卡诺哈布迪蒂斯精英热休克反应的测量诱导标准化方法

热休克反应 （HSR） 是由温度升高和其他蛋白质毒性应力引起的细胞细胞因子错折叠引起的一种通用细胞应激反应。在卡诺哈布迪蒂斯埃利根斯启动HSR导致热休克基因的转录上调节，如hsp-70和hsp-16.2。许多热休克蛋白 （HSP） 充当分子伴管，通过与错误折叠或受损的蛋白质直接相互作用来恢复蛋白质折叠平衡或蛋白酶。HSR 的主稳压器是转录因子热冲击因子 1 （HSF-1），其激活通过多个机制^{1 优雅地控制}。

HSF-1 的作用不限于压力。HSF-1是正常生长发育所需的，因为删除hsf-1会导致幼虫逮捕²。HSF-1在衰老和与年龄相关的神经退行性疾病中也很重要，其特征是蛋白质聚集和无法维持蛋白酶。hsf-1 的敲击会导致蛋白质聚合物的积累和寿命的缩短，而hsf-1 的过度表达会减少蛋白质聚合并延长^{寿命 3，,4}。因此，在分子水平上调节HSF-1对机体生理和疾病有着广泛的影响。

C. elegans是 HSR 研究的强大模型生物体，因为 HSR 可以在分子、细胞和有机体级别^{4、5、6,5,进行测量}。强调该模型的力量，在描述HSR路径的关键进展，如组织特定的差异，在HSR调控，已发现在C.elegans^7，8,8。此外，C. elegans被广泛用于衰老研究，是一种新兴的系统，用于建模与蛋白细胞减少的疾病相关的疾病。

虽然使用C. elegans 的热休克实验可以快速且可重复，但在开始之前需要考虑几个问题。例如，应使用哪种温度来感应 HSR，以及蠕虫应暴露多长时间？用干培养箱还是水浴更好？应该使用哪个发展阶段？不幸的是，用于研究 HSR 的方法因实验室而异，在选择最佳方法时造成混乱，并难以在实地比较结果。

我们提出了使用RT-qPCR、荧光报告器和测量HSR的稳健和标准化协议。虽然这三种方法是相辅相成的，但它们各有优缺点。例如，RT-qPCR 是 HSR 最直接、最定量的测量方法，这种测定方法可以很容易地扩展，包括许多不同的热冲击基因。然而，RT-qPCR是最昂贵的，可能在技术上是困难的，并要求使用专门的设备。相比之下，荧光测量器具有测量HSR诱导中组织特异性差异的优点。然而，它们难以精确量化，只能测量感应超过一定阈值，并且需要使用荧光显微镜。此外，与标准N2菌株相比，此处描述的记者菌株在发育上延迟。虽然含有单拷贝转基因的较新的报告器菌株可用，但9日尚未在这里^进行测试。第三种检测方法，即，具有在有机体水平上提供生理相关读出的优势。然而，这种分析可以说是最不敏感和最间接的。最后，我们讨论了这些分析中发现的一些常见变异，并提出了一套最佳做法，以促进该领域的研究。

1. C. elegans 的维护和同步

1. 保持蠕虫在20°C的线虫生长介质（NGM）板种子与OP50埃舍里切亚大肠杆菌通过转移几个成年人到新鲜板约每周2次^10。应注意防止蠕虫耗尽食物，因为这会影响它们的生理^。
   1. 准备NGM板。
      1. 混合 3 g NaCl， 2.5 g 的巴托 -佩酮， 20 g 的阿加， 和去电化 （DI） H₂O 高达 1 L 在烧瓶中。
      2. 将混合物灭菌。
      3. 让混合物冷却至+50°C。
      4. 加入 25 m L 1 M KH₂PO₄ （pH = 6），1 m CaCl_{2 的}1 mL，1 m MgSO₄的 1 mL，以及 1 mL 的胆固醇（100% 乙醇中的 5 mg/mL）。
      5. 使用无菌技术，将混合物倒入 6 厘米板中，产生大约 100 个板。如果首先将混合物转移到 300 mL 无菌烧杯中，浇注板更容易。
      6. 在用细菌播种或储存在4°C之前，在室温（RT）下留出1天凝固。
   2. 将OP50细菌播种到NGM板上。
      1. 在 30°C 或 37 °C 下在 LB 中生长饱和的隔夜 OP50 细菌培养。
      2. 将大约 300 μL 的培养点放在 6 厘米 NGM 板的中心。
      3. 让板在RT干燥1-3天，根据需要细菌草坪坚持在板。然后，板可以在4°C下使用或储存。
2. 通过分离新鲜产卵（此处描述），或者通过用漂白剂溶解蠕虫后收集卵子，同步生长蠕虫。
   1. 使用铂线采摘将大约 10 只格拉维德成年蠕虫转移到新鲜盘子中。如果成年人在成年的第一天，产卵同步效果最好。
   2. 大约 1 个月后，从板上取下蠕虫。这应该导致40-60鸡蛋每板，这取决于条件和应变。

2. HSR记者的荧光成像

1. 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于 AM446 （hsp-70p:::gfp） 和 CL2070 （hsp-16.2p::gfp） 荧光报告器菌株，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后 64 小时生成。
   注:发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。与 N2 相比，两个 HSR 报告器菌株都表现出轻微的发育延迟。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。
2. 热击蠕虫，用石蜡膜包裹板，在33°C的循环水浴中淹没1小时。薄条石蜡薄膜应包裹2倍围绕板密封的边缘。不要盖住板的底部，否则可能会干扰传热。使用试管机架和铅重倒置板。如有必要，请记住包括阴性控制样品（无热冲击）。
   注:如果石蜡膜不安全，则水将进入板，不应用于数据收集。
3. 通过从水浴中取下盘子并用纸巾干燥来回收蠕虫。取出石蜡膜，在20°C下孵育蠕虫6-24小时。此恢复期允许有充足的时间进行 GFP 合成和折叠，然后再进行成像。
4. 准备用于成像的幻灯片。幻灯片应为每次使用准备新鲜。
   1. 在水和热中用微波炉制作 3% 的气糖溶液，直到水加糖溶解。
   2. 将显微镜幻灯片放在另外两张显微镜幻灯片之间进行成像，这些幻灯片上有一条实验室胶带，为 agarose 垫创建一个垫片。
   3. 使用 1，000 μL 移液器，将加热的 3% 气糖滴到显微镜幻灯片的中心。
   4. 立即用垂直于第一张幻灯片的空白显微镜幻灯片覆盖显微镜幻灯片，使顶部幻灯片位于相邻幻灯片上的实验室胶带上。这会展开阿加罗斯的掉落，以创建一个均匀宽度的垫。
   5. 小心地拆下顶部幻灯片。
5. 使用 200 μL 移液器将 M9 缓冲液中 1 mM levamisole 的小滴（±5 μL）添加到 agarose 垫的中心，使蠕虫固定。然后使用铂线挑将 10 个蠕虫转移到莱瓦米索滴中。盖上盖板。对于直立显微镜，不需要密封盖玻片。可选地，蠕虫在瘫痪时可以对齐，将利加米索摊开，传播到阿加罗斯垫的外端，并使蠕虫与铂丝挑对齐。或者，使用实验室湿巾可以浸泡利瓦米索。
   注:尽快成像，因为长时间在利法米底孵育可能会改变荧光。
6. 使用荧光显微镜对蠕虫进行成像。图像捕获的细节因显微镜和软件而异。
   注:要直接比较图像强度，请在一个成像会话中使用相同的显微镜设置。避免过度饱和图像。

3. 使用RT-qPCR测量HSR基因表达

1. 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。
   注:发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。
2. 如步骤 2.2 所述的热冲击蠕虫。
3. 将盘子从水浴中取出，取出石蜡膜，并立即收集蠕虫。通过用1 mL的M9轻轻清洗板，将液体收集在微离心管中，然后在400 x g的离心后去除M91分钟，可以收集蠕虫。
4. 使用有机萃取物对蠕虫进行精化和纯化RNA。
   1. 加入250μL的RNA分离试剂（参见材料表）。
   2. 旋涡管用手30 s。
   3. 使用微离心管附件在 4 °C 下 20 分钟的涡流管（参见材料表）。
   4. 加入50μL的氯仿。
   5. 30 s 的漩涡。
   6. 在RT中孵育样品3分钟。
   7. 在 +14，000 x g 下离心15 分钟，在 4 °C 下。
   8. 将水层（即顶层，±125 μL）转移到新的微离心管中。
      注:避免在界面中的有机层和材料。
   9. 加入50μL的氯仿。
   10. 30 s 的漩涡。
   11. 在RT中孵育样品3分钟。
   12. 在 +14，000 x g 下离心5 分钟，在 4 °C 下。
   13. 将水层（±100 μL）转移到新的微离心管中。
       注:避免在界面中的有机层和材料。
   14. 以等量（即100μL）的异丙醇沉淀RNA。
   15. 在-20°C下孵育至少30分钟，但最好过夜。
       注:实验可以在这里暂停，RNA可以储存在-20°C。
   16. 在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C下以 ±30 分钟将RNA切自。
   17. 在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一液。
       注:颗粒很小，可能不可见。颗粒可能不会紧贴在管子的一侧，因此必须小心避免将颗粒开走。
   18. 用 250 μL 的 70% 冰冷乙醇用无 RNase H 2 O 制备的_颗粒进行清洗。
   19. 在 +14，000 x g 下离心，在 4 °C 下为 ±5 分钟。
   20. 在不干扰颗粒的情况下，尽可能多地去除上一除。
   21. 在RT上快速旋转，去除剩余的70%乙醇。
   22. 根据需要，让管子在RT处打开，使颗粒干燥;通常至少20分钟，管子可以覆盖一个无绒组织或铝箔，以防止污染。
   23. 将颗粒在 20 μL 无 RNase H₂O 中重新释放。
   24. 使用小体积分光光度计（2 μL）确定RNA浓度。
       注:实验可以在这里暂停，RNA可以暂时储存在-20°C或以下。
5. 使用DNase I孵育去除残留DNA。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。
   1. 使用该试剂盒，在 37°C 水浴中，用 500 ng 的 RNA 和 1 μL 的 DNase I 制备 20 μL 反应，使用 30 分钟。
   2. 将 2.5 μL 的 DNase 灭活试剂（包含在试剂盒中）添加到每个样品中，并在 RT 中孵育 5 分钟，偶尔进行轻拂/涡旋。
   3. 以 14，000 x g 向下旋转 2 分钟。
   4. 在不干扰白色颗粒的情况下，将15μL的上清液转移到用于cDNA合成的新鲜微管中。
6. 进行cDNA合成。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。
   1. 使用该试剂盒，制备 20 μL 反应，使用上一步处理的 15 μL RNA 和 1 μL 的逆转录酶。
   2. 使用以下程序进行cDNA合成:25°C 5分钟，46°C20分钟，95°C为1分钟，4°C保持。
   3. 通过将 80 μL 无 RNase H₂O 直接添加到样品中稀释 cDNA。
   4. 短暂涡流，然后旋转并储存在-20°C，直到需要。
7. 执行 qPCR。建议使用市售套件（参见材料表），并遵循制造商的说明。
   1. 使用该套件，在 96 井板的一个井中制备含有 2 μL cDNA 和 200 nM（每个）的前进和反向底转的 25 μL 反应。
   2. 用于测量热冲击基因的底基因，hsp-70和hsp-16.2，以及18S rRNA（用于规范化控制）列在材料表中。可根据需要使用多个规范化控件。
   3. 在测量 18S 之前稀释 cDNA 样品50 倍，以确保测定在线性范围内。适当的 qPCR 条件因使用的套件和底件而异（参见代表性结果）。
   4. 对于 qPCR 使用实时 PCR 检测系统（参见材料表），qPCR 的周期为 40 个周期，5°C 为 5 s 变性，58 °C 为 30 s 退火，72 °C 用于 30 s 扩展。
      注:最佳退火温度可能因底向和条件而异。
   5. 使用 +Ct 或标准曲线方法^{12 进行量化}。

4. 在有机体一级测量HSR的特高覆盖测定

1. 同步蠕虫（第 1.2 节），并保持在 20°C，直到所需的发育阶段。对于N2蠕虫，尚未达到生殖成熟度的年轻成年蠕虫在产卵同步后60小时生成。
   注:发育时间随各菌株和蠕虫的升高温度而变化。重要的是，在生殖成熟期开始之后，HSR诱导的幅度大约下降2-4倍（见讨论）。
2. 热击蠕虫，如步骤2.2所述6小时。
3. 从水浴中取下盘子，取出石蜡膜，让蠕虫在20°C下孵育48小时。
4. 计算在机械刺激后可以立即爬走的蠕虫数量，而不会发生抖动或瘫痪。
   注:6小时孵育是检查减少覆盖条件的最佳方法，但可能需要更长的暴露时间来寻找增强功能覆盖的条件。

使用本手稿中描述的方案，使用荧光报告器、RT-qPCR 和封面检测测量 HSR 感应。在每种情况下，第1.2节中的程序都被用来生成尚未达到生殖成熟度的同步的年轻成年蠕虫。

为了在细胞水平上可视化HSR诱导，根据协议第2节分析了M446（hsp-70p:::::gfp）和CL2070（hsp-16.2p::gfp）荧光报告器菌株。hsp-16.2p::gfp在没有热冲击的阴性对照样本中，hsp-16.2报告员只表现出正常的自动荧光，而hsp-70报告员在肛门减压肌中具有组成荧光，如先前报道的4（图1A）。在33°C下1小时热冲击后，在两名记者中观察到强荧光;但是，表达式模式因使用哪个报告器而与众不同（图 1B）。hsp-70记者在肠道和精子中最亮，而hsp-16.2记者在咽中最亮。此外，hsp-16.2记者的诱导量具有很高的蠕虫变异性，但hsp-70记者没有13。

第 2 节的常用变体是执行干式培养箱而不是循环水浴中的热冲击。因此，还测试了这两种方法的区别。结果发现，这两种协议都使用我们的条件对两个荧光报告器进行了强健的感应，尽管建议将循环水浴作为最佳做法（参见讨论）（图1B）。

为了测试记者对转录因子HSF-1的依赖性，在测量记者诱导之前，使用喂料RNAi来击倒hsf-1。研究发现，在HSF-1击倒时，两种菌株的荧光严重降低，表明这些记者是HSF-1依赖文献4（图2）所述。然而，也观察到，咽荧光在hsf-1击倒后，在两个记者中持续存在，这与先前的报道一致，即咽部肌肉通过喂养14对RNAi具有抗药性。

为了在分子水平上量化HSR的整个蠕虫诱导，使用协议第3节使用RT-qPCR测量了两个内源性HSP。以三钙为单位测量样品，为每个底向器生成标准曲线，并分析每个样品的熔体曲线进行质量控制。研究发现，33°C热冲击1小时导致两个热休克基因，hsp-70和hsp-16.2的相对表达增加2，000多倍（hsp-16.2图3）。这些结果表明，这两个内源基因都适合测量HSR诱导，33°C热冲击1小时足以产生实质性反应。但是，在解释热冲击诱导的绝对程度时应谨慎，因为没有热冲击的 mRNA 水平非常低。

为了分析对热冲击的生理反应，使用协议第4节对有机体性热吸收测定进行了测试。研究发现，蠕虫在33°C下暴露在6小时热冲击下，在48小时恢复后，蠕虫的正常运动减少了20%（图4A）。这种测定对HSF-1转录因子的依赖性测试使用喂养RNAi敲打hsf-1，然后再使蠕虫暴露在压力之下。研究发现，hsf-1的击倒导致正常运动急剧下降，>95% 的蠕虫在用铂金线挑后表现出抖动或瘫痪。

我们比较了这种替代性有机体测定法，通常称为热耐症。在热耐死度测定中，使用干培养箱将蠕虫暴露在连续 35°C 的温度下，并在不同时间点测量活虫的百分比。使用这种测定方法，发现连续暴露在35°C的蠕虫在大约8小时暴露后死亡（图4B）。然而，当使用RNAi击倒测试这种测定对HSF-1的依赖性时，发现对hsf-1的抑制不会导致热耐受性降低。以前使用 HSF-1 突变显示的类似结果（请参阅讨论）。因此，不建议使用热耐症测定来测量HSR，并且在有机体一级检查HSR是首选的方法。

图1:用荧光测量器测量HSR感应。（A） hsp-70p的基底和（B）热致用表达::gfp和hsp-16.2p::gfp在水浴或孵化器中，在33°C下热冲击1小时后应变。蠕虫在OP50细菌上被提出64小时，热震惊，然后在20°C恢复8小时成像前。供参考，在 （A） 中无热震蠕虫在 （B） 中重新规范化，以匹配热冲击蠕虫的范围和饱和度。显示了两个实验复制的代表性图像。比例线 = 250 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:用荧光测量器测量的HSR感应取决于HSF-1。含有hsp-70p 的应变::gfp 和 hsp-16.2p::gfp 记者在控制（L4440空矢量）或hsf-1 RNAi 板上提出 64 小时，在水浴中 33 °C 下暴露在 1 小时热冲击下，然后在 20 °C 下恢复 8 小时。显示了两个实验复制的代表性图像。比例线 = 250 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:使用RT-qPCR测量的HSR感应。N2蠕虫在HT115细菌上繁殖60小时，然后在33°C水浴中加热1小时。hsp-70 （C12C8.1） 和 hsp-16.2的相对 mRNA 水平显示为无热冲击控制。绘制的值是四个生物复制的平均值，误差条表示 = SEM。 统计显著性是使用未配对的学生 t 检验计算的。**p < 0.01.请单击此处查看此图的较大版本。

图4:热覆盖，但不是热度，取决于HSF-1。N2 蠕虫在控制 （L4440） 或hsf-1 RNAi 板上提出 60 h，然后转移到:（A） A 33°C 水浴 6 小时，在 20°C 下恢复 48 小时，然后为正常运动（热覆盖）或（B） A 35 °C 干培养箱打分，每 2 小时取出一次，直到死亡（嗜热）。每次检测在2个独立日内与n= 30人一起完成。显示平均值。请单击此处查看此图的较大版本。

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