障以及潜在的免疫反应，限制了靶向治疗的实现40。大多数新型药物靶点的有效性和安全性测试依赖于体外细胞模型和体内动物模型来完成41。眼部解剖结构复杂，体外研究无法准确模拟组织模型系统中存在的解剖和生理屏障。尽管药代动力学研究仍需依赖动物模型，但不同动物物种之间的人眼后段生理特性可能存在差异，包括视网膜的细胞结构、脉管系统以及视神经乳头（ONH）的结构41,42。

使用活体动物需要严格的详细伦理规范、高昂的资金投入以及有效的可重复性43。近年来， 已陆续出台多项关于实验研究中动物伦理使用的其他指南44,45,46。一种替代动物实验的方法是使用离体人眼模型，以研究疾病发病机制以及潜在药物对视神经乳头损伤的保护作用。人类死后组织是研究人类疾病范式的重要资源，尤其是在人类神经退行性疾病的研究中，因为在 动物模型中开发出的潜在药物必须能够转化为人类应用47。离体人供体组织已被广泛用于人类疾病的研究47,48,49，而人眼前段灌注器官培养系统此前已提供了一种独特的离体模型，用于研究眼内压升高的病理生理机制50,51,52。

为了研究与眼内压（IOP）和颅内压（ICP）相关的人眼跨层压力，我们成功设计并开发了一种双腔跨层自主系统（TAS），该系统可利用人供体眼球的后段结构独立调节IOP和ICP。这是首个用于研究跨层压力以及探索跨层压力梯度（TLPG）对视神经乳头（ONH）生物力学影响的离体人眼模型。

这种离体人眼视神经乳头模型可用于发现和分类因眼内压（IOP）或颅内压（ICP）长期升高所导致的细胞和功能改变。在本报告中，我们详细描述了分离、建立和监测人眼视神经乳头后段模型的逐步操作流程。该方案将帮助其他研究人员有效重复这一新型的离体加压人眼后段模型，以研究生物力学在疾病发生机制中的作用。

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方案

眼睛样本的获取遵循《赫尔辛基宣言》中关于涉及人体组织研究的规定。

注意：来自信誉良好的眼库（例如，Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL）的眼球在死亡后6–12小时内获取，供体血清经检测排除乙型肝炎、丙型肝炎以及人类免疫缺陷病毒1型和2型感染。收到眼球后，须在24小时内进行解剖并建立TAS模型。排除标准包括任何眼部病理改变；但不因年龄、种族或性别排除眼球。为确保收到的视网膜组织具有活性，从供体组织中分离视网膜外植体，并在体外培养7天和14天（补充图1）。这些视网膜组织还被解离并在培养中成功生长出健康的视网膜神经节细胞（RGCs），培养7天后可见RGC标志物——具有多种剪接功能的RNA结合蛋白（RBPMS）阳性染色，以及神经丝中神经丝轻链（NEFL）阳性染色（补充图2）。 。

1. 仪器设备与耗材的准备及灭菌

  1. 所需材料的完整清单以及供应商和目录编号，请参见材料表。
  2. 使用前，通过高压灭菌或环氧乙烷安瓿法对所有设备和器械进行灭菌。

2. 灌注培养基的制备

  1. 向1,000 mL高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中加入1%青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素，溶于0.85% NaCl）和1% L-谷氨酰胺（200 mM）。
  2. 将灌注培养基通过0.22 μm滤膜过滤以进行灭菌。

3. 经层自主系统（TAS）设置

  1. 设置灌注液流入注射器（IOP 和 ICP 储液器）。
    1. 将 30 mL 灌注液（第 2 节）加入一支 30 mL 注射器中。将一个三通旋塞连接到 30 mL 注射器上。将一个 0.22 μm 亲水性滤器连接到三通旋塞上。将一个 15 G 鲁尔接头适配器连接到 0.22 μm 亲水性滤器上。
    2. 排除注射器装置中的气泡。将管路连接至 15 G 鲁尔接头适配器。使用无通气孔的通用锁紧帽封闭旋塞的侧端口。重复以上步骤，共准备两套装置。
    3. 将其中一支注射器标记为通道 1 颅内压（CH1 ICP），另一支注射器标记为通道 2 眼内压（CH2 IOP）。
  2. 设置灌注液流出注射器（IOP 和 ICP 储液器）。
    1. 将一个三通旋塞连接到一支 30 mL 注射器上。将一个 15 G 鲁尔接头适配器连接到三通旋塞上。将管路连接至 15 G 鲁尔接头适配器。
    2. 使用无通气孔的通用锁紧帽封闭旋塞的侧端口。重复以上步骤，共准备两套装置。将其中一支注射器标记为 CH1 ICP，另一支注射器标记为 CH2 IOP。

4. 人全眼球的制备

注意：如果收到的是完整眼球，请按照以下步骤将眼前段与眼后段分离。如果眼球已沿中线切开，则从步骤 4.4 开始操作。

  1. 将完整的眼球放入聚维酮碘溶液中浸泡 2 分钟。
  2. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗眼球，以去除聚维酮碘。重复冲洗 2 次。
  3. 使用 镊子和剪刀去除眼球的附属组织。在赤道部将眼球切成两半，以分离前段和后段。
  4. 去除视神经鞘。从眼球后段中移除玻璃体。
  5. 如有需要，修剪后段上多余的巩膜，以确保其能良好贴合于眼内压（底部）腔室的圆形穹顶。使用镊子确保视网膜均匀铺展在后段内壁。
  6. 眼内压（底部）腔室的设置
    1. 将人眼球后段放置于TAS系统的眼内压（底部）腔室内，使其覆盖在圆形穹顶上，且视神经朝上。
    2. 使用环氧树脂O型圈和四个螺钉密封后段，确保密封紧密。
    3. 将管路插入眼内压（底部）腔室的进液（IN）和出液（OUT）端口。含有灌注液的进液端注射器通过管路连接至IN端口，空的出液端注射器通过管路连接至OUT端口。
    4. 采用推/拉方法，缓慢将灌注液经进液端注入，以填充眼球后段杯状结构，同时缓慢从出液端注射器抽出灌注液，以清除管路中的气泡。当进液和出液管路均无气泡时，停止注入灌注液。
    5. 将旋塞阀关闭并锁定。从眼内压进液端滤器组件上取下30 mL注射器，重新装入总共30 mL的灌注液，再将该30 mL注射器重新安装至滤器组件上。
  7. 颅内压（顶部）腔室的设置
    1. 将颅内压（顶部）腔室/盖子置于眼球后段背面之上，确保视神经位于顶部腔室内。用四个螺钉密封顶部腔室。
    2. 将管路插入颅内压（顶部）腔室的进液（IN）和出液（OUT）端口。含有灌注液的进液端注射器通过管路连接至IN端口，空的出液端注射器通过管路连接至OUT端口。
    3. 轻柔缓慢地将灌注液经IN端口注入，以填充颅内压腔室，并使用推/拉方法清除管路中的气泡。当颅内压腔室以及进液和出液管路均无气泡时，停止注入灌注液。
    4. 将旋塞阀关闭并锁定。从颅内压进液端滤器组件上取下30 mL注射器，重新装入总共30 mL的灌注液，再将该30 mL注射器重新安装至滤器组件上。

5. 数据记录系统设置

注意：数据记录系统由一个8通道电源、多通道桥式放大器、静水压力传感器以及配备数据采集软件的计算机组成（参见材料表）。以下介绍如何设置和校准该系统。

  1. 将电源线插入8通道电源背面，并连接至备用电池设备。
  2. 将USB线从8通道电源连接到计算机背面。
  3. 使用随附的I2C线将8通道电源连接至多通道桥式放大器。
  4. 将卡口式Neill-Concelman（BNC）电缆插入8通道电源前面的通道输入端，并将电缆另一端插入多通道放大器背面的对应通道。
  5. 将传感器电缆连接至多通道放大器的前面。
  6. 在计算机上安装数据采集软件。
    1. 从提供的软件光盘运行数据采集软件安装程序。
    2. 按照计算机屏幕上的说明进行操作。
    3. 安装完成后，选择完成。
  7. 打开8通道电源。
  8. 打开计算机并启动数据采集软件。
    1. 选择文件 | 新建。
    2. 选择设置 | 通道设置。选择三个通道（屏幕左下角）。在通道标题列中将通道重命名为：CH1 ICP；CH2 IOP；CH3 TLPG（IOP-ICP）。
    3. 将所有通道的量程设为2 mV。在计算列中，为通道1和通道2选择无计算。
    4. 在计算列中为通道3选择算术。在公式部分：选择通道/CH2；选择算术 "-"；选择通道/CH1。在输出部分选择mmHg。点击确定，再次点击确定。
  9. 设置并校准静水压传感器。
    注意：静水压传感器必须在实验前使用以下方法进行校准。
    1. 将静水压传感器连接至连接到多通道桥式放大器的传感器管路。
    2. 将一个装有空气的30 mL注射器连接至CH1（ICP）压力传感器的侧端口。将血压计连接至CH1（ICP）压力传感器底部。
    3. 在数据采集软件的图表页面上，通过单击采样时间旁边的箭头并选择100来设置采样速度。然后在页面的CH1（ICP）区域单击右键。
    4. 选择桥式放大器。选择电源滤波器。选择调零，并等待系统完成调零，期间请勿移动压力传感器。
    5. 捏住压力传感器的白色卡扣，向传感器内推入空气，直至血压计显示40 mmHg。松开白色卡扣，取下注射器和血压计。
    6. 在单位转换页面，选择“减号 (-)”。高亮显示最高平台以表示40 mmHg。点击箭头标记点1，并输入40。
    7. 高亮显示最低平台以表示0 mmHg。点击箭头标记点2，并输入0。选择单位为mmHg。点击确定。
    8. 点击确定（桥式放大器页面）。对CH2（IOP）重复步骤9.1–9.7，最高平台设为100 mmHg，最低平台设为0 mmHg。
  10. 将TAS/后段单元连接至数据采集系统。
    1. 将TAS/后段单元放入培养箱（37 °C，5% CO2）中。将来自OUT端口的ICP管路连接至CH1（ICP）压力传感器。
    2. 将来自OUT端口的IOP管路连接至CH2（IOP）压力传感器。
    3. 将带有培养基的注射器装置（ICP和IOP）从IN端口连接至铁架台。
    4. 在图表视图页面，选择开始采样。通过单击采样时间旁边的箭头设置采样速度，并选择慢速和1 min。
    5. 上下调节铁架台上的注射器，以将ICP和IOP压力调节至符合实验方案要求。
    6. 每48–72小时通过推拉法对系统进行一次培养基的系统性补充。

6. 数据检索与分析

  1. 在数据采集软件中打开数据文件。
  2. 在 数据面板 区域，点击 批量添加到数据面板 图标。此时将弹出一个新窗口。
    1. 在 查找方式 区域，从下拉菜单中选择 时间。
    2. 在 选择 区域，从下拉菜单中选择每隔 1 小时 选取 1 小时。
    3. 在 遍历方式 区域，选择 整个文件，然后点击 添加。
  3. 在 数据面板 区域，点击 数据面板视图 图标。选中所有数据并复制/粘贴至电子表格中。
  4. 计算每 24 小时的 IOP、ICP 和 TLPG 的均值与标准差。使用电子表格软件中的数据透视表功能整理数据并绘制图表。

7. 后段组织的免疫组织化学与苏木精-伊红染色

  1. 在不同时间点从TAS模型中取出后段眼球组织，并用甲醛固定，然后进行石蜡包埋。
  2. 对眼球进行切片，以获得矢状面组织切片。
  3. 使用100%二甲苯、95%乙醇、50%乙醇溶液对石蜡包埋的组织片段进行脱蜡。
  4. 用PBS洗涤切片10分钟，并在室温下用封闭缓冲液封闭1小时。
  5. 使用以下一抗对切片进行标记：抗胶原IV抗体（细胞外基质（ECM）标记物，NB120-6586，1:100）、抗层粘连蛋白抗体（ECM标记物，NB300-144，1:100）和抗RBPMS抗体（视网膜神经节细胞标记物，GTX118619，1:50）。
  6. 使用Alexa Fluor二抗（Alexa Fluor 488山羊抗兔，A11008，1:500）检测一抗信号。
  7. 使用DAPI抗荧光淬灭溶液对细胞核进行复染。
  8. 使用荧光显微镜（参见材料表）配备4倍和10倍物镜拍摄染色切片及相差图像。
  9. 对于苏木精-伊红（H&E）染色，将切片放入自动染色系统（参见材料表）中，使用100%二甲苯、95%乙醇、50%乙醇溶液进行脱蜡，并进行H&E染色。
  10. 使用配备明场光源的显微镜，以4倍和10倍物镜拍摄图像。

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结果

经巩膜自主系统的构建与设计
经巩膜压力差可能是多种疾病（包括青光眼）发病机制中的一个关键潜在因素。本研究所描述模型的应用范围包括但不限于青光眼（眼内压升高，可能伴随颅内压降低）、创伤性脑损伤（颅内压升高）以及长期暴露于微重力相关视觉障碍（颅内压升高、眼内压升高）等疾病的研究。为了帮助揭示以人眼经巩膜压力为靶点的分子发病机制，我们设计、构建并验证了该经巩膜自主系统（TAS）模型。我们这一新型的离体人眼模型为独立研究颅内压（ICP）和眼内压（IOP）相关致病性改变提供了独特的临床前研究平台。为应对人类临床前研究需求，该模型提供了一种离体研究经巩膜压力变化所致发病机制的范式。模型的密封式设计以实心前视图和透明视图展示（图1A、1B），并配有详细示意图以显示模型中所有灌注流入和流出端口（图1C）。实际3D打印模型中包含人眼后段的彩色透明视图如图所示（图1D、1E

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讨论

人类尸检组织是研究人类神经退行性疾病的一种尤为宝贵的资源，因为在 动物模型中开发的潜在药物必须能够转化为人类应用47。眼内压（IOP）升高的影响已得到充分证实，但关于视神经乳头（ONH）跨层压力异常变化的研究却极为有限。尽管目前已存在多种动物模型以及针对人类ONH的有限元模型，但仍缺乏可用于研究跨层压力变化的离体人类模型41,54,55,56,57。目前迫切需要建立一种新的临床前人类模型，能够在离体条件下利用IOP和颅内压（ICP）靶向疾病病因，并 识别与青光眼发病机制相关的多种致病范式。理解ONH处与压力相关的病理变化对于防止视网膜神经节细胞（RGC）死亡至关重要。在TAS模型中联合使用IOP、ICP和跨层压力梯度（TLPG），是一种利用人类眼球...

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披露

手稿作者无潜在利益冲突需要披露。

致谢

本项目资金来自 Colleen M. McDowell 博士的自主支配经费。本研究部分得到了防盲研究基金会（Research to Prevent Blindness, Inc.）向威斯康星大学麦迪逊分校眼科与视觉科学系提供的无限制资助支持。我们感谢 Abbot F. Clark 博士和 Weiming Mao 博士在灌注器官培养模型方面提供的技术支持。我们感谢狮子会移植与研究眼科研究所（Lions Eye Institute for Transplant and Research，佛罗里达州坦帕市）提供人眼供体眼球。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#122, 1-1/8" 内径 1-5/16" 外径，Viton O型圈，3/32" 厚，
755 硬度计 50 件装		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O型圈，70A 邵氏硬度，黑色，5/8" ID，13/16" OD，3/32" 宽度（每包 100 个）AmazonB000FMYRHK
30 mL 无针注射器Vitality Medical302832
三通止液阀，两端为雌性鲁尔锁扣，旋转式雄性鲁尔锁扣，带通气帽QOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME &和相应尺寸的十字螺丝刀Brikksen 不锈钢紧固件PPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 大安瓿瓶Fisher ScientificNC9085343 
聚维酮碘普渡大学PUR1815001EACH 
Corning 100 x 20 mm 细胞培养处理培养皿Sigma-AldrichCLS430167-100EA 
康宁 L-谷氨酰胺溶液Fisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity 纱布海绵，4" × 4"，12层，无菌，1200/箱Med Plus 医疗用品COV-3033-CS
精细弯镊（带齿）卡特纳K5-4010
杜蒙特 #5 精细镊F.S.T.11254-20
标准弯角眼科剪卡特纳K4-7410
Falcon 150 x 15mm 无菌一次性培养皿Capitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. 样品容器Fisher Scientific16-320-730
Fisherbrand 一次性密封灭菌袋Fisher Scientific01-812-54
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋Fisher Scientific01-812-55
Fisherbrand 即用型密封灭菌袋Fisher Scientific01-812-58
HyClone DMEM培养基Fisher ScientificSH3024302
HyClone 青霉素-链霉素 100X 溶液Fisher ScientificSV30010
带女性鲁尔锁接头入口、男性鲁尔滑动接头出口的亲水性滤器，蓝色和透明Qosina28217
静水压力传感器，DELTRAN ® II，目录号 DPT-200，流速为 3 CC/HRAD 仪器DPT-200
JG15-0.5HPX 15 号规格 0.5" NT Premium系列分液吸头 50/盒Jenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 显微镜KeyenceB2-X710
LabChart 8AD仪器LabChart 8
Leica ST5020 多功能染色机LeicaST5020
非通气通用鲁尔锁扣帽，白色QOSINA65811
八通道桥式放大器（型号 # FE228）AD仪器FE228
Pharmco Products 乙醇，200 proofFisher ScientificNC1675398
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35（型号 # PL3508）AD 仪器PL3508
含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFisherP36935
用于空气和水的快插式管路接头 直通接头，1/8" 管外径 × 1/8 英寸 NPT 外螺纹McMAster-Carr7880T113
通用螺纹快插式管接头 用于空气和水，适配器，1/8" 管外径 × 1/8 英寸管McMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 柔性管 500 英尺Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
手术剪 - 尖头钝头F.S.T.14001-14
精细组织镊 1×2 齿 弯型卡特纳K5-4110
跨膜自主系统（TAS）北德克萨斯大学健康科学中心N/A
美国标准尺寸 030 丁腈橡胶 O 型圈，B1000，70 邵氏硬度，黑色，丁腈橡胶
（NBR，丁腈橡胶，Buna）		Marco Rubber &和塑料B1000-030

参考文献

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