通过小脑延髓池注射诱导软脑膜细胞修饰

摘要

我们介绍一种采用针尖弯曲的颅池内注射技术，该针可固定于颅骨上，从而避免对下方实质组织造成损伤。该方法可用于软脑膜细胞的遗传谱系示踪和操作，以及脑脊液流动的追踪研究。

摘要

本文所述方案介绍了一种安全、手动经小脑延髓池注射溶液的方法，同时避免对下方脑实质造成损伤。以往发表的方案建议使用直针头，将其下降至距硬脑膜表面最多1-2 mm处。然而，当硬脑膜被刺穿后阻力突然降低，导致针头难以保持稳定位置。我们的方法则采用针尖弯曲的针头，可将其稳定抵住颅骨枕骨部位，从而在硬脑膜穿刺后防止针头进一步刺入组织。该操作简便、可重复性强，且不会对实验动物造成长期不适。我们以血管软脑膜细胞的遗传谱系示踪为背景，描述了经小脑延髓池注射的技术策略。此外，该技术还可用于探讨多种科研问题，例如通过遗传性基因敲除手段，研究软脑膜在神经发育过程中的作用以及细菌性脑膜炎的扩散机制。同时，该操作还可与自动化输注系统结合，实现持续给药，并可通过注射荧光标记分子来追踪脑脊液的流动。

引言

软脑膜细胞是一类成纤维细胞样的细胞群体，排列成一层覆盖在脑表面的薄膜，表达与胶原交联相关的基因（例如 Dcn 和 Lum），以及参与形成脑-脑膜屏障的基因（例如 Cldn11）^1,2。软脑膜细胞参与多种生理功能，从严格调控脑脊液引流³到引导发育中大脑的神经前体细胞迁移^4,5。最近一项研究还提出，新生个体的软脑膜可能含有类似放射状胶质细胞的细胞，这些细胞可迁移到脑实质中并发育成功能性的皮层神经元⁶。

软脑膜细胞位于表层星形胶质细胞附近，并与它们以及其他实质星形胶质细胞共同表达连接蛋白-30（Cx30）⁷。以下所述的手术操作可通过一次向条件性在Cx30⁺细胞中表达tdTomato的转基因小鼠（即采用CreER-loxP系统进行谱系示踪）的延髓池注射他莫昔芬活性代谢物endoxifen，实现对这些脑膜细胞广泛且特异性的标记。Endoxifen是他莫昔芬的活性代谢产物，能够以与他莫昔芬相同的方式诱导表达CreER的细胞发生重组。然而，由....

方案

本文所述手术程序已获斯德哥尔摩北部动物实验伦理委员会批准，并依照研究机构（瑞典卡罗林斯卡学院）提供的规范进行。

注意：小脑延髓池注射可根据多种研究目的灵活调整。以下介绍一种通过向携带R26R-tdTomato¹²和CreER（后者由Cx30启动子驱动¹³）转基因小鼠品系注射他莫昔芬类似物endoxifen，以高效标记软脑膜细胞并进行命运图谱分析的实验方案。通过使用相同的注射程序注入病毒载体，也可实现对该类细胞群体的标记。最后，通过灌注荧光示踪剂，该方法还可用于追踪脑脊液流动。

1. 注射系统的准备

注意：建议在合适的手术室和无菌条件下进行该操作。手术器械可通过加热（高压灭菌器、玻璃珠灭菌器）进行灭菌，若器械对热敏感，则可使用高效化学消毒剂进行消毒。若采用化学消毒，使用前需将器械冲洗干净；若采用加热消毒，则需待其冷却后再使用。

1. 使用镊子将注射器针头在距尖端3 mm处弯成30°角。
   注意：请使用带有30 G斜面针头的Hamilton注射器。
2. 配制浓度为1 mg/mL的他莫昔芬代谢产物（endoxifen）溶液，用10% DMS....

结果

在表达CreER的转基因小鼠中通过小脑延髓池注射给予他莫昔芬代谢产物内氧他莫昔芬¹³ 且一种可诱导的荧光报告系统能够实现对软脑膜细胞的特异性重组，而不会标记邻近表达 Cx30 的皮层表面及实质星形胶质细胞（图1）。为了进入小脑延髓池，需将麻醉后的动物摆放成其身体与头部呈约 120°，从而使其颈部后侧被拉伸（图1A）。通过钝性分离颈部肌肉，暴露硬脑膜的枕骨大孔-寰椎部分，从而进入其下方的小脑延髓池。使用预先弯折成约 30° 距尖端3 mm处。这使得注射器能够紧贴颅骨的枕骨，从而在给药过程中提高稳定性（图1B）。利用脑脊液的生理运动，他莫昔芬溶液被分布至整个蛛网膜下腔，从而高效地重组覆盖嗅球、大脑皮层和小脑的软脑膜细胞（图1<.......

讨论

本文所述方案提供了一种简单且可重复的标记软脑膜细胞以进行命运图谱分析的流程。我们通过向Cx30-CreER; R26R-tdTomato小鼠^12,13脑池内注射他莫昔芬的活性代谢产物——依多昔芬，诱导tdTomato荧光报告基因的表达。

与其他通过小脑延髓池获取脑脊液的方案相比⁹，我们的方法采用弯针并可将其固定于颅骨枕骨部位，从而确保操作过程的安全性和手动给药的稳定性。当穿刺针穿透小脑延髓池的硬脑膜时，会突然感受到阻力下降。此时，其他方案通常建议将针尖进一步推进至硬膜表面下最多1–2 mm，并在整个操作过程中手动保持其位置稳定⁹。与直针不同，钩状针可牢固固定于颅骨，避免针尖在组织中过度深入，从而消除了损伤下方小脑或延髓的风险。我们的钩状针系统使得溶液给药更为安全，尤其是在采用缓慢输注速率时。

本文所述操作过程预计不会对实验动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉装置	Univentor 410	8323102	包含蒸发器、腔室以及连接腔室与小鼠头部固定器的管路的完整系统
麻醉剂（异氟烷）	Baxter Medical AB	000890
聚维酮碘	Sigma-Aldrich	PVP1
卡洛芬	Orion Pharma AB	014920	商品名为 Rymadil
氰基丙烯酸酯胶水	Carl Roth	0258.1	可选用 5-0 丝线作为替代
Medbond 组织胶	Stoelting	50479
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
内多昔芬	Sigma-Aldrich	E8284
70% 乙醇	Histolab	01370
哈密尔顿注射器（30 G 斜面针头）	Hamilton	80300
利多卡因	Aspen Nordic	520455
小鼠头部固定器	Narishige International	SGM-4	带用于吸入麻醉剂的口部组件。也可使用立体定位仪作为替代
剪刀	Fine Science Tools	15009-08
剃毛器	Aesculap	GT420
无菌吸收棒	Fine Science Tools	18105-01	无菌棉签也是良好选择
手术分离器	World Precision Instrument	501897
镊子	Dumont	11251-35
Viscotears	Bausch&Lomb Nordic AB	541760