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方法文章

Sipunculus nudus 体腔液原位杂交

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DOI：

10.3791/61022

⸱

2020年5月1日

 ,  , 
1Key Laboratory of Xiamen Marine and Gene Drugs, School of Biomedical Sciences, Huaqiao University

本文内容

摘要

本方案描述了一种有效的原位杂交方法，用于检测目标基因在组织中的mRNA表达水平及其空间分布模式 Sipunculus nudus 体腔液

摘要

原位杂交（ISH）是一种非常有用的技术，可用于展示特定基因（如 mRNA 和 ncRNA）在组织中的细胞分布模式。Sipunculus nudus 作为一种螠虫动物，具有较高的营养价值和药用价值，是重要的渔业资源。目前，关于 Sipunculus nudus 分子生物学的研究仍处于起步阶段。本文旨在建立一种灵敏的方法，用于定位 Sipunculus nudus 体腔液中的特定 mRNA。该实验方案包括 ISH 的详细步骤：地高辛标记的反义和正义 RNA 探针的制备、体腔液的采集与切片制备、特异性 RNA 探针的杂交、抗体孵育、显色及显色后处理。文中展示了采用该方法成功实验所获得的代表性结果。本方案也应适用于其他螠虫动物（Sipuncula）物种。

引言

原位杂交（ISH）是一种利用标记的核酸探针检测特定DNA或RNA序列的方法，可用于描述目标基因在形态学结构得以保存的组织中的空间表达模式1,2,3。通常，目标序列通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得，并作为模板用于合成带有地高辛标记的尿苷-5’-三磷酸（digoxigenin uridine-5’-triphosphate）的反义/有义RNA探针。样品经固定和通透处理后，与核糖探针孵育。洗去未结合的探针后，通过免疫组织化学方法使用碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体对杂交信号进行显色检测3,4,5,6。

Sipunculus nudus（星虫动物门；星虫目，星虫科）是一种无体节、具有真体腔且身体呈两侧对称的海洋蠕虫7,8。Sipunculus nudus为世界性分布物种，广泛存在于热带和温带沿海水域。由于其具有较高的营养价值和药用价值，该物种也是中国南方重要的海洋渔业资源9,10。然而，Sipunculus nudus在分子生物学领域的研究仍处于起步阶段。为了全面理解基因的生物学功能，以细胞分辨率研究基因表达模式具有重要意义。在非模式生物Sipunculus nudus中，原位杂交（ISH）技术是检测基因表达模式的理想方法，但该方法尚未建立。其体腔液中含有多种细胞类型，包括颗粒细胞、瓮状细胞、泡状细胞、生殖细胞、红细胞等11。本方法以双性/mab-3相关转录因子-1（dmrt1）作为代表性基因，该基因是在从无脊椎动物到哺乳动物的大多数物种中高度保守的性别决定与分化相关的转录调控因子12,13。在多种物种（如黑鲷等）14中，dmrt1在支持细胞（Sertoli细胞）中表达，这些细胞围绕生殖细胞分布，其功能类似于Sipunculus nudus中的滋养细胞。因此，我们假设Sipunculus nudus的dmrt1基因在精荚的滋养细胞中表达，ISH实验结果明确证实了这一假设。

本方案首次描述了使用地高辛标记的反义/有义 mRNA 探针进行原位杂交（ISH），以确定其体腔液涂片中的 mRNA 表达模式。文中提供了最佳反应条件，可实现高分辨率下 mRNA 表达的高灵敏度可视化。所建立的 ISH 方法有望应用于除无疣星虫（Sipunculus nudus）以外的更多星虫科物种。

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方案

动物实验程序已获得华侨大学动物护理与福利委员会的批准。

1. 核糖探针制备

  1. 引物设计
    1. 打开 Primer 3 程序（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），将 dmrt1 序列（GenBank: MK182259）复制到序列窗口中。
    2. 设置引物长度（23–25 bp）、熔解温度（55–60 °C）和 G/C 含量（40–60%），然后点击 选择引物。
      注：RNA 探针所需的最小长度约为 500 bp。通常较长的探针具有更高的特异性。
    3. 在选定的其中一个引物上添加 T7 RNA 聚合酶启动子序列（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）。用于原位杂交（ISH）的 dmrt1 引物序列见表 1。
      注：对于正义探针，T7 RNA 聚合酶启动子位于正向引物的 5′ 端；对于反义探针，T7 RNA 聚合酶启动子位于反向引物的 5′ 端。
  2. PCR 扩增
    1. 将微量离心管置于冰上，配制以下反应体系（50 µL 反应体积）：1x  Taq DNA 聚合酶混合液、1 µg cDNA（由 100 µL 体腔液制备而来）、1 µM 正向引物、1 µM 反向引物以及无核酸酶水。
    2. 用移液器吹打混匀 PCR 反应液，短暂离心。
    3. 将反应管放入热循环仪中，按以下条件运行 PCR：95 °C 预变性 2 分钟，随后进行 36 个循环（95 °C 变性 30 秒，55–60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），最后 72 °C 终末延伸 7 分钟。
      注：退火温度应根据所用引物进行优化。
  3. PCR 产物纯化与验证
    1. 直接取 50 µL PCR 产物上样至 1% 琼脂糖凝胶，在 0.5x TBE 缓冲液中以 150–180 V 电压电泳 10 分钟，从 1% 琼脂糖凝胶中分离出特异性 DNA 条带。
      注：DNA 应呈现为单一清晰条带，不应出现拖尾现象。
    2. 按照试剂盒说明书使用凝胶回收试剂盒纯化 DNA 片段，并在 260 nm 波长下通过分光光度法测定纯化产物的浓度。
    3. 通过测序验证 PCR 产物的真实性。
      注：（暂停点）纯化的 PCR 产物可在 -20 °C 下保存数月。
  4. 核糖探针合成
    1. 将无 RNase 的微量离心管置于冰上，在离心管中加入以下组分（10 µL 反应体系）：1x 地高辛 RNA 标记混合液、1x 转录缓冲液、0.5 µL RNase 抑制剂、1 µL T7 RNA 聚合酶、1 µg PCR 产物以及无 RNase 水。用移液器吹打混匀，短暂离心后于 37 °C 孵育 2 小时。
    2. 加入 2 µL 无 RNase 的 DNase I，吹打混匀，短暂离心后于 37 °C 孵育 15 分钟。
    3. 加入 2 µL 0.2 M EDTA（pH 8.0），吹打混匀，短暂离心。
    4. 向上述反应体系中加入 2.5 µL 4 M LiCl 和 75 µL 预冷乙醇，充分混匀，于 -70 °C 放置 30 分钟。
    5. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，弃去乙醇，加入 1 mL 预冷的 70% 乙醇（v/v），轻轻混匀洗涤沉淀。
    6. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 5 分钟，弃去 70% 乙醇，在酒精灯附近短暂干燥沉淀，然后加入 30 µL 无 RNase 水溶解沉淀并轻轻混匀。
    7. 取 2 µL 合成的 RNA 上样至 1% 琼脂糖凝胶，在 0.5x TBE 缓冲液中以 180 V 电压电泳 5–10 分钟，使用分光光度计在 260 nm 波长下测定标记 RNA 的浓度。
      1. 使用无 RNase 的微量离心管和滤芯吸头，避免 RNase 污染。
        注：（暂停点）地高辛标记的探针可在 -70 °C 下保存数月。

2. 体腔液采集

  1. 用大头针将S. nudus固定在解剖台上。使用小型灭菌剪刀剪开S. nudus体壁。用移液器分离体腔液。
  2. 用移液器收集1 mL体腔液并转移至经多聚-D-赖氨酸处理的显微镜载玻片上。用移液器吸头将体腔液均匀涂布。在37 °C条件下将载玻片空气干燥1小时。

3. 原位杂交

  1. 第1天
    1. 将载玻片浸入含有100 mL 1×焦碳酸二乙酯处理的磷酸盐缓冲液（DEPC-PBS）的玻片染色缸中进行复水。用1× DEPC-PBS重复复水3次，每次5分钟，轻轻振荡。
    2. 用10 µg/mL蛋白酶K在室温下消化体腔液涂片5分钟以进行通透处理。将载玻片在4%多聚甲醛（PFA）中孵育20分钟以终止消化反应。用1× DEPC-PBS轻轻振荡洗涤3次，每次5分钟。
    3. 在载玻片上加入50 µL杂交混合液（HM），其中包含正义/反义核糖探针，并加盖盖玻片。
    4. 向湿盒中加入湿盒缓冲液。将载玻片放入湿盒中，用石蜡膜密封。在60 °C下杂交过夜（至少16小时）。
  2. 第2天
    1. 将洗涤缓冲液预热至65 °C。将载玻片浸入装有洗涤缓冲液的玻片染色缸中，静置直至盖玻片自动脱落，约需5分钟。
    2. 在65 °C下用洗涤缓冲液洗涤2次，每次30分钟，轻轻振荡。在65 °C下用0.2×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液洗涤2次，每次30分钟，轻轻振荡。在室温下用含Tween 20的马来酸缓冲液（MABT）洗涤2次，每次30分钟，轻轻振荡。
    3. 将载玻片在封闭缓冲液中室温孵育3–4小时。再将载玻片在1 mL抗地高辛-碱性磷酸酶（AP）Fab片段溶液（用封闭缓冲液按1/5000稀释）中4 °C孵育过夜。
  3. 第3天
    1. 移除抗体溶液，用MABT短暂漂洗载玻片。在室温下用MABT洗涤4次，每次25分钟，轻轻振荡。
    2. 在室温下用碱性磷酸酶缓冲液孵育3次，每次5分钟。移除碱性磷酸酶缓冲液，加入1 mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）/硝基蓝四氮唑（NBT）显色液。将载玻片避光保存。
    3. 定期在光学显微镜下观察显色反应。当颜色完全显出（反应时间通常为1–4小时）后，在室温下用MABT洗涤2次，每次5分钟，轻轻振荡。
    4. 在室温下用终止液洗涤2次，每次15分钟，轻轻振荡。将载玻片在甲醇中孵育以去除多余染料，室温下30分钟。根据背景染色情况，甲醇洗涤可进行2或3次，脱色时间也可适当延长。
    5. 在室温下用MABT洗涤2次，每次5分钟，轻轻振荡。将载玻片转移至一张新的滤纸上。加入50 µL甘油，加盖盖玻片后进行显微观察。
      注：溶液组成见表2。

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结果

原位杂交（ISH）所涉及步骤的概要如图所示 图1. 反义与相应的正义核糖探针用于 dmrt1 从体腔液cDNA扩增的PCR产物中合成。PCR产物的真实性通过直接测序验证。根据制造商说明书及先前报道，使用T7 RNA聚合酶合成核糖探针。4 进行了一些小的修改。ISH 的代表性信号如图所示 图2. 原位杂交（ISH）的 Sipunculus nudus 靶向反义核糖探针的体腔液 dmrt1 显示精子囊胚滋养层细胞中呈浓集的紫色染色（图2A，B，红色箭头）。以正义链核糖探针作为阴性对照，正义链核糖探针用于 dmrt1 未检测到任何杂交信号（图2C).

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讨论

先前的研究表明，原位杂交（ISH）适用于检测多种靶RNA16,17,18。在本实验方案中，我们描述了一种高分辨率的ISH方法，用于检测体腔液中的mRNA，并重点强调了在无疣多疣螠（Sipunculus nudus）中优化的杂交条件。dmrt1 基因所显示出的明显信号表明，该实验方案在基因表达检测中的成功应用（图2）。

实验过程中需特别注意一系列步骤。首先，必须合成靶基因的反义核糖探针作为对照。合成后，应通过凝胶电泳检测核糖探针的质量。若RNA合成效果不佳，将导致组织切片中无染色信号。其次，样品采集过程应轻柔操作，以避免细胞变形，且腔液采集后必须立即进行实验，以防RNA降解。第三，各步骤的孵育时间必须严格遵守，不得缩短或延长。尤其需注意蛋白酶K处理的时间：处理时间过长会破坏样品的细胞结构，而处理时间过短则...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到国家自然科学基金青年科学基金项目（项目编号：31801034）、中国福建省自然科学基金（项目编号：2016J01161）、华侨大学科研基金（项目编号：15BS306）以及华侨大学研究生科研创新基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Biowest111860
抗地高辛-碱性磷酸酶Fab片段Roche11093274910
BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒BeyotimeC3206
牛血清白蛋白SigmaB2064
离心机Eppendorf5415R
柠檬酸国药集团化学试剂有限公司5949-29-1
柠檬酸三钠国药集团化学试剂有限公司4/3/6132
盖玻片BeyotimeFCGF60
去离子甲酰胺Amresco12/7/1975
焦碳酸二乙酯（DEPC）SigmaD5758有害物质
地高辛（DIG）RNA标记混合物Roche11277073910
无RNase的DNase IInvitrogen18047019
EDTASigma431788
电泳凝胶成像系统Bio-RadUniversal Hood III
乙醇国药集团化学试剂有限公司64-17-5
凝胶回收试剂盒OmegaD2500
电泳装置北京六一仪器厂DYY-6C
甘油国药集团化学试剂有限公司56-81-5
甘氨酸SigmaG5417
肝素Sigma8/1/9041
KCl国药集团化学试剂有限公司7447-40-7
KH2PO4国药集团化学试剂有限公司7778-77-0
LiClSigma203637
马来酸国药集团化学试剂有限公司110-16-7
甲醇国药集团化学试剂有限公司67-56-1有害物质
MgCl2国药集团化学试剂有限公司7786-30-3
Na2HPO4国药集团化学试剂有限公司7558-79-4
NaClBiofountJT0001
NaOH国药集团化学试剂有限公司1310-73-2腐蚀性
石蜡膜Bemis公司PM-996
多聚甲醛（PFA）Sigma158127有害物质
PCR仪Life TechnologyProflex
图钉得力16
移液器Eppendorfplus G
多聚赖氨酸处理的载玻片柳生VER_A01
蛋白酶KSigmaSRE0005
无RNase水HyCloneSH30538. 02
RNase抑制剂Roche3335399001
S. nudus
羊血清BeyotimeC0265
切片染色缸BeyotimeFG010
切片储存盒BeyotimeFBX011
小型灭菌剪刀双鹿sku_8330
分光光度计Thermo FisherNanoDrop 2000/2000c
T7 RNA聚合酶Roche10881767001
Taq DNA聚合酶混合液（2X）Thermo ScientificK1081
Tris HClSigmaRES3098T
tRNARoche10109517001
Tween-20SigmaP1379
水浴锅郑州长城科工贸有限公司HH-S2

参考文献

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