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方法文章

新鲜切除乳腺癌肿瘤的太赫兹成像与表征方案

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DOI：

10.3791/61007

⸱

2020年4月5日

 ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, University of Arkansas, 2Oklahoma Animal Disease Diagnostic Laboratory, Oklahoma State University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

根据新鲜组织处理方案，采用太赫兹光谱和成像技术对刚切除的人类乳腺癌肿瘤进行表征。在组织定位时需加以考虑，以实现有效的表征，同时为未来的术中应用提供及时的分析。

摘要

本文介绍了一种利用脉冲太赫兹成像与光谱技术对新鲜切除的人类乳腺肿瘤进行处理、表征和成像的实验方案。该方案包括在垂直入射条件下的太赫兹透射模式以及在30°斜入射角条件下的太赫兹反射模式。所采集的实验数据表示电场的时间域脉冲信号。通过分析模型对穿过组织切片固定点的太赫兹电场信号进行处理，以提取组织的折射率和吸收系数。利用步进电机扫描系统，使发射的太赫兹脉冲从肿瘤表面每个像素点反射，从而获得不同组织区域的平面图像。该图像可呈现为时间域或频率域形式。此外，利用每个像素点提取出的折射率和吸收系数数据，可生成肿瘤的断层太赫兹图像。该方案能够清晰区分癌变组织与正常组织。另一方面，若未严格遵循本方案，肿瘤表面残留的气泡或液体可能导致图像噪声增加或结果不准确。本方案为乳腺肿瘤手术切缘评估提供了一种有效方法。

引言

太赫兹（THz）成像与光谱技术在过去十年中已成为发展迅速的研究领域。随着0.1–4 THz范围内更高效、更稳定的太赫兹发射源的持续发展，其应用显著扩展1。其中，太赫兹技术在生物医学领域展现出巨大潜力并实现了显著增长2。研究表明，在通常用于分析固定组织的功率水平下，太赫兹辐射具有非电离性且生物学上安全3。因此，太赫兹成像与光谱技术已被用于分类和区分多种组织特征，例如通过检测水分含量来判断烧伤损伤及愈合情况4、肝硬化5，以及离体组织中的癌症6,7。特别是癌症检测涵盖广泛的潜在临床与外科应用，已针对脑癌8、肝癌9、卵巢癌10、胃肠道癌症11以及乳腺癌7,12,13,14,15,16,17,18,19进行了广泛研究。

太赫兹（THz）技术在乳腺癌中的应用主要集中在通过切缘评估来辅助乳腺保乳手术（即肿块切除术）。肿块切除术的目的是切除肿瘤及其周围少量的正常组织，与切除整个乳房的全乳切除术不同。切除组织的手术切缘需通过病理学方法进行评估，具体步骤包括将样本经福尔马林固定、切片、石蜡包埋，并在显微镜载玻片上制成4 µm–5 µm厚的切片。这一过程耗时较长，若发现切缘阳性，则需在后期进行二次手术20。美国放射肿瘤学会（ASTRO）目前的指南将阳性切缘定义为癌细胞与切缘表面的墨汁标记相接触21。对于高吸收性含水组织，太赫兹成像主要局限于表面成像，其穿透深度因组织类型而异，但已足以满足术中快速切缘评估的临床需求。在手术过程中对切缘状况进行快速分析，将显著降低手术成本和术后随访手术的发生率。迄今为止，太赫兹技术已被证明在区分福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中的癌组织与正常组织方面有效，但仍需进一步研究以实现对新鲜切除组织中癌症的可靠检测7。

本方案详细阐述了对生物样本库获取的新鲜离体人体组织样本进行太赫兹（THz）成像与光谱分析的步骤。基于新鲜离体人乳腺癌组织的太赫兹应用在已发表的研究中极为罕见7,18,22,23，尤其是未与医院整合的研究团队更少使用。对于其他癌症应用而言，使用新鲜离体组织的情况同样罕见，大多数非乳腺的人类癌症研究案例均集中于结肠癌24,25。造成这一现状的原因之一是，除非所使用的THz系统已整合至外科手术流程中，否则福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块比新鲜离体组织更易于获取和处理。类似地，大多数商用实验室THz系统并未设计用于处理新鲜组织，而少数具备此能力的系统目前仍处于使用细胞系培养阶段，或刚刚开始探索动物模型的离体组织分析。若要将THz技术应用于术中环境，必须预先针对新鲜组织开发成像与表征步骤，以确保分析过程不会干扰常规病理学检查的进行。对于并非天然适用于术中场景的应用，新鲜组织的表征仍是一个必须解决的挑战性环节，这是迈向活体应用与组织鉴别的重要基础。

本研究的目的是为使用商用太赫兹（THz）系统对新鲜切除组织进行THz应用提供操作指南。该实验方案基于一套THz成像与光谱系统26，最初针对小鼠乳腺癌肿瘤开发13,17,19，并进一步扩展至从生物样本库获取的人体手术组织7,18。尽管该方案是为乳腺癌研究设计的，但其核心理念同样适用于其他依赖术中切缘评估来决定治疗效果的实体瘤癌症，以及类似的THz成像系统27。由于目前关于新鲜切除组织的THz研究成果相对较少，据作者所知，本工作是首个专注于新鲜组织在THz成像与表征过程中处理流程的研究。

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方案

本方案遵循阿肯色大学环境健康与安全部门规定的全部要求。

1. 设置组织处理区域

  1. 取一个不锈钢金属托盘，并按图1所示用生物危害袋覆盖。所有生物组织的操作均将在托盘区域内进行（即组织操作区）。
  2. 在托盘周围准备好实验室镊子、组织擦拭纸、纸巾、滤纸包、组织染色液瓶、漂白剂瓶和乙醇瓶，以便需要时取用。使用过的组织、擦拭纸和手套应暂时放置在生物危害物表面，待实验流程结束时统一处理。
  3. 用最多45 mL的10%中性缓冲福尔马林填充一个50 mL离心管，并将其放置在组织操作托盘附近的离心管储存托盘中。

实验室生物危害防护设置；研究环境中用于样品处理和消毒的设备。
图1：组织处理区域的设置。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 用于太赫兹透射光谱的乳腺癌新鲜肿瘤组织处理

注意：在处理任何活体组织之前，需戴上腈类手套、护目镜、口罩和实验服。应始终使用实验室镊子操作组织，避免用手直接接触。所有在密闭容器或扫描台之外的新鲜组织操作，均须在步骤 1.1 中指定的组织处理区域进行。

注意：本工作中处理的所有组织均由中国台湾生物样本库使用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）和抗生素溶液运送。

  1. 从DMEM溶液中取出大块肿瘤组织，置于组织处理区域的培养皿中（见图2A）。
  2. 通过肉眼观察，识别出可用于切取小块组织以进行透射特性表征的不同肿瘤区域。使用不锈钢低剖面刀片，从已识别的部位切取厚度为0.5 mm的肿瘤组织片段，如图2B所示。将切下的组织片段置于两个石英窗片之间，并使用厚度为0.1 mm的间隔垫片固定于液体样品池中，如图2C所示。

组织样本制备过程，近距离序列，实验室研究，显微镜分析前处理
图2：用于太赫兹透射光谱测量的肿瘤切片 (A) 肿瘤组织大体照片。B) 从原发肿瘤组织上切取的肿瘤小块（0.5 mm）的实物照片。C将切片的肿瘤组织置于液体样品池中，位于两片石英窗之间，并使用0.1 mm聚四氟乙烯垫片隔开，用于光谱测量。图示转载自T. Bowman等。18 经SPIE许可。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 太赫兹透射光谱测量

  1. 将透射光谱模块置于太赫兹核心腔室内，对准模块手柄与核心系统中的安装柱，并将载物台向下滑入系统。如图3A所示，拧紧模块右上角和左下角的两个安装螺丝。
  2. 在整个光谱测量过程中，以5 L/min（LPM）的流速通入干燥氮气，以去除样品区域内的水蒸气。
  3. 从连接至太赫兹系统的计算机桌面上打开太赫兹透射光谱测量软件，主窗口将自动打开。
  4. 点击窗口顶部的扫描选项卡，将弹出光谱扫描设置窗口。在窗口右上角的测量模式下拉菜单中选择透射，以设置透射光谱测量。如果峰值未自动显示，请勾选手动峰值搜索选项卡下的启用选项，并手动调节光延迟，使峰值出现在视野中。
  5. 通氮气30分钟后，按以下步骤记录空气参考信号。
    1. 在光谱扫描设置窗口的扫描设置选项卡下，为参考文件输入合适的名称，将扫描次数设为1,800，将起始延迟（s）设为0。其余参数保持默认设置。
    2. 在扫描设置窗口中点击测量参考以采集空气参考信号，然后点击测量样品，对空气中的透射信号进行测量，采集约1分钟内共1,800次信号的平均值。

用于光学分析的透射光谱装置示意图，包含模块、样品架和腔室盖。
图3：太赫兹透射光谱模块装置。（A）安装有透射模块的太赫兹核心腔室。（B）液体样品架的照片。（C）将样品架置于核心腔室内进行测量。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 如图3B所示，测量液体样品 holder 中的两片石英窗片。
    1. 将两片石英窗片放入液体样品 holder 中，中间不加垫片。
    2. 打开太赫兹核心腔室。将液体样品 holder 安装在透射光谱模块上，如图3C所示。关闭腔室。
    3. 在主窗口中点击扫描选项卡。对石英样品重复步骤3.5.1–3.5.2，但将起始延迟（s）更新为900。这可在测量前留出时间以清除水蒸气。
    4. 若需将石英作为其他样品的参考，点击扫描设置下的清除参考选项卡，以清除空气参考。然后点击测量参考选项卡，将石英测量结果记录为新的参考。
  2. 将切片的肿瘤组织置于液体样品 holder 内两片石英窗片之间，并将 holder 放入腔室内，进行组织的单点透射测量。为记录测量数据，请重复步骤3.6.3。
  3. 测量完成后，将液体样品 holder 从腔室中取出，并移至指定的组织处理区域。拆开液体样品 holder，用组织擦拭纸将肿瘤切片从石英窗片上擦拭下来，并将使用过的擦拭纸与其他生物危害废弃物一同放入托盘，最终丢弃至生物危害垃圾袋中。
  4. 根据需要重复步骤2.2、3.7和3.8，以表征其他肿瘤切片。测量完成后，返回主窗口，点击文件选项卡以保存测量数据。关闭软件窗口。

4. 乳腺癌新鲜肿瘤组织在太赫兹反射模式成像中的处理

  1. 从 DMEM 和抗生素溶液中取出新鲜肿瘤样本，置于培养皿中。通过肉眼观察，选择一个足够平坦、血液较少且血管稀少的肿瘤面进行成像。如有可能，应避免对含有血液或血管的组织进行成像。
  2. 将待成像面朝下放置于 1 号滤纸上，以去除多余的 DMEM 并清除肿瘤组织表面的液体或分泌物，如图 4A所示。随着滤纸逐渐饱和，将肿瘤重新移至滤纸上的干燥区域。干燥肿瘤约 5 分钟。

样品架上的组织成像装置，带有滤纸；新鲜组织制备与放置步骤。
图 4：太赫兹成像用新鲜肿瘤样本的制备。（A）将肿瘤放置在滤纸上以干燥。（B）将肿瘤置于成像窗口上方的聚苯乙烯板上，并使用组织擦拭垫吸收多余液体。（C）从下方观察肿瘤，以追踪方向并检查是否存在气泡。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 拆下透射光谱模块，并将反射成像模块（RIM）的镜座安装至太赫兹核心系统上，如图5A所示。安装好反射镜后，将RIM扫描台置于镜座上方，并将其旋紧固定到核心系统中（见图5B）。
  2. 在成像程序开始前，使用干燥氮气以5 LPM的流速对系统吹扫30分钟，以去除样品腔中的水蒸气。30分钟后，在系统使用期间将干燥氮气流量降低至3 LPM。
  3. 在直径约为37 mm的扫描窗口上放置一块厚度约为1.2 mm的聚苯乙烯板。将扫描窗口连同聚苯乙烯板一起在样品台上居中放置。

用于光学测量的反射成像模块和样品台设置，突出显示各组件
图 5：反射成像系统设置。（A）反射成像模块镜座。（B）扫描台。请点击此处查看该图的放大版本。

注意：其他厚度和板材材料也适用于步骤 4.5，但应具有均匀的厚度，且吸收率足够低，以免阻碍太赫兹（THz）信号。

  1. 打开连接到太赫兹系统的桌面上的太赫兹反射成像测量软件。将弹出一个窗口，显示若干用于特定功能的对话图标，以及两个分别显示太赫兹电场随时间与频率变化的子窗口（任意单位 a.u.）。
  2. 要设置RIM系统的参数，请点击窗口顶部的Image Parameter Dialog图标。将弹出一个Image Acquisition Parameters窗口。在Template选项卡的下拉菜单中选择RIM，以配置反射成像系统。点击OK，返回软件主窗口。
  3. 在主窗口中，点击Fixed-point Scan图标。这将激活太赫兹天线，开始向聚苯乙烯板上的单一点发射入射太赫兹信号，并接收其反射信号。
  4. 点击主窗口顶部的Motor Stage Dialog图标，电机控制窗口将打开。通过点击forward/reverse direction arrows调整光延迟轴，使聚苯乙烯板的反射脉冲在主窗口中居中。
    注意：调整光延迟轴后，窗口中应出现两个脉冲，如图6所示：一个来自聚苯乙烯板的下界面（主反射），另一个来自聚苯乙烯板的上界面（次级反射）。
  5. 将聚苯乙烯板的主反射从窗口中排除，仅保留次级反射，以便在成像过程中保留组织反射信号。此操作分为两个步骤。
    1. 首先，点击主窗口顶部的DAQ Settings按钮，打开DAQ设置对话窗口。将光延迟值从5 V（默认值）更改为4 V。
    2. 其次，使用扫描平台上的千分尺刻度调节扫描平台的垂直位置，直到次级脉冲的最小值达到最强。然后在Motor Control Window中调整光延迟轴，使主反射位于所测反射信号范围之外。
      注意：对于厚度为1.2 mm的聚苯乙烯板，当次级反射的最小峰值在时域窗口的光延迟轴上约为-0.3 mm时，主反射即被排除在测量范围之外。

聚苯乙烯板反射示意图与图表；光延迟、电场分析、1.2 mm 装置。
图6：来自聚苯乙烯板下表面和上表面的太赫兹（THz）反射信号。（A）入射至并从一块厚度为1.2 mm的聚苯乙烯板反射的THz信号。（B）测得的来自聚苯乙烯的主要和次要THz时域信号。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 调平样品台并记录参考信号。
    1. 在每个轴（A轴和B轴）上选择两个点，表示样品窗口边缘附近聚苯乙烯板上的位置。例如，对于范围为-15 mm至15 mm的A轴，两个位置点可以是-10 mm和10 mm；对于范围为-15 mm至15 mm的B轴，两个位置点也可以是-10 mm和10 mm。
    2. 单击电机控制对话框按钮以打开电机控制窗口。重新调整电机控制窗口和主软件窗口的位置，以便在调节电机位置时能够看到时域信号。将A轴和B轴均设置为0 mm。
    3. 使用以下步骤调平A轴。以-10 mm至10 mm范围为例。
    4. 在电机控制窗口中，将A轴的值从0更改为-10，然后按Enter键。样品台将移动到A轴的-10 mm位置，并在主窗口中观察到信号位置发生偏移。
    5. 使用如图5B所示扫描台上的可调千分尺刻度，将信号的最小峰值移回第4.10.2步设定的位置。
    6. 将A轴的值更改为+10并按Enter键。此时样品台将从A轴的-10 mm位置移动到+10 mm位置，并再次观察到信号发生偏移。注意信号从先前位置偏移的方向和距离，然后再次将A轴的值更改为-10，信号将返回至第4.11.5步设定的位置。
    7. 旋转如图5B所示扫描台A轴上的调平螺丝，使信号向其原始位置移动方向的两倍距离处偏移。使用扫描台上的千分尺将信号移回原始位置（对于1.2 mm厚的聚苯乙烯，为-0.3 mm）。
    8. 重复步骤4.11.6–4.11.7，直到+10 mm和-10 mm处的信号相等，且两个位置的峰值均聚焦于原始位置（光轴上-0.3 mm）。
  2. A轴调平完成后，将A轴的值设为0，并对B轴重复相同操作。首先在电机控制窗口中将B轴的值从0更改为最大正值（例如+10 mm）。在调平过程中，使用如图5B所示扫描台B轴上的调平螺丝。
  3. 当两个轴均完成调平后，将A轴和B轴均返回至0 mm。关闭电机控制窗口，并确认信号是否仍处于原始位置，以防发生轻微偏移。
  4. 将此信号记录为参考信号。
    1. 进入DAQ属性设置窗口。将平均次数更改为5，其余参数保持默认。
    2. 单击新建参考。窗口右上角的平均计数器将从0计数至20。当计数器达到20后，将平均次数更改为1，然后单击确定。聚苯乙烯反射的信号将被保存为后续所有扫描的参考信号。
      注：如果仅需执行太赫兹成像流程，则最好在将肿瘤组织从DMEM溶液中取出之前完成步骤4.3–4.14。
  5. 将肿瘤组织安装在覆盖扫描台窗口的聚苯乙烯板上。
    1. 从扫描台上取下成像窗口，并将其移至组织处理区域。将肿瘤组织放置在聚苯乙烯板上，如图4B所示。
    2. 确保聚苯乙烯板与肿瘤之间无明显气泡。若观察到气泡，可用镊子轻压肿瘤，或抬起肿瘤并轻轻滚动至聚苯乙烯板上，以尽量减少空气间隙。
    3. 如图4B所示，在测试样品周围等间距放置吸波垫片。在肿瘤上方再放置一块聚苯乙烯板，并轻轻按压，使肿瘤表面尽可能平整。用胶带将聚苯乙烯-肿瘤-聚苯乙烯的组合固定在样品窗口上。
  6. 如图4C所示翻转样品窗口，并拍摄肿瘤照片以记录其方向。随后将带有肿瘤的样品窗口放回扫描台。
  7. 单击主窗口中的图像参数对话框按钮，打开图像采集参数窗口。设置Axis1min、Axis1max、Axis2min和Axis2max的值，以完全覆盖成像窗口中肿瘤的位置。
    注：默认情况下，Axis1为A轴，Axis2为B轴。
  8. 将Axis1step和Axis2step设置为0.2 mm，用于成像扫描。
    注：设置Axis1step和Axis2step将使步进电机在扫描过程中的步长为200 µm。总扫描时间可在图像采集参数窗口中估算。
  9. 单击主窗口中的测量选项卡，并选择回扫2D扫描选项。在弹出的窗口中，指定用于保存扫描数据的目录和文件名。

5. 组织病理学检测前新鲜组织的后期处理

  1. 扫描过程完成后，从核心太赫兹系统中取出样品窗口、聚苯乙烯板和样品，并将其移至指定的危险废物处理区域。将肿瘤从聚苯乙烯板上取下，放置在一块与肿瘤大小相近的平整纸板上。确保肿瘤的方位与其在聚苯乙烯板上时一致，成像面接触纸板。
  2. 将棉签浸入红色组织染料中，将肿瘤左侧染色至肿瘤边缘与纸板接触处。同样，用蓝色组织染料染色肿瘤右侧。在肿瘤暴露的表面用黄色组织染料画一条线，连接红色染料与蓝色染料，以标记样品的背面，如图7A所示。
    注意：为防止染料污染甲醛溶液，仅需在组织上涂抹薄层染料。可通过在染色前将棉签在其他表面轻拍，或使用干净棉签擦去多余染料来实现。避免染料接触皮肤或衣物。该肿瘤染色步骤作为参考，旨在为病理医生提供有关肿瘤成像面及其方位的信息。

乳腺癌组织制备过程；图像（A）模具，（B）标记的组织块，（C）福尔马林容器。
图7：太赫兹成像后对肿瘤的后续处理。（A）将肿瘤面朝下放置在纸板支架上，并用组织标记染料染色。（B）在肿瘤上方覆盖滤纸，并用胶带固定以保持接触。（C）将染色后的肿瘤固定在纸板上，浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，并用Parafilm密封。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 让墨水干燥约 3–4 分钟。裁剪一张与纸板大致尺寸相同的滤纸。将滤纸放在肿瘤上，并用胶带将滤纸和纸板完全包裹起来，如图 7B所示。胶带和滤纸应将肿瘤固定在纸板上，但不要施加任何明显压力。
  2. 将固定在纸板上的染色组织浸入 10% 中性缓冲福尔马林溶液中，并用石蜡膜密封离心管，如图 7C所示。在管壁标签上注明样本编号、日期、组织类型和肿瘤编号。将肿瘤送至病理医生处进行进一步的组织病理学处理。

6. 危险废物处理

  1. 将组织操作托盘中的所有废弃物，连同用于覆盖托盘的生物危害袋，一并放入一个新的生物危害袋中，如图8所示。将该袋子送至大楼内指定的生物危害废弃物区域，并与环境健康与安全（EH&S）部门预约收取废弃物。使用10%次氯酸钠溶液和乙醇清洁组织操作托盘及桌面周围区域。

实验室中用于安全处置生物材料的红色生物危害废物袋。
图8：生物危害废物袋的照片。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 将带有垫片、石英窗（肿瘤固定在其采样窗口上）、聚苯乙烯板和实验室镊子的液体样品架带至清洗区域。先用清水冲洗所有材料，然后用10%次氯酸钠溶液冲洗，必要时用纸巾擦拭以去除组织残渣。再次用清水冲洗，用Alconox溶液擦洗，并彻底冲洗干净。对于玻璃和塑料器皿，用70%异丙醇冲洗后放置晾干。
    注意： 一旦肿瘤放入福尔马林且样品腔已清洁，数据处理可与成像同时进行，也可在之后进行。

7. 数据处理以构建太赫兹图像

  1. 从太赫兹系统中导出已保存的 .tvl 数据文件。系统获取的原始数据文件采用 Python 格式编写，建议先在 Python 中读取，再保存为 MATLAB 数据文件。
  2. 为了构建扫描新鲜组织的太赫兹图像，对原始时域反射成像数据矩阵的第三维（即时间维度）进行傅里叶变换，将原始数据转换为频域；同时对参考数据进行傅里叶变换。
    注意： 典型的频域光谱应提供 0.1 THz–4 THz 范围内的数据。
  3. 使用参考数据对样本数据进行归一化处理，并基于归一化数据在频率范围 f 内的积分计算功率谱1 = 0.5 THz 至 f2 = 1.0 THz，使用以下公式19:
    太赫兹频率分析中的功率谱公式方程显示吸收比。
    注意： 此处 E样本 是组织样本的频域反射成像数据 E参考文献 是参考信号的单点反射数据的频域。
  4. 通过在由A轴和B轴定义的矩阵中，对每个点的计算功率谱数据进行绘图，构建二维图像。该图像被称为功率谱太赫兹图像。
    注意： 获取断层太赫兹图像的方法详见步骤7.5–7.7。
  5. 为进行表征，使用以下方程计算在一系列潜在组织特性下的理论频率相关反射率18:
    薄膜分析中的光学干涉方程。描述电场强度比值的方程。
    注意：此处 ρT,ij 是区域之间的复菲涅耳反射系数 i 和区域 j;dj 是该区域的厚度 j 和 θj 是该区域中的传播角 j 由斯涅尔定律与入射角相关。 传播常数公式，复折射率，光学物理方程，用于教学 是该区域的复传播系数 j，其中 ω 是角频率， c 是真空中的光速， nj 是折射率的实部，且 α绝对值，j 是吸收系数18区域1为空气，区域2为聚苯乙烯板，区域3为组织。
  6. 根据用户定义的区域3折射率和吸收系数范围，计算公式（2）中的反射率n3 和 α抗体，3）并与各点的实测信号进行比较，以计算幅度和相位的综合均方误差。
    注意： 折射率和吸收系数的解是使误差最小的一组数值。
  7. 从提取的折射率和吸收系数数据构建断层扫描太赫兹图像（n3 和 α抗体，3) 的每个像素处。通过与病理医生提供的病理切片图像进行比较，分析肿瘤区域。代表性结果如下所示 图9，以及未充分遵守该方案的示例 图10 和 图11.

8. 利用透射光谱数据提取组织的电学特性

  1. 在太赫兹透射光谱测量软件的主窗口中，进入 文件 选项卡，点击 导出 选项。此时将弹出一个窗口，用于选择要导出的 数据类型 和 样品。针对石英和组织样品的测量，选择 透射率 和 透射相位 数据类型。
  2. 使用以下公式计算一系列潜在组织特性对应的理论频率相关透射率15：
    光学测量方程，光谱分析中显示 Esamp/Eref 比值的公式。
    注意： 此处 静态平衡图示；ΣFx=0；力矩方程 τ=Iα；力学系统分析。 为样品与参考装置的菲涅尔透射系数之比；γ1 和 γ3 分别为空气和组织的复传播常数；d 为组织厚度。传播常数的一般定义为 γ=jω/ĉn；阻尼方程，动态系统分析，数学公式。ñ 为复折射率，定义为 复折射率方程，\( \tilde{n} = n - j\frac{c}{\omega}\frac{a_{abs}}{2} \)，光学研究。，其中 n 为折射率的实部；c 为光速；ω 为角频率；αabs 为吸收系数15。
  3. 针对用户自定义的一系列 n 和 αabs 值，计算公式 (3) 中透射率的幅度与相位与系统实测数据之间的综合均方误差。
    注意： 折射率和吸收系数的解即为使误差最小的一组数值。
  4. 将提取出的折射率和吸收系数数据绘制成 0.15–3.5 THz 频率范围内的曲线图。代表性结果如 图 12 所示。

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结果

来自生物样本库的人类乳腺癌肿瘤样本#ND14139在采用上述方案进行检测后所获得的太赫兹（THz）成像结果18如图9所示。根据病理报告，样本#ND14139为I/II级浸润性导管癌（IDC），取自一位49岁女性患者的左侧乳房肿块切除手术。肿瘤的照片见图9A，病理图像见图9B，而根据方案中公式(1)获得的THz功率谱图像见图9C。病理图像的评估由俄克拉荷马州立大学的咨询病理学家完成。将THz图像与病理图像进行比对后发现，癌变区域（即图9C中的红色区域）的反射信号高于脂肪区域（即图9C中的蓝色区域）。在图9C中癌变区域中心附近出现的蓝色圆圈，是由于成像过程中肿瘤下方存在气泡所致。<...

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讨论

新鲜组织的有效太赫兹反射成像主要依赖于两个关键因素：1）对组织处理的恰当考虑（第2节和第4.15节）；以及2）成像平台的设置（主要是第4.11节）。组织干燥不充分会导致反射增强，由于DMEM及其他液体的高反射性，从而无法清晰观察特定区域。同时，组织与成像窗口接触不良会在太赫兹反射图像中产生低反射的环状或斑点状区域，干扰成像结果。应额外注意确保组织与成像窗口之间良好接触，包括重新调整组织位置以获得更佳的界面。在进行组织特性表征时，还需仔细实施平台设置的其他注意事项。即使平台平衡偏差仅数微米，也可能导致计算出的组织折射率和吸收系数发生显著偏移。此问题也可能源于将组织固定于成像窗口时施加压力过大，从而引起聚苯乙烯板的弯曲变形。为获得准确的计算结果，用于表征的参考信号必须来自图像的同一相位平面，以避免人为相位偏移。

该方案的主要可修改之处在于用于固定组织的介电材料，例如石英（第3.6–3.7节）和聚苯乙烯（从第4.5节开始）。只要所选窗口材料厚度均匀，且吸收足够低，能够与肿瘤产生良好的信号相互作用，即可替换为其他材料。应提前评估材料，以确定其是否能提供足够的相位平面。或者，对于成像窗口将被...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 # R15CA208798 以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 # 1408007 部分支持。太赫兹脉冲系统的经费来自美国国家科学基金会/科研仪器基金（NSF/MRI）项目 # 1228958。我们感谢国家疾病研究交换中心（NDRI）在 NIH 资助 U42OD11158 支持下提供的组织样本。同时，我们感谢俄克拉荷马州立大学俄克拉荷马动物疾病诊断实验室在本研究所有组织样本的组织病理学检测过程中给予的合作与支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 异丙醇VWR89108-162含有 70% 药用级异丙醇和 30% 药用级去离子水
Alconox 粉末洗涤剂VWR21835-032浓缩型洗涤剂，用于去除玻璃、金属、不锈钢、瓷、陶瓷、塑料、橡胶和玻璃纤维上的有机污染物
生物危害袋Fisher Scientific19-033-712Justrite 认证的生物危害废物容器替换袋
纸板支架N/AN/A废弃纸板，用于在组织浸入福尔马林时保持成像面完整
离心管VWR10026-078带平盖、锥底、聚丙烯材质、无菌、标准系列离心管
棉签Walmart551398298Q-tips 原装棉签，用于对组织染色
乙醇VWR71002-426KOPTECH 纯（未变性）无水（200 proof/100%）乙醇
护目镜VWR89130-918Kimberly-Clark 专业安全眼镜
口罩VWR95041-774DUKAL 公司外科口罩
滤纸Sigma AldrichZ240087Whatman 1 号纤维素滤纸
福尔马林溶液Sigma AldrichHT501128-4L10% 中性缓冲福尔马林
人新鲜切除肿瘤（浸润性导管癌，IDC）国家疾病研究互换组织（NDRI 生物样本库N/A已与 NDRI 签署协议，规定所需肿瘤类型
IRADECON 漂白液VWR89234-816预稀释次氯酸钠漂白溶液
KIMTECH SCIENCE 擦拭巾VWR21905-026Kimberly-Clark 专业 Kim 擦拭巾
实验服VWR10141-342该目录号对应中号实验服
实验室镊子/钳子VWR82027-388任何实验室镊子均可使用，只要不会损伤组织
液体样品架（两个石英窗片，中间夹有 0.1 mm 聚四氟乙烯垫片）TeraView, LtdN/A直径 1"，厚度 0.1452" 的石英窗片
丁腈手套VWR82026-426该目录号对应中号手套
氮气钢瓶AirgasNI UHP300高纯氮气，5.0 级，300 型
纸巾VWR14222-32111" x 8.78" 单层纸张
Parafilm 封口膜VWR52858-076柔性热塑性材料，卷状防水膜，内衬纸张以防自粘
培养皿VWR470210-568VWR 培养皿，可滑动单层平板（底部无分隔）
聚苯乙烯板Home Depot1S11143A从 11" x 14" x 0.05" 无眩光聚苯乙烯板上切割出的约 10 cm x 10 cm 正方形片
ScanAcquire 软件TeraView, LtdN/A用于太赫兹反射成像测量的系统软件
不锈钢低剖面刀片（#4689）VWR25608-964Tissue-Tek Accu-Edge 一次性切片机刀片
不锈钢金属托盘Quick Medical10FPolar Ware 不锈钢医疗器械托盘
组织标记染料Ted Pella, Inc黄色染料 #27213-1
红色染料 #27213-2
蓝色染料 #27213-4		用于标记切除组织样本的方向
，以便送至组织病理学实验室
TPS Spectra 3000TeraView, LtdN/A太赫兹成像与光谱系统
TPS Spectra 软件TeraView, LtdN/A用于太赫兹透射光谱测量的系统软件

参考文献

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