酰基-RAC（Acyl-Resin Assisted Capture）是一种高灵敏度、可靠且易于操作的方法，可用于检测多种生物样本中半胱氨酸残基的可逆脂质修饰（S-酰基化）。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质S-酰基化，也称为S-棕榈酰化，是指通过不稳定的硫酯键将长链脂肪酸可逆地修饰到半胱氨酸残基上的一种翻译后修饰。S-酰基化正逐渐成为一种广泛存在的调控机制，能够调节蛋白质生物学活性的几乎所有方面，从复合物形成到蛋白质转运及蛋白质稳定性。近年来在理解蛋白质S-酰基化生物学功能方面取得的进展，在很大程度上得益于新型生物化学工具的发展，这些工具可在多种生物样本中实现对蛋白质S-酰基化的高效且灵敏的检测。本文中，我们描述了酰基树脂辅助捕获法（Acyl-RAC），这是一种最近开发的方法，基于硫醇反应性Sepharose珠选择性捕获内源性S-酰基化蛋白质。与现有方法相比，Acyl-RAC所需步骤更少，当与质谱联用以鉴定新的S-酰基化靶标时，可获得更可靠的结果。该技术的一个主要局限性在于无法区分通过相同硫酯键连接在半胱氨酸上的不同脂肪酸种类。
引言
S-酰化是一种可逆的翻译后修饰，通过不稳定的硫酯键将脂肪酰基链添加到靶蛋白内部的半胱氨酸残基上1。该修饰最初被报道为蛋白质与棕榈酸（一种饱和的16碳脂肪酸）发生的修饰2，因此这种修饰通常被称为S-棕榈酰化。除了棕榈酸外，蛋白质还可被多种其他脂肪酸可逆地修饰，包括更长或更短的饱和脂肪酸（如肉豆蔻酸和硬脂酸）、单不饱和脂肪酸（如油酸）以及多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸和二十碳五烯酸）3,4,5,6,7。在真核细胞中，S-酰化由一类称为DHHC蛋白酰基转移酶的酶家族催化，而半胱氨酸去酰化的逆反应则由蛋白硫酯酶催化，但大多数此类酶的功能仍尚不明确8。
硫酯键的不稳定性使得这种脂质修饰具有可逆性，从而能够动态调控蛋白质聚集、质膜定位、细胞内运输、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质稳定性9,10。因此，S-酰化修....
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方案
本方案中使用的小鼠均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南实施安乐死。休斯敦德克萨斯大学健康科学中心动物福利委员会已批准所有动物实验操作。
1. 细胞裂解液的制备
- 按照所述方法配制裂解缓冲液 表1向10 mL PBS中加入0.1 g正十二烷基-β-D-麦芽糖苷去垢剂（DDM），旋转溶解。加入100 µL磷酸酶抑制剂混合物2、ML211（10 µM）、PMSF（10 mM）和蛋白酶抑制剂混合物（1×），使用前将缓冲液置于冰上预冷。
- 将含有细胞的所需培养基从培养箱中转移至15 mL或50 mL离心管中，以350 x g离心细胞 g 5 分钟后吸除上清，以去除细胞碎片。
注意：我们使用了 1 x 107 每个酰基-RAC反应所需的细胞。 - 将沉淀物重悬于5 mL PBS中，洗涤，然后以350 x g离心 g 5 分钟。
注意：执行步骤1.3时需迅速操作，以避免因在PBS中孵育时间过长而导致细胞裂解。 - 向沉淀中加入600 µL步骤1.1中配制的裂解缓冲液，在4 °C下于恒温振荡器中以1500 rpm振荡30分钟，进行裂解。
- 20,000 × g 离心澄清裂解液 g 在4 ˚C下离心30分钟，使去垢剂不溶性物质沉淀。收集上清裂解液至预冷的1.5 mL离....
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结果
根据上述方案，我们首先采用酰基-RAC方法，同时检测Jurkat细胞中多种蛋白质的S-酰基化修饰。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞系，最初来源于一名T细胞白血病患者的外周血27。我们选取了先前已被鉴定为发生S-酰基化的调节性T细胞蛋白9,28,29，以展示该方法的应用价值。如图2A所示，在使用中性2 M盐酸羟胺处理的裂解液中可检测到酪氨酸激酶Lck（+ HAM泳道），该试剂可断裂半胱氨酸残基与脂肪酸基团之间的硫酯键。而使用2 M NaCl处理的样品（- HAM泳道）则作为重要的阴性对照，表明该检测方法对硫酯键具有选择性。输入样泳道（input lane）进一步验证了信号的特异性；若目标蛋白未发生S-酰基化，该泳道也可作为阳性对照。随后，将膜剥离并重新用Fyn和LAT蛋白的抗体进行杂交，以证明酰基-RAC实验可同时分析多个蛋白的S-酰基化状态（.......
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讨论
在此，我们成功利用酰基-RAC检测法在培养的人源细胞及从小鼠组织中分离的原代细胞中检测了特定蛋白质的S-酰基化修饰。该方法操作简便、灵敏度高，仅需常规生物化学技术及最低限度的仪器设备即可完成。该方法已成功鉴定出多种新型S-酰基化蛋白，例如蛋白质转运系统β亚基（Sec61b）、核糖体蛋白S11（Rps11）以及微粒体谷胱甘肽-S转移酶3（MGST3）22酰基-RAC 的灵敏性和适应性使其适用于在多种生物样本中研究蛋白质 S-酰基化。
大量S-酰化蛋白可能与质膜中富含糖鞘脂的区域（也称为脂筏）相关联。因此，若使用温和的去垢剂（如Triton X-100、NP-40或Brij58）进行细胞裂解，部分S-酰化蛋白可能无法被充分提取30。阴离子去垢剂（如SDS）或基于麦芽糖苷的非离子型去垢剂（如正十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM））可用于确保脂筏结构的解离，从而实现目标蛋白的完全回收30,
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院基金5R01GM115446和1R01GM130840的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| cOmplete 蛋白酶抑制剂混合片剂 | Sigma | 11836170001 | |
| Eppendorf 离心机 5424 | Eppendorf | 22620444 | |
| 盐酸羟胺（HAM） | Sigma | 159417 | |
| 甲基甲烷硫代磺酸盐（MMTS） | Sigma | 64306 | |
| 微型管旋转混合器 | LabForce | ||
| ML211 | Cayman | 17630 | |
| Multi-Therm 冷热振荡仪 | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM） | Sigma | D641 | |
| 磷酸酶抑制剂混合液 2 | Sigma | P5726 | |
| 硫丙基-Sepharose 6B（TS） | Sigma | T8387 | |
| Ultrasonics Quantrex 超声破碎仪 | L & R |
参考文献
- Bijlmakers, M. J. Protein acylation and localization in T cell signaling. Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).
- Magee, A. I., Courtneidge, S. A. Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells. EMBO Journal. 4 (5)....
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重印与许可
