使用毛细管气溶胶发生器连续制备受控气溶胶用于非临床研究

摘要

本方案描述了毛细管气溶胶发生器的设置与使用方法，可用于从多物种液体溶液中持续产生受控气溶胶，适用于稳定的大体积气溶胶递送（例如，体内吸入研究）。

摘要

毛细管气溶胶发生器（CAG）的工作原理基于热液蒸发，即首先通过加热电子烟液使其蒸发，随后通过调节气流混合控制成核与冷凝过程，从而生成气溶胶，类似于电子烟（EC）中的过程。CAG 特别适用于连续生成大量气溶胶，例如在以下情况中 体内 吸入毒理学研究中，当无法使用电子烟（ECs）时，可通过CAG产生气溶胶。CAG在生成气溶胶过程中的热效应与电子烟所应用的温度相似，因而使研究人员能够以可扩展且可重复的方式评估电子烟液蒸气。由于CAG的操作允许用户控制关键参数，如烟液流速、加热温度和稀释空气流量，研究人员可在高度可控的装置中测试多种电子烟液配方。气溶胶粒径等特性已被证明可通过调节空气流速与烟液流速及烟液成分之间的关系加以调控。然而，CAG在评估电子烟常见问题（如元件过热）方面存在局限性。本研究旨在通过评估选定电子烟液配方所产生的气溶胶的化学与物理特性，证明CAG能够生成可重复且持续的气溶胶。本方案描述了为优化所需气溶胶浓度和粒径而设定的液体流速、稀释空气流速及操作程序等运行参数。 体内 毒理学研究。通过展示该方案的代表性结果，并讨论使用CAG所面临的挑战与应用，我们证明CAG可被以可重复的方式使用。该技术与方案基于前期研究发展而来，可为未来实验室可控气溶胶生成研究的创新提供基础。

引言

常见的电子烟液包含丙二醇、甘油、水、尼古丁和选定的香料的混合物。由电子烟设备产生的气溶胶成分不仅取决于液体配方，还取决于设备的材料、设计和特性。因此，许多电子烟设备可能导致气溶胶输出存在较大变异性¹，包括设备特异性地产生较高水平的非预期成分、单次吸气体积的变化、因通风孔堵塞导致的气流改变，以及"干烧"现象（当液体容器接近空置时，部分输入能量未能用于液体蒸发，导致设备过热）²。此外，在长期吸入研究过程中，对电子烟设备进行充电、补充液体和清洁将带来巨大的后勤负担³。基于这些原因，在避免气溶胶成分受设备差异影响并降低工作负荷的同时，应考虑使用其他气溶胶发生器用于大规模气溶胶生产及对液体配方的准确评估^4,5。然而，设备生成的气溶胶仍应作为风险评估策略的一部分，因为由于电子烟设备特有的加热/冷却特性，某些成分的浓度可能高于实验室控制的标准气溶胶发生器所产生的水平^6,7,8。

由于目前可获取的关于监管要求的信息有限，针对电子烟（EC）产生的气溶胶潜在毒性的评估方法仍在不断发展中^9,10,11。然而，准确的体外（in vitro）和体内（in vivo）评估需要随时间生成特征明确且可重复的气溶胶体积。通过电子烟设备在受控抽吸条件下产生气溶胶，无疑最能代表用户的实际使用情况。在监管毒性研究中，考虑到用户可能自行配制多种不同的液体配方，同时还需要调整某些设备参数（例如输出能量），使用电子烟设备进行长期重复暴露的毒理学研究不仅具有挑战性，而且可能并不充分。

毛细管气溶胶发生器（CAG）由菲利普莫里斯公司开发^12,13，并由弗吉尼亚联邦大学进一步优化¹⁴，其工作原理是通过电加热毛细管产生一股热蒸气射流，随后用环境空气对其进行冷却，从而引发颗粒成核及后续的冷凝过程，最终形成气溶胶。由于在电子烟（EC）中导致气溶胶形成的物理过程与之相同（区别仅在于CAG中通过泵将液体输送至毛细管，而在电子烟中通常由芯吸材料通过毛细作用将液体从储液器中引出），因此CAG生成的气溶胶特性与电子烟气溶胶非常相似¹⁴（图1）。CAG能够大量产生气溶胶，且操作简便，因此特别适用于体内吸入研究。

CAG 是一种实验室装置，由一根加热毛细管组成，该毛细管简单连接至温度控制器和液体储 reservoir 通过 蠕动泵（图2A）。毛细管（160 mm，21 G，不锈钢）由四个加热元件加热，所有加热元件均嵌入铝块中（图2B温度通常设定在250–275 °C，以模拟电子烟设备中线圈加热的条件¹⁵通过毛细管泵送的液体被加热并转化为从毛细管尖端喷出的热蒸气。CAG组件（图2C) 需要额外的元件将产生的蒸气与冷空气混合并形成气溶胶。高温过饱和蒸气与冷空气流的突然混合会导致成核，随后发生冷凝，从而形成气溶胶（图 2C）。在我们的CAG设计中（图3），额外的热空气流首先冷却外部装置，随后沿加热块循环以加热气流，同时防止毛细管尖端处液体回流的冷凝，并稳定蒸汽射流的喷发。此外，该气流会形成对热蒸气的非预期屏蔽，从而影响成核过程。因此，该气流的流速应尽可能小，并根据具体应用需求进行调整。该气流将被称为 "热气流" 在本手稿中，尽管必须明确该液流是通过加热块被动加热的，而非由用户主动加热。

冷却气流速率对所生成气溶胶颗粒的大小具有显著影响。在用于体内吸入研究的气溶胶生产过程中，稀释空气流将决定暴露剂量，并且在到达暴露室之前可能需要进一步稀释。除了气溶胶的化学组成外，表征气溶胶粒径分布（PSD）至关重要，以确保所生成的气溶胶与电子烟（ECs）产生的气溶胶相似，并符合经合组织（OECD）指南推荐的可吸入颗粒尺寸范围（通常基于粒径分布呈对数正态分布的假设，以质量中值空气动力学直径[MMAD]和几何标准偏差[GSD]作为参数化指标）。

所生成气溶胶的质量中值空气动力学直径（MMAD）可能因装置设计、配方的理化液体性质（如密度、黏度和表面张力）、气流速率以及决定热力学条件的温度而有较大差异^14,16,17。对于 体内 暴露实验中，气流通常由经过调节和过滤的空气组成，温度为 22 ± 2 °C，相对湿度为 60% ± 5%。随后可根据研究需求进一步稀释生成的气溶胶，以达到测试环境中目标浓度。然后将其输送 通过 将玻璃管连接至暴露室，以减少过滤损失。本文所示结果中，温度和气流参数的设置旨在证明，CAG 可用于持续生成具有稳定且可吸入的粒径分布（PSD）以及明确浓度的受控气溶胶。 在体 吸入研究

在本实验方案中，我们将介绍如何：1）组装气溶胶发生装置（CAG）；2）确定利用CAG产生气溶胶所需的参数；3）进行气溶胶生成；以及4）分析气溶胶中感兴趣的物理和化学组分。在这些初步实验中，我们采用一种基于气溶胶形成组分混合液的溶液，其组成为规定质量分数的丙二醇（PG）、甘油（VG）、水和尼古丁。最后，我们将分享实验中生成的复杂多组分混合物的示例数据（包括上述组分与额外添加的香料成分的混合物），并讨论整体结果、面临的挑战，以及该实验方法在评估此类混合物方面的适用性。

方案

1. CAG 系统组装

1. CAG的组装
   1. 将毛细管置于铝制加热块的毛细管槽中，输出端突出约5 mm。
   2. 轻轻拧紧铝制加热块两半部分的螺丝。
   3. 将加热元件（a）和热电偶（b）安装至铝制加热块（c）中，使导线从铝制后盖（d）穿出图 4A).
   4. 确保加热元件的导线已连接至适配器，并保持导线平直。
   5. 将内层聚醚醚酮（PEEK）管（g）与外层不锈钢（SS）管（e）组装在一起。确保两个4 mm的卡套式接头（f）牢固地紧固在外层不锈钢管（e）上（图4B).
   6. 将O形圈（3 × 30 mm）安装至内层PEEK管（g）的两个凹槽中，然后从前端将内层PEEK管（g）插入外层SS管（e）内。
   7. 将组装好的铝制加热元件放置在不锈钢后部背板（i）上，铝制后端盖朝向不锈钢后部背板，然后将内层PEEK/外层不锈钢管组件从铝制加热元件一端滑入，直至与不锈钢后部背板（i）紧密贴合图4C).
   8. 将铝制前盖（h）安装到内层PEEK管内的铝制加热元件上，确保毛细管略微从铝制前盖中伸出。将三根不锈钢导丝（j）安装在不锈钢后垫圈周围，并牢固拧紧。
   9. 将PEEK接头（k）套在内层PEEK管前端，确保PEEK接头卡入内层PEEK管前端的凹槽中。将25 mm定时器（l）套在PEEK接头外，并穿过三个不锈钢导向螺钉。用手拧紧定时器上的螺母，使PEEK接头固定牢固图4D).
   10. 将加热元件连接至温度控制器，将毛细管连接至蠕动泵和测试液体溶液。
   11. 将压缩空气连接至CAG以提供加热气流 通过 2 x 4 毫米插接接头（图4B，[f]。
   12. 将CAG与玻璃部件组装，并连接CAG冷却气流和一级稀释空气流（处理过的空气）； 图3）。必要时添加第二个稀释流动入口，以及气溶胶采样口和调节用T型接头（图5).
2. CAG 清洁程序
   1. 从CAG玻璃组件装置中取出CAG，并用干抹布擦拭玻璃，直至玻璃表面明显干燥。
   2. 观察CAG毛细管的输出是否存在堵塞。若在毛细管出口处观察到颗粒沉积，则更换毛细管。同样，当发现气溶胶输送量减少时，也应更换新的毛细管。
   3. 按照步骤 1.1.9 至 1.1.1 拆卸 CAG。
   4. 更换毛细管后，按照步骤 1.1.1 至 1.1.9 重新组装 CAG。

2. CAG 气溶胶浓度与稀释度的计算

1. 总稀释因子（TDF）的理论计算
   1. 根据液体配方的浓度（此处称为储备溶液/浓度）和液流速率（LFR）计算TDF：
      
      TDF：总稀释空气流量（L/min）
      C_Stock：储备液浓度（2%，w/w）
      LFR：液体流速（g/min）
      C_Target：目标浓度（µg/L）
   2. 使用含2%（w/w）尼古丁的溶液，目标尼古丁气溶胶浓度为15 µg/L，LFR为0.35 g/min，假设产率为100%，则结果如下：
      
      
2. 液流速率（LFR）的理论计算
   1. 根据液体储备溶液的浓度和TDF计算LFR：
      
      LFR：液体流速（g/min）
      C_Target：目标浓度（µg/L）
      TDF：总稀释空气流量（L/min）
      C_Stock：储备液浓度（%，w/w）
   2. 使用含2%（w/w）尼古丁的溶液，目标尼古丁气溶胶浓度为15 µg/L，TDF为300 L/min，假设产率为100%，则结果如下：
      
      
3. 基于实验数据的实际产率（%）计算
   1. 根据上述理论计算，进行初步工程运行，以量化实际气溶胶组分浓度（C_Actual），并获得CAG气溶胶的实际产率（AY）。通过使用相同的计算方法调整TDF或LFR，进一步微调气溶胶浓度。
      
      AY：实际产率（%）
      C_Actual：实际气溶胶组分浓度（µg/L）
      TDF：总稀释空气流量（L/min）
      C_Stock：储备液浓度（%，w/w）
      LFR：液体流速（g/min）
   2. 使用含2%（w/w）尼古丁的溶液，测得尼古丁气溶胶浓度为15 µg/L，TDF为320 L/min，LFR为0.35 g/min，则尼古丁的实际产率（AY）如下：
      
      

3. CAG 气溶胶生成

1. 启动气溶胶生成
   1. 称量并记录测试液体、磁力搅拌器及瓶子的质量，精确至0.01 g。液体储备液的配制成分见表1。
   2. 设定相应的气流参数（±5%）（图5）：
      加热气流：2 L/min
      冷却气流：10 L/min
      第一级稀释气流：150 L/min
      第二级稀释气流：160 L/min
      废气气流：172 L/min
   3. 将数字温度控制器的温度设定值设为250 °C，开始对CAG进行加热。
   4. 将含有磁力搅拌子的液体储备溶液置于磁力搅拌器上，并将蠕动泵的进样管插入测试溶液中。
   5. 开启蠕动泵，并将流速设定为LFR ±5%（g/min）。
   6. 当CAG温度达到250 ± 1 °C时，启动蠕动泵向CAG输送测试液体，开始生成气溶胶。
   7. 检查毛细管尖端附近是否产生气溶胶，并根据需要记录时间以计算质量流速。若未产生气溶胶，需重新检查所有设备和设置。若仍无气溶胶生成，则极有可能是毛细管堵塞，需更换毛细管。
2. 气溶胶生成过程中
   1. 每60分钟排空一次玻璃装置中冷凝的液体，以确保气溶胶生成的持续性和稳定性。
3. 停止气溶胶生成
   1. 将管路从测试液瓶中取出，切换至去离子水，并记录时间以计算质量流速。
   2. 待毛细管出口出现水蒸气后，关闭温度控制器，同时保持蠕动泵运行至少10分钟，以冲洗和清洁毛细管。
   3. 称量并记录测试液体及瓶子的质量，精确至0.01 g，并使用以下公式计算质量流速：
      
   4. 关闭用作加热气流的压缩空气。
   5. 如有必要，将CAG从组装装置中拆下，用干抹布清洁玻璃管路，并重新组装CAG。

4. 成分的分析测定

注意：气溶胶采样在两个位置进行：a）未稀释气溶胶（未稀释采样期间，第一级稀释空气和第二级稀释气流均关闭）；b）稀释气溶胶（所有稀释气流均开启）（图5）。在每个采样位置 a 和 b 处最多可提供三个采样端口，可用于同时采集空气微生物样本（ACM）以及其他用于分析气溶胶特性的设备或探头。采样管路垂直于气溶胶流动方向安装，并连接至真空泵，以便抽取一定体积的气溶胶（具体体积取决于泵的流速和采样时间）。

1. 气溶胶收集质量（ACM）的测定
   注意：气溶胶的颗粒相被截留在玻璃纤维滤膜（直径：44 mm，颗粒截留尺寸：1.6 µm）上。采样前后采用滤膜夹对滤膜进行称重，以尽量减少挥发性组分蒸发导致的称量损失。
   1. 将滤膜放入滤膜 holder 中，并安装滤膜盖。
   2. 在采样前，将带有滤膜的滤膜夹称重至最接近的 0.0001 g，并记录重量。
   3. 将装有滤膜的滤膜 holder 连接到气溶胶气流，开始采样。
   4. 样品采集后，称量带有滤膜支架和盖子的滤膜，并记录最终重量。
   5. 使用以下公式计算 ACM：
      
      ACM：ACM 浓度（µg/L）
      Wb滤膜及滤膜 holder 采样前的质量（g），精确至 0.0001 g
      Wa：采样后滤膜及滤膜 holder 的质量（g），精确至 0.0001 g
      V_气溶胶：通过滤膜的气溶胶体积（L），通过以下公式计算：
      采样时间（min）× 采样流量（L/min）
   6. 从滤膜 holder 中取出滤膜垫，放入含有 5 mL 乙醇的 25 mL 玻璃小瓶中。在实验室摇床中以 400 rpm 振荡 30 分钟，以提取 ACM。
   7. 将25 mL玻璃小瓶在290 x g下离心5分钟 g 并收集上清液用于PG/VG和尼古丁颗粒相的定量分析。
2. 尼古丁（或香料）浓度的测定
   注意：气溶胶被截留在含有特殊处理的宽孔硅藻土的样品柱中，硅藻土是一种化学惰性基质，可在 pH 1 至 13 范围内使用（图6).
   1. 在开始气溶胶样品采集前15分钟内制备样品柱。
      1. 为测定尼古丁浓度，加入2 mL 0.5 M硫酸；为测定香料成分，加入2 mL异丙醇。
   2. 检查采样流量。
      1. 打开真空泵，使用可精确至1 ccm/min的校准流量设备，连接采样柱至采样管路后检测流速。通过针阀调节流速至700 ccm/min ± 5%范围内。
      2. 关闭真空泵。
   3. 样本采集
      1. 根据样品柱的进样端和出样端，将两个接头添加到样品柱上（图6）。将管子连接至真空采样管线 通过 出口适配器。
      2. 将样品柱组件连接至取样口 通过 入口适配器
      3. 开启真空泵以开始样品采集。
      4. 记录采样开始时间。
      5. 在预设的采样时间后（未稀释的采样点A为10分钟，稀释的采样点B为30分钟），关闭真空泵并记录时间。
      6. 从采样口卸下样品柱。
      7. 从样品柱上取下接头，用封膜密封样品柱，以防止因蒸发或污染造成的样品损失。根据相应的样品名称标记样品柱。
      8. 将密封的样品柱置于冰箱中（2-8 °C）保存，直至分析。
   4. 羰基浓度的测定
      注意：羰基化合物被串联连接在装有溶解于乙腈中的2,4-二硝基苯肼（DNPH）的微型冲击式吸收管的玻璃纤维滤膜上捕获。
3. 捕获前的准备
   1. 向微型冲击式采样管中加入10 mL乙腈中的15 mM DNPH溶液。
      1. 制备滤纸垫（见第4.1段）。
      2. 检查采样流量
   2. 打开真空泵，使用经校准的流量设备检查采样管路的流速，该设备精度应达到1 ccm/min。通过针阀将流速调节至700 ccm/min ± 5%范围内。
      1. 关闭真空泵。
   3. 样本采集
      1. 将连接至微型冲击式采样管的滤膜 holder 与采样口相连。
      2. 将真空采样管连接到微型冲击式吸收管的出口。
      3. 开启真空泵以开始样品采集。
      4. 记录采样开始时间。
      5. 在预设的采样时间后（未稀释采样点a为10分钟，稀释采样点b为30分钟），关闭真空泵并记录时间。
      6. 将采样捕集器从采样口断开。
      7. 将冲击式吸收管中的液体排入玻璃小瓶中，用乙腈将DNPH溶液定容至10 mL。
      8. 称量滤垫重量，然后在DNPH-乙腈溶液中振荡提取。提取后弃去滤垫。
      9. 取1 mL羰基-DNPH溶液，加入50 µL吡啶以稳定该溶液。
      10. 将分装样品储存于 ≤-12 °C 的冷冻柜中，直至分析。

结果

CAG 气溶胶的可重复性
为证明 CAG 生成气溶胶的可重复性，采用一种基础液体溶液进行了 10 次独立的气溶胶生成实验，该溶液包含丙二醇（PG）、植物甘油（VG）、尼古丁、水和乙醇（质量分数分别为 71.72%、17.93%、2%、5.85% 和 2.5%）。气溶胶生成与采样的参数汇总于表 2。对 CAG 生成的气溶胶进行化学表征，结果证实该系统所获得数据具有高度可重复性。在相同的加热、冷却和稀释气流以及相同的采样条件下，气溶胶生成过程中乙酰基烟碱类物质（ACM）、尼古丁、VG 和 PG 的浓度保持稳定，其相对标准偏差分别为 ACM 2.48%、尼古丁 3.28%、VG 3.43% 和 PG 3.34%（图 7）。

在连续三次CAG气溶胶生成实验中，测定了八种羰基化合物——即乙醛、丙酮、丙烯醛、丁醛、巴豆醛、甲醛、甲乙酮和丙醛——的浓度。正如在恒定受控条件下生成的气溶胶所预期的那样，所有羰基分析物的产率均保持在较低水平（表3），大多数化合物未达到分析方法的定量限（LOQ）。仅有乙醛和甲醛的产率高于LOQ。稀释气溶胶样品中甲醛浓度表现出较大变异性（±32%），这是由于该分析物具有高挥发性，且其产率接近LOQ。数据证实了CAG生成的气溶胶中不存在液相热降解产物。添加香精混合物会影响气溶胶中羰基化合物的组成。在本例中，乙醛和丁醛的产率显著升高，分别从接近LOQ的水平上升至进入暴露室的稀释气溶胶中的2.06和1.56 µg/L。这些数据凸显了香精混合物组成对气溶胶成分的影响，并强调在电子烟液配方最终评估之前，应尽早研究某些香精成分潜在毒性的必要性 体内 长期暴露研究

由CAG生成的气溶胶的粒径分布
在不同的冷却和一级稀释气流条件下，测量了由CAG生成的气溶胶的粒径分布，以评估这些条件对仅含丙二醇（PG）、植物甘油（VG）、水和尼古丁的基础液所产生的气溶胶物理特性的影响。该步骤对于确定生成可吸入粒径范围内气溶胶的合适条件至关重要。

在本研究中，冷却气流和第一级稀释气流以10 L/min为步进进行调整，以保持气溶胶总流量恒定（表4）。液体流速（0.5 mL/min）、加热气流（2 L/min）和第二级稀释气流（150 L/min）保持不变。气溶胶样品取自稀释后的采样点b（图5）。粒径分布（PSD）采用空气动力学粒径谱仪测定，该仪器可测量0.5至20 µm范围内的颗粒尺寸，采样流速为5 L/min，并根据需要进行适当稀释以适配设备使用。每次气溶胶生成运行的质均粒径（MMAD）和几何标准偏差（GSD）均由空气动力学粒径谱仪报告。

冷却气流的增加以及初次稀释气流的同时减少对气溶胶粒径产生了影响（表4）。当冷却气流从10 L/min增至20 L/min，同时初次稀释气流从160 L/min降至150 L/min时，对粒径的影响最为显著。在此条件下，质量中值空气动力学直径（MMAD）从1.47 µm增至4.03 µm，增长超过一倍。随着冷却气流速率的进一步提高，气溶胶平均粒径持续增大，但增长幅度低于10至20 L/min区间内的变化比例。与10 L/min冷却气流下生成的气溶胶相比，在20–50 L/min冷却气流下生成的气溶胶其空气动力学直径分布明显向更大直径方向偏移（图8）。

电子烟液风味物质的捕集效率
如前所述，由于挥发性的影响，各种液体组分在局部热力学条件下会持续发生气-液传质过程。此外，分析方法本身对这些组分也具有一定的捕集能力。实际产率的测量使我们能够评估化学方法在准确检测和定量特定组分方面的有效性（例如，由于冷凝倾向或化学反应，某些组分可能无法到达其目标位置，如在吸入研究中无法进入暴露室）。因此，在评估不同风味配方的电子烟液时，必须能够确定用于气溶胶化学分析的最高效捕集方法。这进一步使我们能够测量各组分的转移速率，该速率通常受到气溶胶从生成位置传输至暴露室过程中损失的影响。在本案例中，额外开展了一项研究，使用含有多种香精物质混合物的液体。气溶胶采用 表2 所列的CAG参数生成，并在稀释后（位置b，图5）进行捕集，采样流速设定为0.7 L/min，持续30分钟。捕集过程在预先用2 mL异丙醇处理的采样柱上进行。捕集结束后，立即用异丙醇洗脱滤芯，直至收集到20 mL洗脱液。我们发现，应针对每种风味组分分别研究并确定其捕集效率。

对于70%的被检测风味成分，我们的回收率>60%，且与风味物质的沸点（挥发性）具有良好的相关性。这一事实表明，在进行含有复杂混合物的吸入毒理学研究时，应特别关注气溶胶向暴露部位的转移和递送过程。

图1：毛细管气溶胶发生器（CAG）的工作原理。 液体被泵入一根电加热的毛细管中，产生一股股高温过饱和蒸气，这些蒸气被气流冷却，导致瞬间成核和冷凝，从而形成气溶胶。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：典型的CAG实验装置及关键组件。（A）CAG组装的总体视图，显示了将液体储备溶液连接至CAG的蠕动泵、稀释空气管道以及气溶胶形成过程。（B）CAG的详细结构，包含毛细管和加热元件。（C）CAG组件气溶胶生成装置的横截面视图，展示冷却和稀释气流的细节。玻璃管具有两个独立的腔室：冷却气流被推向CAG，并与液体产生的蒸汽接触以形成气溶胶；稀释气流则被导向已形成的气溶胶，以对其进行稀释。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CAG装置细节：横截面视图。加热气流被引入加热元件周围，用于冷却CAG装置的外部本体，防止毛细管尖端处液体回流发生冷凝，并稳定蒸气射流的喷发。请点击此处查看此图的放大版本。

图4CAG组装 毛细管和加热元件（A）插入内层PEEK管中，然后将该组件套入外层不锈钢管中（B）。组装完成后，使用不锈钢对准螺钉将组件封盖并牢固固定在支架上（C,D）。从后端伸出的毛细管相连 通过 将管路连接至蠕动泵和液体配方。缩写：SS，不锈钢。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：CAG 气溶胶生成设置 体内 暴露实验。 用于分析的气溶胶采样在两个位置进行：（a) 未稀释的气溶胶——采样期间关闭第一次稀释步骤；(b稀释后的气溶胶，在进入暴露室之前。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图6：连接接头的样品柱。 采样前，样品柱需用 0.5 M 硫酸预处理以进行尼古丁分析，或用异丙醇预处理以进行风味分析。入口接头连接至 CAG 产生的气溶胶气流，出口接头连接至真空泵。请点击此处查看此图的放大版本。

图7：CAG生成的气溶胶表征与可重复性。 使用相同液体基础溶液进行10次独立实验性气溶胶生成运行后，ACM、尼古丁、PG和VG的浓度。ACM：1105.45 ± 27.4 µg/L；尼古丁：20.16 ± 0.7 µg/L；VG：227.15 ± 7.8 µg/L；PG：656.59 ± 22.0 µg/L。误差棒表示标准偏差。缩写：ACM，气溶胶收集质量；PG，丙二醇；VG，甘油。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：不同冷却气流速率下生成气溶胶的颗粒大小分布变化。 请点击此处查看此图的放大版本。

	基础液 (PG/VG/N)	香精 (PG/VG/N/F)
成分	PG/VG/N (g/1000g)	PG/VG/N/F (g/1000g)
苯甲酸	3.33	3.33
PG	240.00	238.91
水	150.00	150.00
乳酸	3.33	3.33
乙酸	3.33	3.33
混合香精	0.00	1.20
甘油	560.01	559.90
尼古丁	40.00	40.00
总和	1000.00	1000.00

表1：电子烟液储备配方成分¹⁸

气溶胶化方案			采样方案
参数	未稀释	稀释	参数	未稀释 位置A	稀释 位置B
CAG温度 (°C)	250
泵流速 (mL/min)	0.5	0.5	采样时间 (min)	10	30
加热空气流速 (L/min)	2	2	采样流量（ACM）(L/min)	0.7	1.5
冷却空气流速 (L/min)	10	10	Extrelut采样流量 (L/min)	0.7	0.7
第一次空气稀释 (L/min)	NA	150	羰基化合物采样流量 (L/min)	0.7	0.7
第二次空气稀释 (L/min)	NA	160
废气流量 (L/min)	NA	172

表2：气溶胶生成、稀释与采样的参数

羰基化合物	基础液（丙二醇/植物甘油/尼古丁）		高浓度含尼古丁香精储备液 （丙二醇/植物甘油/尼古丁/香精）
	未稀释气溶胶样品 µg/L	稀释后气溶胶样品 µg/L	未稀释气溶胶样品 µg/L	稀释后气溶胶样品 µg/L
乙醛	0.834 ± 0.096	0.119*	45.346 ± 1.134	2.058 ± 0.202
丙酮	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
丙烯醛	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
丁醛	< LOQ	< LOQ	36.475 ± 0.996	1.557 ± 0.179
巴豆醛	< LOQ	< LOQ	0.052 ± 0.001	< LOQ
甲醛	0.731 ± 0.072	0.072 ± 0.023	0.158 ± 0.007	0.026 ± 0.004
甲基乙基酮	< LOQ	< LOQ	0.570 ± 0.015	< LOQ
丙醛	< LOQ	< LOQ	0.085 ± 0.001	< LOQ

表3：CAG生成气溶胶中羰基化合物的测定。 使用相同液体基础溶液单独及添加香精混合物进行三次气溶胶生成实验所得的平均值。在三次运行中，仅有一个样品的数值高于该方法的定量下限（LOQ）。

设置（L/min）		气溶胶液滴直径
冷却气流	第一次稀释气流	质量中值空气动力学直径（µm）	几何标准偏差
10	160	1.47 ± 0.04	2.07  ± 0.01
20	150	4.03  ± 0.18	2.13  ± 0.04
30	140	4.74  ± 0.04	1.89  ± 0.02
40	130	5.35  ± 0.04	1.80  ± 0.01
50	120	5.23  ± 0.03	1.76  ± 0.01

表4：不同气流条件下气溶胶颗粒尺寸（液滴直径）的测定。缩写：MMAD，质量中值空气动力学直径；GSD，几何标准差。

讨论

使用CAG生成气溶胶有助于减少电子烟设备特异性气溶胶化过程的变异性，从而实现对气溶胶化电子烟液配方本身的客观且可控的评估。研究表明，CAG生成的气溶胶能够代表电子烟（ECs）所产生的气溶胶⁷。这些气溶胶可重复地以相同的组成和特性进行生成，因此特别适用于需要在较长时间内产生大量气溶胶的体内长期暴露研究⁸。

CAG 装置的组装相对简单，且易于维护。然而，操作参数（如液体流速和相应的空气流速）对于生成可控气溶胶至关重要，需根据 CAG 产生的气溶胶的应用目的进行方法优化。

本研究呈现的结果表明，冷却气流速率对气溶胶粒子的粒径分布具有明显影响。由于冷却了气溶胶生成后流经的内部管路，冷却气流不仅直接影响所生成蒸气的成核过程，也影响冷凝过程。此外，高浓度气溶胶容易发生显著的凝聚效应。上述过程共同作用，其相互关系及对气溶胶形成的影响因特定电子烟液成分、温度和气流条件而异，难以一概而论。辅助气流的组成（干燥或以固定相对湿度加湿）——尤其是其中的水含量——将影响热量与质量交换，不仅会调节气溶胶粒子的冷凝增长，还会导致管壁冷凝。因此，为实现对粒径分布（PSD）的控制，有必要根据具体用途调整本方法的参数^17,19。

低溶解度或高沸点的化学物质的存在可能会因在毛细管内发生沉淀以及随时间推移导致毛细管堵塞，从而限制CAG生成气溶胶的效果。根据气溶胶中所含化学物质的不同，必须调节CAG的操作温度以生成蒸气。此外，应定期评估液体配方的稳定性。添加具有不同沸点的组分（包括香料）将影响最终气溶胶的组成¹⁴以及气-液分配。可能需要调整毛细管温度和加热气流，以防止回流以及在高温毛细管附近发生液体沉积，否则由于液体在高温下长时间滞留，可能导致生成不受控的热降解产物（如羰基化合物）。此外，控制毛细管内用于生成蒸气的温度会影响蒸气在毛细管内的起始形成位置——温度越高，蒸气形成越早。当毛细管温度较高时，从毛细管流出的蒸气需要更长时间才能被冷却气流冷却，因此会在距离毛细管尖端更远的位置开始成核并冷凝为气溶胶，有助于避免回流效应¹⁹。

当前电子烟液 在体 由于在操作上难以达到所需气溶胶规模，例如在OECD TG 413研究中，毒理学研究在重现电子烟气溶胶方面存在局限性²⁰本研究中介绍的方案概述了菲利普莫里斯国际公司用于气溶胶生成的CAG组装方式及设置参数 体内 长期暴露研究¹⁸这些数据可为在其他实验室环境（如药物递送系统）中的进一步优化提供良好的起点²¹或根据特定研究的具体需求进行调整。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铝制前盖	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	专用，1 件
铝制加热块，槽直径 0.4 mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, 美国	B-505432	2 件
铝制后盖	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	1 件
剑桥玻璃滤膜垫片	GE Healthcare UK Limited	9703-9654	直径 44 mm
毛细管 21 G SS，160 mm	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, 美国	304H21RW	1 件
干式擦拭布	Contec Inc. , SC, 美国	含异丙醇的 Prosat 擦拭布	清洁材料
流量计	TSI, Shoreview, MI, 美国	4100 系列，0–20 L/min	或同等产品
Gilibrator-2 校准仪	Sensidyne, St-Petersburg FL, 美国	Gilian Gilibrator-2	空气流量校准仪
玻璃接头	Labo Service, Kontich, 比利时	QVF
玻璃管路	Labo Service, Kontich, 比利时	QVF	管径 25 和 40 mm
加热元件	Phil Gunn Machine Co., Inc, VA, 美国	LDC01864	4 件
耐高温润滑脂	Lubriplate Lubricant Company, NJ, 美国	高温多用途润滑脂	CAG 维护用
内层 PEEK 管	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	1 件
磁力搅拌器	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, 德国	C-MAG HS 4	或同等产品
微型冲击式采样管	Labo Service, Kontich, 比利时	定制加工
外层 SS 管	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	1 件
PEEK 接头	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	专用，1 件
蠕动泵	Watson-Marlow Fluid Technology Group, Falmouth, 英国	Watson-Marlow 530 U	或同等产品
插接式接头	Festo Pte Ltd	NPQM-DK-M5-Q4-P10	1 件
样品柱 Extrelut NT3 滤芯	Merk Sigma-Aldrich	115095
SS 25 mm 装配盖	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	专用，1 件
SS M8 丝杠	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	3 件
SS M8 螺母	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	3 件
SS 后部支撑板	Mecanique Buri S.A., La Chaux-de Fonds, 瑞士	定制加工	专用，1 件
温度控制器	Cole Parmer GmbH, Wertheim, 德国	Digi-Sense TC 9600	或同等产品
K 型热电偶	RS Components GmbH, Wädenswil, 瑞士	814-0147	1 件