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方法文章

使用酰基树脂辅助捕获法检测蛋白质S-酰化

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DOI：

10.3791/61016

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2020年4月10日

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, McGovern Medical School at UT Health, 2MD Anderson UT Health Graduate School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

酰基-RAC（Acyl-Resin Assisted Capture）是一种高灵敏度、可靠且易于操作的方法，可用于检测多种生物样本中半胱氨酸残基的可逆脂质修饰（S-酰基化）。

摘要

蛋白质S-酰基化，也称为S-棕榈酰化，是指通过不稳定的硫酯键将长链脂肪酸可逆地修饰到半胱氨酸残基上的一种翻译后修饰。S-酰基化正逐渐成为一种广泛存在的调控机制，能够调节蛋白质生物学活性的几乎所有方面，从复合物形成到蛋白质转运及蛋白质稳定性。近年来在理解蛋白质S-酰基化生物学功能方面取得的进展，在很大程度上得益于新型生物化学工具的发展，这些工具可在多种生物样本中实现对蛋白质S-酰基化的高效且灵敏的检测。本文中，我们描述了酰基树脂辅助捕获法（Acyl-RAC），这是一种最近开发的方法，基于硫醇反应性Sepharose珠选择性捕获内源性S-酰基化蛋白质。与现有方法相比，Acyl-RAC所需步骤更少，当与质谱联用以鉴定新的S-酰基化靶标时，可获得更可靠的结果。该技术的一个主要局限性在于无法区分通过相同硫酯键连接在半胱氨酸上的不同脂肪酸种类。

引言

S-酰化是一种可逆的翻译后修饰，通过不稳定的硫酯键将脂肪酰基链添加到靶蛋白内部的半胱氨酸残基上1。该修饰最初被报道为蛋白质与棕榈酸（一种饱和的16碳脂肪酸）发生的修饰2，因此这种修饰通常被称为S-棕榈酰化。除了棕榈酸外，蛋白质还可被多种其他脂肪酸可逆地修饰，包括更长或更短的饱和脂肪酸（如肉豆蔻酸和硬脂酸）、单不饱和脂肪酸（如油酸）以及多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸和二十碳五烯酸）3,4,5,6,7。在真核细胞中，S-酰化由一类称为DHHC蛋白酰基转移酶的酶家族催化，而半胱氨酸去酰化的逆反应则由蛋白硫酯酶催化，但大多数此类酶的功能仍尚不明确8。

硫酯键的不稳定性使得这种脂质修饰具有可逆性，从而能够动态调控蛋白质聚集、质膜定位、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质稳定性9,10。因此，S-酰化修饰已被发现与多种疾病相关，包括亨廷顿病、阿尔茨海默病以及多种癌症（如前列腺癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌），这促使人们亟需建立可靠的方法来检测这种翻译后蛋白质修饰11。

使用放射性标记的棕榈酸（[3H]、[14C] 或 [125I]）进行代谢标记是最早开发用于检测蛋白质S-酰化的方法之一12,13,14。然而，基于放射性标记的方法存在健康风险，灵敏度较低，耗时较长，且仅能检测高丰度蛋白质的脂化修饰15。相较于放射性标记，一种更快且非放射性的替代方法是使用生物正交脂肪酸探针进行代谢标记，该方法已被常规用于检测蛋白质S-酰化的动态过程16。在此方法中，带有化学报告基团（炔基或叠氮基）的脂肪酸通过蛋白质酰基转移酶被整合到S-酰化蛋白中。随后可通过叠氮-炔基Huisgen环加成反应（即点击化学） 将功能化基团（如荧光染料或生物素）连接至已整合的脂肪酸，从而实现对S-酰化蛋白的检测17,18,19。

酰基-生物素交换（ABE）是一种广泛使用的生化方法，用于捕获和鉴定S-酰化蛋白，该方法克服了代谢标记的一些局限性，例如不适用于组织样本15。该方法可用于多种生物样本中S-酰化修饰的分析，包括组织和冷冻细胞样本20,21。该方法基于中性羟胺选择性裂解酰基与半胱氨酸残基之间的硫酯键。释放的巯基随后通过巯基反应性生物素衍生物进行捕获。所生成的生物素化蛋白可通过链霉亲和素琼脂糖进行亲和纯化，并通过免疫印迹进行分析。

随后提出了一种称为酰基-树脂辅助捕获（acyl-resin assisted capture, Acyl-RAC）的替代方法，该方法通过硫醇反应性树脂直接偶联游离半胱氨酸，从而取代了生物素标记步骤22,23。与ABE方法相比，该方法步骤更少，同样可用于检测多种样本中的蛋白质S-酰基化修饰1。

酰基-RAC 包含四个主要步骤（图1）：
1. 封闭游离巯基；
2. 使用中性羟胺（HAM）选择性裂解半胱氨酸-酰基硫酯键，暴露出半胱氨酸的巯基；
3. 利用巯基反应性树脂捕获脂化修饰的半胱氨酸；
4. 经还原缓冲液洗脱后，选择性富集 S-酰化蛋白。

捕获的蛋白质可通过免疫印迹进行分析，或进行基于质谱（MS）的蛋白质组学分析，以评估多种物种和组织中的S-酰化蛋白质组22,24,25。通过胰蛋白酶消化捕获的蛋白质，并利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析所产生的肽段，还可鉴定出具体的S-酰化位点22。本文中，我们展示了酰基-RAC方法如何用于在细胞系和组织样本中同时检测多种蛋白质的S-酰化修饰。

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方案

本方案中使用的小鼠均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南实施安乐死。休斯敦德克萨斯大学健康科学中心动物福利委员会已批准所有动物实验操作。

1. 细胞裂解液的制备

  1. 按照所述方法配制裂解缓冲液 表1向10 mL PBS中加入0.1 g正十二烷基-β-D-麦芽糖苷去垢剂（DDM），旋转溶解。加入100 µL磷酸酶抑制剂混合物2、ML211（10 µM）、PMSF（10 mM）和蛋白酶抑制剂混合物（1×），使用前将缓冲液置于冰上预冷。
  2. 将含有细胞的所需培养基从培养箱中转移至15 mL或50 mL离心管中，以350 x g离心细胞 g 5 分钟后吸除上清，以去除细胞碎片。
    注意：我们使用了 1 x 107 每个酰基-RAC反应所需的细胞。
  3. 将沉淀物重悬于5 mL PBS中，洗涤，然后以350 x g离心 g 5 分钟。
    注意：执行步骤1.3时需迅速操作，以避免因在PBS中孵育时间过长而导致细胞裂解。
  4. 向沉淀中加入600 µL步骤1.1中配制的裂解缓冲液，在4 °C下于恒温振荡器中以1500 rpm振荡30分钟，进行裂解。
  5. 20,000 × g 离心澄清裂解液 g 在4 ˚C下离心30分钟，使去垢剂不溶性物质沉淀。收集上清裂解液至预冷的1.5 mL离心管中，并置于冰上保存。
  6. 通过 Bradford/BCA 法测定蛋白质浓度。在开展实验前，确保不同样品间蛋白质用量一致至关重要。我们建议每反应体系使用至少 500 µg 蛋白质。
    注意：在所述实验中，我们使用了培养的（Jurkat）细胞以及来自小鼠组织的原代脾细胞。上述裂解方法也可适用于其他细胞类型。上述细胞类型的平均蛋白浓度约为每 1 × 10⁶ 个细胞 500 µg。7 细胞。Jurkat 细胞在 RPMI-1640 培养基中培养，培养基经改良后含有 2 mM L-谷氨酰胺、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠、4,500 mg/L 葡萄糖和 1,500 mg/L 碳酸氢钠，并添加 10% 胎牛血清，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。2我们使用了 1 x 107 每反应所需的Jurkat细胞。初级脾细胞按所述方法从小鼠脾脏组织中分离26简而言之，脾组织在冰上研磨后，用低渗溶液裂解红细胞，并通过离心法将淋巴细胞分离。我们使用了1 x 107 每反应所需的原代细胞数

2. 酰基-RAC：封闭游离巯基

注意：所有后续步骤均可在室温（RT）下进行。

  1. 将裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，并按下述方法进行氯仿-甲醇（CM）沉淀。
    1. 加入甲醇（MeOH）和氯仿（CHCl3) 按照裂解液:甲醇:氯仿的最终比例加入裂解液3 2:2:1的比例混合并剧烈振荡，形成均一的悬浮液。
    2. 以 10,000 x 转速离心 g 5分钟，以在水相和有机相之间的界面处形成沉淀（“薄饼”状）。
    3. 倾斜试管，使用针头或加样枪头尽可能吸出溶剂。
    4. 将蛋白沉淀在空气中干燥几分钟，然后加入 600 µL 甲醇，轻轻混匀以清洗沉淀，注意避免破坏沉淀块
    5. 小心移除残留的甲醇，并将蛋白质沉淀物在实验台上风干约5分钟。
    6. （可选）在甲醇洗涤后，可额外进行一次离心步骤，以沉淀可能破碎的沉淀物，避免样品损失。
      注意：实验可在条件培养基沉淀步骤后停止。一旦获得沉淀物，可将其保存在500 µL甲醇中，置于-20 °C，最多可保存一周。
      1. 将蛋白沉淀物溶于200 µL 2SHB缓冲液中，在恒温振荡器中于42 °C、1500 rpm条件下涡旋振荡，直至沉淀完全溶解。
    7. （可选）在超声水浴中额外孵育 5–10 分钟，以溶解沉淀。
      注意：超声处理的时间长短取决于材料的溶解度。然而，长时间超声可能导致蛋白质降解。
  2. 将2 µL MMTS加入998 µL 2SHB缓冲液中，配制0.2%（v/v）的甲基甲硫磺酸酯（MMTS）溶液。
    注意：每次实验均需使用新配制的0.2% MMTS。
  3. 向每支试管中加入200 µL含0.2% MMTS的2SHB，使MMTS终浓度为0.1%。在热振荡仪中于42 ˚C、1500 rpm条件下振荡孵育15分钟。

3. 酰基-RAC：羟胺（HAM）裂解并捕获S-酰化蛋白

  1. 重复上述 3–4 次 CM 沉淀以去除 MMTS。可通过 MMTS 气味是否消失来估计其去除程度。每次沉淀后，将沉淀物在 100 µL 2SHB 缓冲液中涡旋振荡（42 ˚C、1500 rpm）直至完全溶解，然后加入 300 µL Buffer A 稀释。
  2. 最后一次沉淀后，按上述方法将样品溶解于 200 µL 2SHB 缓冲液中，并加入 240 µL Buffer A 稀释。
  3. 若需比较不同处理条件下 S-酰化水平的变化，应再次测定蛋白浓度，并确保每种条件使用等量的蛋白进行后续操作。
  4. 从每个样品中保留 40 µL 作为输入对照。
  5. 将样品均分为两份，每份 200 µL，并标记为“+ HAM”和“- HAM”。向其中一份（+ HAM）加入 50 µL 新鲜配制的中性 2 M HAM（pH 7.0–7.5），使其终浓度为 400 mM；向另一份（- HAM）加入 50 µL 中性 2 M NaCl 作为阴性对照。随后进行硫丙基-Sepharose（TS）珠的添加。
    注意：实验可在任意一次 CM 沉淀步骤后暂停。一旦获得沉淀物，可将其保存在 500 µL 甲醇中，置于 -20 °C 最多一周。2 M HAM 需保持中性 pH，以确保其对酰基-半胱氨酸硫酯键的选择性，pH 应仔细调节。操作 2SHB 缓冲液中的样品时应小心，避免因过度起泡导致样品损失。后续所有步骤中，- HAM 与 + HAM 样品的处理方式相同。
  6. 向每个管中加入 30 µL TS 珠悬液，并在室温下旋转孵育 1–2 小时。
  7. 用含 1% SDS 的 Buffer A 洗涤 TS 珠 4 次，以去除残留的 HAM。
    1. 使用微量离心机以 1 分钟轻柔离心所有珠样品，并小心吸除上清液。
    2. 将珠重悬于 500 µL 含 1% SDS 的 Buffer A 中。
    3. 重复步骤 3.7.1–3.7.2 三次。
      注意：活化的硫丙基-Sepharose（TS）珠通常以冻干形式提供，并含有必须在中性 pH 条件下洗去的添加剂。建议使用蒸馏水进行溶胀和洗涤。称取 0.1 g 珠，重悬于 1 mL 蒸馏水中，在室温下旋转 30 分钟至 1 小时使其充分溶胀。用 Buffer A 洗涤一次，然后按 50% 沉降珠体积与 50% Buffer A 的比例制备悬液。溶胀后的 TS 珠可在含 20% 乙醇的中性 pH 溶液中于 4 °C 保存最多一周。请勿使用叠氮化钠作为抑菌剂，因为叠氮离子会与 2-吡啶二硫键发生反应。为获得更高效率，建议使用新鲜制备的珠。操作珠时，可将 P200 移液器吸头尖端略微剪切，以防止对珠造成损伤。
      注意：实验可在 CM 沉淀后的任意阶段暂停。沉淀物可保存在 500 µL 甲醇中，置于 -20 °C 最多一周。

4. S-酰化蛋白的洗脱与检测

  1. 最后一次洗涤后，按照上述方法轻轻离心磁珠，并尽可能吸除上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。
  2. 使用含DTT的4x SDS上样缓冲液从磁珠中回收蛋白质。
    1. 向磁珠中加入50 µL的4x SDS上样缓冲液，在热振荡仪中于80 ˚C、1500 rpm条件下孵育15分钟。让离心管冷却。
    2. 以5,000 x g离心3分钟，使磁珠完全沉淀，然后用加样枪头将洗脱的蛋白质转移至新的1.5 mL离心管中。
  3. 进行SDS-PAGE电泳，并通过蛋白质印迹法分析目标蛋白的S-酰化修饰情况。

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结果

根据上述方案，我们首先采用酰基-RAC方法，同时检测Jurkat细胞中多种蛋白质的S-酰基化修饰。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞系，最初来源于一名T细胞白血病患者的外周血27。我们选取了先前已被鉴定为发生S-酰基化的调节性T细胞蛋白9,28,29，以展示该方法的应用价值。如图2A所示，在使用中性2 M盐酸羟胺处理的裂解液中可检测到酪氨酸激酶Lck（+ HAM泳道），该试剂可断裂半胱氨酸残基与脂肪酸基团之间的硫酯键。而使用2 M NaCl处理的样品（- HAM泳道）则作为重要的阴性对照，表明该检测方法对硫酯键具有选择性。输入样泳道（input lane）进一步验证了信号的特异性；若目标蛋白未发生S-酰基化，该泳道也可作为阳性对照。随后，将膜剥离并重新用Fyn和LAT蛋白的抗体进行杂交，以证明酰基-RAC实验可同时分析多个蛋白的S-酰基化状态（...

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讨论

在此，我们成功利用酰基-RAC检测法在培养的人源细胞及从小鼠组织中分离的原代细胞中检测了特定蛋白质的S-酰基化修饰。该方法操作简便、灵敏度高，仅需常规生物化学技术及最低限度的仪器设备即可完成。该方法已成功鉴定出多种新型S-酰基化蛋白，例如蛋白质转运系统β亚基（Sec61b）、核糖体蛋白S11（Rps11）以及微粒体谷胱甘肽-S转移酶3（MGST3）22酰基-RAC 的灵敏性和适应性使其适用于在多种生物样本中研究蛋白质 S-酰基化。

大量S-酰化蛋白可能与质膜中富含糖鞘脂的区域（也称为脂筏）相关联。因此，若使用温和的去垢剂（如Triton X-100、NP-40或Brij58）进行细胞裂解，部分S-酰化蛋白可能无法被充分提取30。阴离子去垢剂（如SDS）或基于麦芽糖苷的非离子型去垢剂（如正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM））可用于确保脂筏结构的解离，从而实现目标蛋白的完全回收30,

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院基金5R01GM115446和1R01GM130840的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合片剂Sigma11836170001
Eppendorf 离心机 5424Eppendorf22620444
盐酸羟胺（HAM）Sigma159417
甲基甲烷硫代磺酸盐（MMTS）Sigma64306
微型管旋转混合器LabForce
ML211Cayman17630
Multi-Therm 冷热振荡仪Benchmark ScientificH5000-HC
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）SigmaD641
磷酸酶抑制剂混合液 2SigmaP5726
硫丙基-Sepharose 6B（TS）SigmaT8387
Ultrasonics Quantrex 超声破碎仪L & R

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酰基-RAC 方法硫酯键断裂羟胺处理氯仿-甲醇沉淀TS 珠悬浮液SDS-PAGE 蛋白质印迹蛋白质浓度测定生物样本分析S-酰基化检测
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