方法文章

利用液相色谱-质谱法同时定量分析癌细胞培养液中选定的犬尿氨酸类物质

DOI：

10.3791/61031

⸱

2020年5月9日

 ,  , 
1Laboratory of Separation and Spectroscopic Method Applications, Centre for Interdisciplinary Research, The John Paul II Catholic University of Lublin

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种检测癌细胞培养上清液中犬尿氨酸通路产生的四种不同色氨酸代谢物（犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、黄尿酸、3-羟基邻氨基苯甲酸）的实验方案，该方法采用液相色谱串联单四极杆质谱法进行分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

犬尿氨酸通路及其代谢产物犬尿氨酸类物质因参与免疫调节和癌症生物学过程而受到越来越多关注。 体外 细胞培养实验常用于研究不同色氨酸代谢物在疾病机制中的作用，并用于测试治疗策略。富含分泌性代谢物和信号分子的细胞培养基可反映色氨酸代谢及其他细胞活动的状态。目前亟需建立新的可靠方法，以实现对复杂细胞培养基中多种犬尿氨酸类物质进行准确定量，从而能够快速、可靠地分析大量样本。该目标可通过液相色谱-质谱联用技术实现。这一强大技术已被广泛应用于临床和科研实验室中的代谢物定量，亦可用于犬尿氨酸类物质的检测。

本文介绍了采用液相色谱串联单四极杆质谱法（LC-SQ）同时测定体外培养癌细胞收集培养基中四种犬尿氨酸代谢物的方法，这四种代谢物分别为犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸和黄尿酸。in vitro 培养的癌细胞。与其它质谱仪相比，单四极杆检测器操作简便且成本较低。在单四极杆质谱分析中，样品产生多个离子，并根据其特定的质荷比（m/z）进行分离，随后采用单离子监测（SIM）模式进行检测。

本文重点阐述了所报道方法的优势并指出了某些不足之处，聚焦于液相色谱-串联质谱（LC-SQ）分析中的关键要素，包括样品制备、色谱分离及质谱分析过程。同时讨论了质量控制、方法校准条件以及基质效应等问题。我们描述了一种简便的应用方式，即使用3-硝基酪氨酸作为所有目标分析物的单一类似物标准品。通过人卵巢癌和乳腺癌细胞的实验验证，所提出的LC-SQ方法 生成可靠的结果，并可进一步应用于其他 体外 细胞模型

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

犬尿氨酸通路（KP）是人体细胞中色氨酸（Trp）分解代谢的主要途径。肝外细胞中的吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO-1）是KP的第一步限速酶，可将Trp转化为N-甲酰犬尿氨酸1在犬尿氨酸途径（KP）内的后续步骤中生成其他次级代谢产物，即具有多种生物学特性的犬尿氨酸类物质。犬尿氨酸（Kyn）是色氨酸（Trp）分解代谢产生的首个具有毒性的稳定代谢物，可通过与芳烃受体（AhR）结合来调控细胞事件。2随后，Kyn 通过非酶促自发反应或酶催化过程转化为多种分子，生成如 3-羟基犬尿氨酸（3HKyn）、邻氨基苯甲酸（AA）、3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）、犬尿喹啉酸（Kyna）和黄尿酸（XA）等代谢产物。另一下游代谢物 2-氨基-3-羧基-6-醛基甲酰基戊二酸（ACMS）可发生非酶促环化反应，生成喹啉酸（QA）或吡啶甲酸（PA）。1最后，QA 进一步转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+)3，KP 通路的终末代谢物，是一种重要的酶辅因子。某些犬尿氨酸类物质具有神经保护作用，如 Kyna 和 PA，而其他物质，如 3HAA 和 3HKyn，则具有毒性4黄尿酸由3-羟基犬尿氨酸（3HKyn）生成，具有抗氧化和血管舒张特性5. XA 在老化晶状体中积聚，并导致上皮细胞凋亡6. KP，于20世纪中期被描述th 世纪以来，随着其在多种疾病中的作用被证实，该代谢途径受到更多关注。此代谢通路活性增强及部分犬尿氨酸类物质的累积可调节免疫反应，并与多种病理状态相关，如抑郁症、精神分裂症、脑病、HIV、痴呆、肌萎缩侧索硬化症、疟疾、阿尔茨海默病、亨廷顿病和癌症4,7肿瘤微环境和癌细胞中可观察到色氨酸代谢的一些变化2,8此外，犬尿氨酸类物质被视为有前景的疾病标志物9在癌症研究中， 体外 细胞培养模型已得到充分建立，被广泛用于抗癌药物反应的临床前评估10色氨酸代谢物由细胞分泌到培养基中，可通过检测这些代谢物来评估犬尿氨酸通路的状态。因此，有必要建立适当的方法，采用简便、灵活且可靠的实验方案，对多种生物样本中尽可能多的犬尿氨酸通路代谢物进行 simultaneous 检测。

本文介绍了一种通过液相色谱-单级质谱（LC-SQ ）同时测定癌细胞培养后培养基中犬尿氨酸代谢途径四种代谢物——Kyn、3HKyn、3HAA和XA的实验方案。在现代分析方法中，与使用Ehrlich试剂的非特异性生化检测方法11,12相比，液相色谱法13,14,15,16更适用于同时检测和定量各色氨酸分解代谢产物。目前已有多种用于人体样本中犬尿氨酸类物质测定的方法， 主要基于配备紫外或荧光检测器的液相色谱技术13,17,18,19。而液相色谱串联质谱检测器（LC-MS）由于具有更高的灵敏度（更低的检测限）、选择性和重复性，似乎更适用于此类分析。 

色氨酸代谢物已在人血清、血浆和尿液中被测定13,20,21,22,23，但人们也期望建立适用于其他生物样本（如细胞培养基）的检测方法。此前，已有研究采用液相色谱-质谱法（LC-MS）检测人胶质瘤细胞、单核细胞、树突状细胞或星形胶质细胞经γ-干扰素（IFN-γ）处理后收集的培养基中的色氨酸衍生产物24,25,26。目前亟需建立新的经过验证的检测方案，以实现对癌症模型中不同培养基、细胞类型及处理条件下多种代谢物的评估。

所开发方法的目的 该方法用于在一次分析运行中定量四种主要的犬尿氨酸类物质，以指示犬尿氨酸通路（KP）中的异常情况。本文展示了我们近期发表的定量LC-SQ分析方法中的关键步骤，该方法采用一种内标物（3-硝基酪氨酸，3NT），对细胞培养上清液中选定的具有重要生物学意义的犬尿氨酸类物质进行检测。 体外 培养的人类癌细胞27据我们所知，这是首次采用液相色谱-串联质谱法（LC-SQ）同时定量检测细胞培养基中3-羟基犬尿氨酸（3HKyn）、3-羟基蒽犬尿啉（3HAA）、犬尿氨酸（Kyn）和黄尿酸（XA）的方案。 体外 培养的细胞。经过一些改进后，该方法还可进一步应用于更广泛的细胞培养模型中色氨酸代谢变化的研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3NT、Kyn、3HKyn、3HAA、XA 标准品储备溶液的制备

  1. 用精度最高的天平（每种试剂精确至0.3 mg）称取试剂。为获得更高准确性，可按比例放大试剂用量，并根据步骤1.2调整溶剂体积。
  2. 将试剂溶解于300 µL溶剂中，配制成1 g/L的储备液。其中，3NT溶于含1%（v/v）甲酸（FA）的水溶液；Kyn、3HAA和XA溶于二甲基亚砜（DMSO）；3HKyn溶于用盐酸（HCl）调节pH至2.5的酸化水中。
    警告：3HAA对眼睛、鼻腔、咽喉和肺部具有刺激性，吸入、皮肤接触或吞咽后有害。操作时应佩戴适当的防护装备，如手套和口罩。
  3. 将小瓶盖紧后置于超声水浴中1分钟，以加速溶解。
    注意：储备液应储存于-20 °C，避免反复冻融（最多不超过3次），因储备液稳定性较差。

2. 活性炭处理培养基的制备

  1. 在离心管中称取280 mg活性炭，并加入5 mL为培养目标细胞而配制的液体培养基。
  2. 将含有培养基和活性炭的离心管置于往复摇床中，室温下振荡2小时（设定速度为50次/分钟）。随后，在6000 × g 条件下离心15分钟。 
  3. 从离心机中取出离心管，小心吸取上清液，避免扰动沉淀物。如有必要，可重复离心，以彻底去除活性炭残留。
  4. 使用0.45 µm注射器滤器过滤上清液。
  5. 通过LC-MS检测一个预实验样品（操作见步骤6.3.2），确认经活性炭预处理的培养基中不含犬尿氨酸类物质残留。若仍检出，则重复步骤2.1–2.4。
    注意：若初始完全培养基中原本不含犬尿氨酸类物质，则可省略活性炭纯化步骤。在此情况下，使用常规配制的完全培养基来制备校准标准品和质控样品。
  6. 将制备好的培养基于4 °C保存，直至分析使用。

3. 配制校准溶液和绘制校准曲线

  1. 向经活性炭预处理的培养基中加入 0.75 µL 的 0.1 g/L 3NT 溶液，并至少添加四个标准品（3HKyn、3HAA、Kyn、XA），每个标准品设置至少六个不同浓度以覆盖校准范围。每份样品的终体积保持为 150 µL。充分涡旋混匀。样品制备使用 1.5 mL 离心管。
    注意：建议的 3HKyn 校准点为：0.018、0.045、0.22、1.12、2.23、4.46 µmol/L；Kyn 的校准点为：0.0096、0.048、0.24、1.20、2.40、3.84 µmol/L；3HAA 的校准点为：0.033、0.16、0.65、3.27、6.53、13.06 µmol/L；XA 的校准点为：0.019、0.13、0.49、1.22、3.65、4.87 µmol/L。
  2. 向每根离心管中加入 150 µL 含 1%（v/v）甲酸的冷甲醇（保存于 -20 °C），用于样品去蛋白。盖紧管盖，充分涡旋混匀。
  3. 将样品在 -20 °C 下孵育 40 分钟。
  4. 在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 15 分钟。从离心机中取出管子，将上清液收集至新管中，避免扰动沉淀。
  5. 使用自动移液器将 270 µL 上清液转移至玻璃小瓶中。将小瓶放入蒸发仪中，轻柔蒸发至干燥。使用适用于水/甲醇组分的适当程序蒸发挥发性成分。温度不得超过 40 °C， 避免过度干燥。
    注意：与塑料锥形管相比，平底玻璃小瓶（即色谱小瓶）可实现更快的蒸发速度和更高的回收率。
  6. 30 分钟后检查蒸发状态。如有必要，继续蒸发（例如额外增加 10 分钟）。避免过度干燥。
  7. 将小瓶从蒸发仪中取出。每份样品用 60 µL 含 0.1%（v/v）甲酸的水溶液重新溶解。将溶剂加入含有残留物的小瓶中，盖紧瓶盖后充分涡旋混匀。
  8. 将样品转移至 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 下以 14,000 × g 离心 15 分钟，以分离沉淀的蛋白质。
  9. 避免扰动蛋白沉淀，使用自动移液器将上清液转移至带有锥形玻璃插件的色谱小瓶中。盖紧瓶盖。
  10. 检查插件小瓶中是否存在气泡，必要时予以去除（例如通过涡旋）。
  11. 将含有样品的色谱小瓶放入液相色谱自动进样器中。记录样品在自动进样器托盘中的位置。

4. 质量控制（QC）样品的制备

  1. 在1.5 ml离心管中，向经活性炭预处理的培养基中加入0.75 µL浓度为0.1 g/L的3NT溶液，以及四种犬尿氨酸类物质（3HKyn、3HAA、Kyn、XA）的标准品溶液，标准品浓度选自校准曲线的线性范围。调整样品终体积至150 µL。
    注意：如适用，可配制多个处于校准曲线线性范围内的不同浓度质控样品。
  2. 按照第3节（步骤3.2–3.11）所述方案操作。

5. 设置液相色谱-质谱系统

  1. 准备流动相溶剂：溶剂A：超纯水中含20 mmol/L甲酸铵（用甲酸调节pH至4.3）；溶剂B：100%乙腈。
    注意：仅使用硼硅酸盐玻璃瓶。重新灌装前用超纯水冲洗瓶子。切勿使用经洗涤剂清洗的瓶子。
    警告：乙腈可导致严重健康危害或死亡。遇热极易燃烧。乙腈液体及蒸气可刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。
    1. 在玻璃瓶中将结晶试剂（15.77 g）溶于50 mL超纯水中，配制5 mol/L甲酸铵储备液。搅拌至所有残留物完全溶解。通过0.45 µm膜过滤以去除任何残留杂质（例如，使用尼龙注射器滤膜）。将储备液储存于4 °C条件下。
    2. 在棕色玻璃瓶中，将4 mL 5 mol/L甲酸铵水溶液加入980 mL超纯水中，充分搅拌。放入搅拌子并将瓶子置于磁力搅拌器上。将pH电极浸入溶液中，在搅拌条件下监测pH值。使用带有0.2 mL吸头的自动移液器逐滴加入甲酸储备液（98%-100%），调节pH至4.3，再用超纯水定容至1 L，并充分搅拌。
      注意：为防止微生物生长，溶剂至少每周配制一次。
      警告：甲酸（FA）吸入后有毒，可引起皮肤灼伤和眼部损伤。操作应在通风橱中进行；佩戴防护手套和防护服。
    3. 所有溶液均通过0.22 µm膜过滤（例如，使用尼龙注射器滤膜）以去除任何残留杂质。可选地，可使用专用于液相色谱溶剂储液瓶的溶剂入口过滤器，以防止颗粒物进入系统。
  2. 启动液相色谱-质谱（LC-MS）控制与数据采集软件。
  3. 用流动相冲洗液相色谱系统，以去除气泡并润洗所有溶剂通道。
  4. 安装保护柱，防止分析柱堵塞。
  5. 先用100%乙腈冲洗保护柱和分析柱（C18，2.1 × 100 mm，1.8 µm）约30分钟，然后用100%溶剂A冲洗，直至柱压稳定。使用控制软件监控系统性能。
  6. 在数据采集软件中设置适当的液相色谱参数。
    1. 设置梯度程序：0–8 min，溶剂B为0%；8–17 min，溶剂B从0%升至2%；17–20 min，溶剂B保持2%；20–32 min，溶剂B从10%升至30%；32–45 min，溶剂B降至0%。
    2. 设置流动相流速为0.15 mL/min，总分析运行时间为45 min，柱温为+40 °C，进样体积为10 µL。
  7. 设置质谱检测器的采集参数。
    1. 设定电离参数：单离子监测（SIM）、正离子模式、雾化气压力50 psi、干燥气温度+350 °C、干燥气流速12 L/min、毛细管电压5500 V。
    2. 选择待测物监测离子：3HKyn，m/z 225.0（扫描时间段：2–6 min，碎裂电压：100 V）；Kyn，m/z 209.0（扫描时间段：6–12 min，碎裂电压：80 V）；3HAA，m/z 154.0（扫描时间段：12–18 min，碎裂电压：80 V）；3NT，m/z 227.0（扫描时间段：18–23 min，碎裂电压：100 V）；XA，m/z 206.0（扫描时间段：23–45 min，碎裂电压：100 V）。
  8. 建立样品序列，并在液相色谱系统上运行样品。
  9. 首先，在分析实验样品之前，至少连续运行三次空白样品（溶剂A），随后运行一次质控（QC）样品。
  10. 打开数据分析软件，加载QC样品的检测结果。
  11. 检查色谱图中各分析物峰的位置。若信号偏离预期位置，应调整相应分析物信号采集的时间窗口。有关信号积分操作，请参阅软件使用手册。

6. 构建校准曲线

  1. 在数据采集软件中，将校准标准品加入工作列表，并以三份重复样运行标准品。
  2. 积分并测量分别在约 4.4 分钟、10 分钟、16 分钟、21 分钟和 30 分钟保留时间处对应的 3HKyn、Kyn、3HAA、3NT 和 XA 的峰面积。
  3. 使用电子表格程序为每种代谢物构建单独的校准曲线。
    1. 为创建校准图，绘制分析物峰面积与 3NT 峰面积比值相对于分析物浓度的数值。
    2. 分析空白样品（仅添加 3NT 的活性炭预处理培养基），以确保培养基中无目标分析物的残留。若存在信号，则从每个校准点的数值中扣除该值。
    3. 检查每条校准曲线的线性。
      1. 针对每种分析物分别建立斜率-截距线性方程（y = ax + b），其中 y 表示分析物峰面积与 3NT 峰面积的比值，a 为斜率，x 为分析物浓度（µmol/L），b 为曲线截距。绘制“y”相对于“x”的图即得到校准曲线。
      2. 在校准图上添加线性趋势线，显示校准曲线方程和回归系数。确保回归系数 > 0.990。若校准标准品结果不匹配，需重新配制和/或分析；必要时可调整校准曲线的浓度范围。
    4. 在分析实验样品前，先分析质控样品以检查系统性能。若结果不兼容（与参考值偏差超过 ±20%），则需重新制备校准曲线。

7. 体外细胞培养及用于分析的样品采集

  1. 将研究的癌细胞（MDA-MB-231 或 SK-OV-3）接种于含 4.5 g/L ᴅ-葡萄糖、10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、2 mmol/L ʟ-谷氨酰胺和 1 U 青霉素/链霉素的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）中，在 37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养以扩增细胞，用于后续实验。当细胞融合度达到 80% 时进行传代。
  2. 用胰蛋白酶消化使细胞从培养皿上脱落，以每孔 0.3 × 106 个细胞的密度接种于 12 孔板中，并置于培养箱中过夜培养。
  3. 次日，吸除培养基，根据实验设计加入新鲜 DMEM 培养基，可选择性添加待研究的化合物。
  4. 培养 48 小时后，收集细胞上方的培养上清液（约 500 µL）至 1.5 mL 离心管中。在 14,000 × g 条件下离心 5 分钟，以去除细胞碎片。收集上清液，并于 -80 °C 保存，待后续分析使用。
  5. 保存第 7.4 步获得的细胞沉淀，用于蛋白质定量。将样品在 -20 °C 冻存。
    注意：不同孔中获得的培养基结果应根据总蛋白含量进行归一化处理，以校正各孔细胞数量的差异。蛋白浓度测定方法见第 9 步。

8. 准备用于液相色谱-质谱分析的样品

  1. 在室温下解冻冷冻样品，并充分混匀。将149.25 µL培养基转移至离心管（1.5 mL）中。
  2. 加入0.75 µL浓度为0.1 g/L的3NT溶液（内标）。盖紧管盖，充分涡旋混匀。
  3. 加入150 µL预冷至-20 °C并含有1%（v/v）甲酸（FA）的甲醇，用于样品去蛋白。盖紧管盖，充分涡旋混匀。
  4. 继续按照第3节（步骤3.3–3.11）所述进行样品制备。
    注意：某些癌细胞（如SK-OV-3）会向培养基中大量分泌犬尿氨酸（Kyn）。为使数据落在校准曲线的线性范围内，通常需要对样品进行约100倍稀释。在此情况下，将部分样品用水中含0.1%（v/v）甲酸的溶液稀释，并与未稀释样品一同分析。用于校准曲线的标准品应使用稀释100倍的完全培养基配制。或者，若能保证适当的溶解度和线性关系，可在校准曲线中增加更多浓度点，以适应实验样品中Kyn的浓度水平。
  5. 按照第5节所述方法通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析样品。建立样品序列，并对每个样品进行三针重复进样。
  6. 完成样品序列后，测定分析物的峰面积。
  7. 使用可用软件生成电子表格，并获取数值数据。
  8. 在电子表格的一列中，计算分析物峰面积与3NT峰面积的比值。
  9. 使用为每种分析物单独建立的线性校准方程（来自步骤6.3）计算实验样品中各分析物的浓度。

9. 蛋白质含量评估与数据标准化

  1. 将步骤 7.5 中的细胞沉淀用 100 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）在 1.5 mL 离心管中重悬。
    注意：通过将 8 g 氯化钠、0.2 g 氯化钾、1.44 g 磷酸氢二钠和磷酸二氢钾溶解于 950 mL 超纯水中配制 PBS 溶液。充分搅拌。用盐酸（逐滴加入）调节 pH 至 7.4。用超纯水定容至 1 L。持续搅拌直至溶液均匀。
    警告：盐酸具有强腐蚀性，必须采取适当的安全防护措施。接触人体皮肤可引起红肿、疼痛及皮肤灼伤。应在通风橱内操作；佩戴防护手套和防护服。
  2. 将样品在  -20 °C 冷冻，然后在冰上解冻。重复此步骤 3 次。
  3. 在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 15 分钟。将上清液收集至新的离心管中。切勿扰动沉淀。
  4. 用 PBS 将上清液稀释 10 倍。
  5. 构建每孔蛋白量为 0 至 2 µg 范围的标准曲线。
    1. 为标准曲线配制牛血清白蛋白（BSA）标准溶液。将 1.23 µg BSA 溶解于 1 mL 超纯水中，并充分涡旋混匀。
    2. 在 96 孔板中分别加入不同体积的 BSA 标准溶液（1.23 µg/mL）：0 µL、2 µL、4 µL、5 µL、7 µL、10 µL、15 µL、20 µL。
    3. 用 PBS 补充各孔液体至终体积为 50 µL。
  6. 取步骤 9.4 所得细胞裂解液 10–15 µL 加入同一块 96 孔板中。每孔用 PBS 补足至终体积 50 µL。
    注意：如有需要，可调整每孔中细胞裂解液的加样体积，使其落在标准曲线的线性范围内。每孔样品的终体积应保持为 50 µL。
  7. 向每个孔中加入 200 µL Bradford 试剂（用超纯水稀释 5 倍）。
  8. 将 96 孔板在室温下孵育至少 5 分钟。将板插入酶标仪中，在波长 λ = 595 nm 处测定吸光度。
  9. 使用电子表格软件绘制标准曲线。以 BSA 含量（µg）为横坐标，吸光度为纵坐标作图。添加线性趋势线，并在图表上显示标准曲线方程和回归系数。
  10. 利用线性方程（y = ax + b，其中 y 表示在 λ = 595 nm 处的吸光度，a 为斜率，x 为蛋白含量（µg），b 为截距）计算样品中的蛋白含量。
    注意：计算时应考虑样品的稀释倍数。
  11. 利用估算的蛋白含量，将样品中犬尿氨酸含量归一化为每 1 mg 蛋白中的含量。具体方法是将步骤 8.9 测得的犬尿氨酸浓度除以步骤 9.10 得到的总蛋白含量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）在生物活性分子的定量分析中具有无可争议的优势，尽管复杂样品中的某些组分可能引起所谓的基质效应，从而干扰分析物的离子化过程。这会导致离子抑制或离子增强，显著降低检测的准确性，并影响LC-MS的检出限/定量限，因此被视为该方法的“薄弱环节”。在本实验方案中，离子通过电喷雾离子化（ESI）在正离子模式下生成，该模式也已被用于其他色氨酸（Trp）代谢物测定的研究中13。然而，与大气压化学离子化（APCI）相比，ESI更容易受到基质效应的影响28。因此，为了准确测定细胞培养基中的Trp代谢物，我们采用了内标法和基质匹配校准法，以补偿基质依赖性效应对分析物信号的影响，并校正样品前处理过程中目标化合物的损失。我们对所有待测分析物（3HKyn、Kyn、3HAA、XA）均使用同一种内标物（3NT）。3NT在用于细胞培养的原始新鲜培养基中未被检出，且在所采用的分析条件下表现出与目标化合物相似的行为，因此3NT是合适的内标物27。此外，为了简化实验流程，使其更易于被广大用户所采用，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种详细的液相色谱-串联质谱（LC-SQ）方法，用于同时定量测定培养基中四种主要的色氨酸代谢物（3HKyn、Kyn、3HAA、XA） 体外 培养的人类癌细胞。分析过程中特别关注样品制备、色谱/质谱操作步骤以及数据解读，这些是整个分析中最关键的环节。

通常，由于液相色谱-质谱（LC-MS）分析具有高灵敏度，因此要求实验方案必须严格规范，并确保所用材料的高纯度。这包括在整个标准操作流程中使用经过彻底清洁和正确清洗的玻璃器皿，以及高纯度的化学试剂。使用新鲜配制的水相流动相溶剂至关重要，以避免微生物污染，此类污染在该高灵敏度检测方法中可能严重影响分析结果。在将样品注入液相色谱系统之前，必须仔细检查样品中是否存在任何不溶性颗粒。需要注意的是，在进行样品分析前，色谱柱必须充分平衡。若未遵守上述规定，可能导致样品、液相色谱系统或分析柱受到污染，或导致质谱离子源中样品离子化不充分，最终引起信号偏移。

为了获得最佳结果，本方案中有两个关键点需要特别强调。其中最关键的步骤是样品制备。采用不适当的处理方法会导致目标化合物...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作获得了欧洲区域发展基金（European Regional Development Fund）通过2007-2013年东部波兰发展运营计划（Operational Programme Development of Eastern Poland）（项目编号：POPW.01.03.00-06-003/09-00）的资助，以及卢布林若望保禄二世天主教大学生物技术和环境科学学院（Ilona Sadok青年科学家基金）、波兰国家科学中心OPUS13项目（项目编号：2017/25/B/NZ4/01198，负责人：Magdalena Staniszewska）的支持。  作者感谢卢布林若望保禄二世天主教大学跨学科研究中心氧化应激实验室Agnieszka Ścibior教授共享细胞培养和蛋白质定量相关设备。 

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-羟基-DL-犬尿氨酸Sigma-AldrichH1771
3-羟基邻氨基苯甲酸Sigma-Aldrich14877697%
3-硝基-L-酪氨酸Sigma-AldrichN7389
乙腈Supelco1.00029LC-MS用超纯级LiChrosolv
活性炭Supelco05105粉末
分析天平Ohaus
分析柱Agilent Technologies959764-902Zorbax Eclipse Plus C18快速分离HT（2.1 × 100 mm，1.8 µm）
甲酸铵Supelco7022LC-MS流动相添加剂，LiChropur，≥99.0%
牛血清白蛋白Sigma1001887398
色谱小瓶瓶盖Agilent Technologies5185-5820蓝色螺旋盖，PTFE/红色硅胶隔垫
细胞培养皿Nest704004聚苯乙烯，无热原，无菌
细胞培养板Biologix07-601212孔，无热原，无细胞毒性，无菌
细胞培养箱Thermo Fisher ScientificHERAcell 150i Cu
离心机Eppendorf型号 5415R
离心机Eppendorf型号 5428
离心管BionovoB-2278Eppendorf型，1.5 mL
离心管BionovoB-3693Falcon型，50 mL，聚丙烯材质
色谱数据采集与分析软件Agilent TechnologiesLC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
色谱插入式小瓶Agilent Technologies9301-1387100 µL
色谱小瓶Agilent Technologies5182-07142 mL，透明玻璃
二甲基亚砜Supelco1.02950Uvasol
Dubelcco’s改良Eagle’s培养基（DMEM）PAN BiotechP04-41450
双通道pH/电导率仪Mettler ToledoSevenMulti
浓缩仪Genevac型号 EZ-2.3 Elite
胎牛血清Sigma-AldrichF9665
甲酸Supelco5.33002LC-MS用LiChropur
试剂储存玻璃瓶BionovoS-207050 mL，透明玻璃
保护柱Agilent Technologies959757-902Zorbax Eclipse Plus-C18窄径保护柱（2.1 × 12.5 mm，5 µm）
盐酸Merck1.00317.1000
L-犬尿氨酸Sigma-AldrichK8625≥98%（HPLC）
磁力搅拌器WigoES 21 H
微量天平Mettler Toledo型号 XP6
Milli-Q纯水系统MilliporeZRQSVPO30Direct-Q 3 UV带泵系统
四极杆质谱仪Agilent TechnologiesG1948B型号 6120
青霉素-链霉素Sigma-Adrich048M4874V
酶标仪Bio TekSynergy 2，由Gen5软件控制
氯化钾Merck1.04936.1000
磷酸二氢钾Merck1.05108.0500
蛋白检测试剂浓缩液BioRad500-0006
往复式摇床StuartSSL4
移液管Nest3260015 mL，聚苯乙烯，无热原，无菌
氯化钠Sigma-Aldrich7647-14-5
磷酸氢二钠Merck1.06346.1000
溶剂入口过滤器Agilent Technologies5041-2168玻璃滤器，孔径20 μm
溶剂储液瓶（用于LC-MS）Agilent Technologies9301-65241 L，透明玻璃
溶剂储液瓶（用于LC-MS）Agilent Technologies9301-65261 L，棕色玻璃
电子表格软件Microsoft OfficeMicrosoft Office Excel
搅拌子Bionovo6-2003聚四氟乙烯涂层
用于培养基过滤的注射器滤器Bionovo7-8803再生纤维素，Ø 30 mm，0.45 µm
用于流动相组分过滤的注射器滤器Bionovo6-0018尼龙，Ø 30 mm，0.22 µm
组织培养板VWR10062-90096孔，无菌
胰蛋白酶-EDTA溶液Sigma-AldrihT4049-100 mL
超高效液相色谱系统Agilent TechnologiesG1367D, G1379B, G1312B, G1316C1200 Infinity系统，包含自动进样器（G1367D）、脱气装置（G1379B）、二元泵（G1312B）、柱温箱（G1316C）
超声波清洗机Polsonic104533型号 6D
涡旋振荡器Biosan型号 V-1 plus
黄尿酸Sigma-AldrichD12080496%

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment. International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).
  2. Heng, B., et al. Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology. Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).
  3. Badawy, A. A. B. Kynurenine pathway and human systems. Experimental Gerontology. 129, (2020).
  4. Chen, Y., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states. International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).
  5. Sathyasaikumar, K. V., et al. Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects. Neuroscience. 367, 85-97 (2017).
  6. Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid. BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).
  7. Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. 3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system. Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).
  8. Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity. Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).
  9. Tan, V. X., Guillemin, G. J. Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis. Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).
  10. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).
  11. Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity. Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).
  12. Park, A., et al. Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways. Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).
  13. Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. Chromatographic analysis of tryptophan metabolites. Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).
  14. Fuertig, R., et al. LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).
  15. Marcos, J., et al. Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).
  16. Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).
  17. Lesniak, W. G., et al. Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites. Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).
  18. Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection. International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).
  19. Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection. Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).
  20. Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum. Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).
  21. Arnhard, K., et al. A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma. Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).
  22. Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).
  23. Huang, Y., et al. A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients. Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).
  24. Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).
  25. Zhu, W., et al. Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).
  26. Hashioka, S., et al. Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes. Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).
  27. Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).
  28. Annesley, T. M. Ion suppression in mass spectrometry. Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).
  29. Houée-Lévin, C., et al. Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences. Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).
  30. Wei, H., et al. Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage. Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).
  31. Liu, P., et al. Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes. BMC Cancer. 9, 416(2009).
  32. Mailankot, M., et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章