本方案描述了一种有效的原位杂交方法，用于检测目标基因在组织中的mRNA表达水平及其空间分布模式 Sipunculus nudus 体腔液
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摘要
摘要
原位杂交（ISH）是一种非常有用的技术，可用于展示特定基因（如 mRNA 和 ncRNA）在组织中的细胞分布模式。Sipunculus nudus 作为一种螠虫动物，具有较高的营养价值和药用价值，是重要的渔业资源。目前，关于 Sipunculus nudus 分子生物学的研究仍处于起步阶段。本文旨在建立一种灵敏的方法，用于定位 Sipunculus nudus 体腔液中的特定 mRNA。该实验方案包括 ISH 的详细步骤：地高辛标记的反义和正义 RNA 探针的制备、体腔液的采集与切片制备、特异性 RNA 探针的杂交、抗体孵育、显色及显色后处理。文中展示了采用该方法成功实验所获得的代表性结果。本方案也应适用于其他螠虫动物（Sipuncula）物种。
引言
原位杂交（ISH）是一种利用标记的核酸探针检测特定DNA或RNA序列的方法，可用于描述目标基因在形态学结构得以保存的组织中的空间表达模式1,2,3。通常，目标序列通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得，并作为模板用于合成带有地高辛标记的尿苷-5’-三磷酸（digoxigenin uridine-5’-triphosphate）的反义/有义RNA探针。样品经固定和通透处理后，与核糖探针孵育。洗去未结合的探针后，通过免疫组织化学方法使用碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体对杂交信号进行显色检测3,4,5,6。
Sipunculus nudus（星虫动物门；星虫目，星虫科）是一种无体节、具有真体腔且身体呈两侧对称的海洋蠕虫7,8。Sipunculus nudus为世界性分布物种，广泛存在于热带和温带沿海....
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方案
动物实验程序已获得华侨大学动物护理与福利委员会的批准。
1. 核糖探针制备
- 引物设计
- 打开 Primer 3 程序（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），将 dmrt1 序列（GenBank: MK182259）复制到序列窗口中。
- 设置引物长度（23–25 bp）、熔解温度（55–60 °C）和 G/C 含量（40–60%），然后点击 选择引物。
注：RNA 探针所需的最小长度约为 500 bp。通常较长的探针具有更高的特异性。 - 在选定的其中一个引物上添加 T7 RNA 聚合酶启动子序列（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）。用于原位杂交（ISH）的 dmrt1 引物序列见表 1。
注：对于正义探针，T7 RNA 聚合酶启动子位于正向引物的 5′ 端；对于反义探针，T7 RNA 聚合酶启动子位于反向引物的 5′ 端。
- PCR 扩增
- 将微量离心管置于冰上，配制以下反应体系（50 µL 反应体积）：1x Taq DNA 聚合酶混合液、1 µg cDNA（由 10....
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结果
原位杂交（ISH）所涉及步骤的概要如图所示 图1. 反义与相应的正义核糖探针用于 dmrt1 从体腔液cDNA扩增的PCR产物中合成。PCR产物的真实性通过直接测序验证。根据制造商说明书及先前报道，使用T7 RNA聚合酶合成核糖探针。4 进行了一些小的修改。ISH 的代表性信号如图所示 图2. 原位杂交（ISH）的 Sipunculus nudus 靶向反义核糖探针的体腔液 dmrt1 显示精子囊胚滋养层细胞中呈浓集的紫色染色（图2A，B，红色箭头）。以正义链核糖探针作为阴性对照，正义链核糖探针用于 dmrt1 未检测到任何杂交信号（图2C).
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讨论
先前的研究表明，原位杂交（ISH）适用于检测多种靶RNA16,17,18。在本实验方案中，我们描述了一种高分辨率的ISH方法，用于检测体腔液中的mRNA，并重点强调了在无疣多疣螠（Sipunculus nudus）中优化的杂交条件。dmrt1 基因所显示出的明显信号表明，该实验方案在基因表达检测中的成功应用（图2）。
实验过程中需特别注意一系列步骤。首先，必须合成靶基因的反义核糖探针作为对照。合成后，应通过凝胶电泳检测核糖探针的质量。若RNA合成效果不佳，将导致组织切片中无染色信号。其次，样品采集过程应轻柔操作，以避免细胞变形，且腔液采集后必须立即进行实验，以防RNA降解。第三，各步骤的孵育时间必须严格遵守，不得缩短或延长。尤其需注意蛋白酶K处理的时间：处理时间过长会破坏样品的细胞结构，而处理时间过短则.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金青年科学基金项目（项目编号：31801034）、中国福建省自然科学基金（项目编号：2016J01161）、华侨大学科研基金（项目编号：15BS306）以及华侨大学研究生科研创新基金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Biowest | 111860 | |
| 抗地高辛-碱性磷酸酶Fab片段 | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | C3206 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | B2064 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5415R | |
| 柠檬酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 5949-29-1 | |
| 柠檬酸三钠 | 国药集团化学试剂有限公司 | 4/3/6132 | |
| 盖玻片 | Beyotime | FCGF60 | |
| 去离子甲酰胺 | Amresco | 12/7/1975 | |
| 焦碳酸二乙酯（DEPC） | Sigma | D5758 | 有害物质 |
| 地高辛（DIG）RNA标记混合物 | Roche | 11277073910 | |
| 无RNase的DNase I | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| 电泳凝胶成像系统 | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 64-17-5 | |
| 凝胶回收试剂盒 | Omega | D2500 | |
| 电泳装置 | 北京六一仪器厂 | DYY-6C | |
| 甘油 | 国药集团化学试剂有限公司 | 56-81-5 | |
| 甘氨酸 | Sigma | G5417 | |
| 肝素 | Sigma | 8/1/9041 | |
| KCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| 马来酸 | 国药集团化学试剂有限公司 | 110-16-7 | |
| 甲醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 67-56-1 | 有害物质 |
| MgCl2 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | 国药集团化学试剂有限公司 | 1310-73-2 | 腐蚀性 |
| 石蜡膜 | Bemis公司 | PM-996 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | 158127 | 有害物质 |
| PCR仪 | Life Technology | Proflex | |
| 图钉 | 得力 | 16 | |
| 移液器 | Eppendorf | plus G | |
| 多聚赖氨酸处理的载玻片 | 柳生 | VER_A01 | |
| 蛋白酶K | Sigma | SRE0005 | |
| 无RNase水 | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase抑制剂 | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| 羊血清 | Beyotime | C0265 | |
| 切片染色缸 | Beyotime | FG010 | |
| 切片储存盒 | Beyotime | FBX011 | |
| 小型灭菌剪刀 | 双鹿 | sku_8330 | |
| 分光光度计 | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA聚合酶 | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA聚合酶混合液（2X） | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | 10109517001 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 水浴锅 | 郑州长城科工贸有限公司 | HH-S2 |
参考文献
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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重印与许可
