从癌细胞培养物中收集的介质光谱分析的选定金核素的同步量化

Summary

这里描述的是一个协议，用于确定从液体色谱分析的癌细胞培养物中收集的介质中产生的四种不同的色氨酸代谢物（金黄素、3-羟基核素、Xanthurenic酸、3-羟基苯甲酸）。

Abstract

基努雷宁通路和色氨酸卡塔博利特称为基努雷宁已经受到越来越多的关注，因为他们参与免疫调节和癌症生物学。 体外 细胞培养分析通常用于了解不同色氨酸卡托邦细胞在疾病机制中的贡献以及用于测试治疗策略。富含分泌代谢物和信号分子的细胞培养介质反映了色氨酸代谢和其他细胞事件的状态。需要在复杂的细胞培养介质中可靠量化多种基努他宁的新协议，以便对多个样本进行可靠和快速的分析。这可以通过液体色谱与质谱学相结合来完成。这种强大的技术用于许多临床和研究实验室的代谢物的定量，可用于测量基努他宁。

这里介绍的是使用液相色谱与单四足质谱（LC-SQ）同时确定四个基努他宁，即基努雷宁，3-羟基核素，3-羟基苯甲酸，和从 体外 培养癌细胞中收集的介质中的黄曲霉素酸。SQ探测器使用简单，与其他质谱仪相比更便宜。在 SQ-MS 分析中，根据样品的特定质量与电荷比（m/z）生成并分离多个离子，然后使用单离子监控 （SIM） 模式进行检测。

本文注重报告方法的优点，指出了一些薄弱环节。它侧重于LC-SQ分析的关键要素，包括样品准备以及色谱和质谱分析。还讨论了质量控制、方法校准条件和矩阵效应等问题。我们描述了一个简单的应用3硝基酪氨酸作为一个模拟标准的所有目标分析。经人类卵巢癌和乳腺癌细胞实验证实，建议的LC-SQ方法产生可靠的结果，并可进一步应用于其他 体外 细胞模型。

Introduction

基努琳通路 （KP） 是人类细胞中色氨酸 （Trp） 催化的主要途径。在肝外细胞中，印度胺-2，3-二氧酶（IDO-1）是第一种限制KP酶，并将Trp转化为N-形成基核素^1。KP 内的进一步步骤会生成其他次要代谢物，即具有各种生物特性的基努他宁。Kynurenine （Kyn） 是第一个稳定的 Trp 催化物， 显示有毒性质和调节细胞事件后， 结合到阿丽尔碳氢化合物受体 （AhR）².随后，Kyn被自发地或在酶介质过程中转化为几个分子，产生诸如3-羟基核素（3HKyn）、炭酸（AA）、3-羟基苯甲酸（3-HAA）、基努雷尼酸（Kyna）和Xanthurenic酸（XA）等代谢物。另一种下游代谢物，2-氨基-3-卡博基霉素酸-6-半醛（ACMS），经历非酶循环奎诺利尼酸（QA）或野餐酸^（PA）1.最后，QA被进一步转化为烟酰胺-腺苷二核苷酸（NAD^+）3，KP端点代谢物，是一个重要的酶共同因子。一些基努肾上腺素具有神经保护特性，如Kyna和PA，而其他，即3HAA和3HKyn，是有毒^的4。由3HKyn形成的Xanthurenic酸具有抗氧化和血管电离特性^5。XA在老化的镜片中积累，导致上皮细胞^....

Protocol

1. 准备标准 3NT、Kyn、3HKyn、3HAA、XA 标准库存解决方案

1. 以最高精度（每瓶0.3毫克）在小瓶中称量试剂。为了提高准确性，请放大试剂，根据步骤 1.2 调整溶剂的体积。
2. 溶解溶剂在溶剂的300μL，以获得1克/升的库存溶液。溶解3NT在1%（v/v）的微酸（FA）在水中;金，3HAA和XA在二甲基硫化物（DMSO）;3HKyn 在水中酸化到 pH 2.5 与盐酸 （HCL）.
   警告:3HAA刺激眼睛、鼻子、喉咙和肺部。吸入、接触皮肤和吞咽时有害。佩戴适当的防护服，即手套和面罩。
3. 紧闭小瓶，放在超声波浴缸中1分钟，以加速溶解。
   注意:将库存解决方案存储在 -20 °C，并最大限度地减少由于库存解决方案不稳定造成的冻结/解冻（最大 3 个周期）。

2. 木炭处理文化媒介的制备

1. 在一根管子中，重280毫克的活性炭，并加入5 mL的液体介质，准备培养感兴趣的细胞。
2. 在室温下（将速度设置为 50 振荡/分钟），用锯锯摇杆上的介质和木炭摇动管 2 小时。接下来，将管子在 6000 x g 下离心 15 分钟。
3. 从离心机中取出管子，小心收集超纳坦，而不会干扰沉积物。如有必要，重复离心，以去除所有木炭残留物。
4. 使用 0.45 μm 注射器过滤器过滤超强剂。
5. 通过在LC-MS上....

Results

LC-MS在生物活性分子的量化方面具有无可争辩的优势，尽管复杂标本的某些成分会导致所谓的基质效应，并损害分析物的电位化。它导致离子抑制或离子增强，严重降低精度，并影响LC-MS的检测/量化极限，这被认为是该方法的"弱"点。在我们的协议中，离子是由正模式下的电喷雾电离子化（ESI）产生的，这也用于Trp代谢物测定¹³的其他研究。然而，与大气压力化学电化^（APCI）28相比，ESI更容易产生基质效应。因此，为了准确量化细胞培养介质中的 Trp 代谢物，我们使用内部标准和矩阵匹配校准来补偿矩阵依赖对分析信号的影响，并在样品准备步骤中纠正目标化合物的损失。我们对所有研究分析（3HKyn、Kyn、3HAA、XA）应用了相同的内部标准（3NT）。3NT 未在用于细胞培养的原始新鲜介质中找到，并且在应用分析条件下表现出类似目标化合物的行为。这使得3NT成为适当的内部标准^27。此外，为了简化协议，为了让广大用户更容易获得该协议，我们建议只使用含有 1% （v/v） FA 的甲醇处理，进行蛋白质去除的样品制备步骤.......

Discussion

本文提出了一个详细的LC-SQ协议，用于同时量化四个主要的Trp代谢物（3HKyn，Kyn，3HAA，XA），这些代谢物是用 体外 培养的人类癌细胞的介质测量的。特别注意样品的准备、色谱/质谱过程和数据解释，这是分析中最重要的一点。

一般来说，LC-MS 分析由于灵敏度高，需要对二手材料的严格性和纯度进行最高标准的协议。它是指在整个标准程序中应用整齐清洁和正确洗涤的玻璃器皿以及高档化学品。使用移动阶段的淡水溶剂以避免微生物污染非常重要，这种敏感方法可能会对分析产生重大影响。在注入LC系统之前，需要仔细检查分析的样品是否存在任何不溶性颗粒。需要注意的是，在进行样品分析之前，应充分平衡该列。不遵守这些规则可能导致样品、LC 系统和分析柱的污染，或在 MS 源中样品电化不足，最终导致信号转移。

为了获得最佳结果，协议中有 2 个关键点需要强调。所提交协议中最关键的部分是样品准备步骤。使用不当的程序会导致目标化合物的丢失，从而导致数量不准确。在我们的方法中，在方法开发过程中，随着蛋白质去除溶剂的选择，样品制备步骤得到.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-羟基邻	Sigma-Aldrich	H1771
3-羟基邻氨基苯甲酸	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-硝基-L-酪氨酸	Sigma-Aldrich	N7389
乙腈	Supelco	1.00029	超降解 用于 LC-MS LiChrosolv
活性炭	Supelco	05105	粉末
分析天平	Ohaus
分析柱	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18 快速分辨率 HT（2.1 x 100 mm，1.8 µm）
甲酸铵	Supelco	7022	洗脱液添加剂，用于 LC-MS、LiChropur 和 ge;99.0%
牛血清白蛋白	Sigma	1001887398
瓶盖，用于色谱样品瓶	Agilent Technologies	5185-5820	蓝色螺口盖，PTFE/红色 sil sepa
培养皿	704004聚		苯乙烯巢，无热原，无菌
细胞培养板	Biologix	07-6012	12 孔，无热原，无细胞毒性，无菌
细胞培养箱	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
离心机	Eppendorf		型 5415R
离心机	Eppendorf		型 5428
离心管	Bionovo	B-2278	Eppendorf 型，1.5 mL
离心管	Bionovo	B-3693	Falcon 型，50 mL，PP
色谱数据采集和分析软件	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation （B.04.03-S92）
色谱插入样品瓶	Agilent Technologies	9301-1387	100 µL
色谱样品瓶	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL，透明玻璃
二甲基亚砜	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco's 改良鹰's 培养基 （DMEM）	PAN Biotech	P04-41450
双测量仪 pH/电导率	梅特勒托利多		SevenMulti
蒸发器	Genevac		型号 EZ-2.3 Elite
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F9665
甲酸	Supelco	5.33002	用于 LC-MS 的 LiChropur
试剂储存	玻璃瓶Bionovo	S-2070	50 mL，透明玻璃
保护柱	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18 窄口径保护柱（2.1 x 12.5 mm，5 &微量;m）
盐酸	Merck	1.00317.1000
L-犬尿氨酸	Sigma-Aldrich	K8625	≥98% （HPLC）
磁力搅拌器	Wigo		ES 21 H
微量天平	梅特勒-托利多		XP6 型
Milli-Q 系统	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV 带泵
四极杆质谱仪	Agilent Technologies	G1948B	6120
型青霉素-链霉素	Sigma-Adrich	048M4874V
酶标仪	Bio Tek		Synergy 2 由 Gen5作
氯化钾	Merck	1.04936.1000
磷酸二氢钾	Merck	1.05108.0500
蛋白质测定染料试剂浓缩	BioRad	500-0006
跷跷板摇杆	Stuart	SSL4
血清移液器	巢	326001	5 mL，聚苯乙烯，无热原，无菌
氯化钠	Sigma-Aldrich	7647-14-5
磷酸氢二钠	Merck	1.06346.1000
溶剂入口过滤器	Agilent Technologies	5041-2168	玻璃过滤器，20 μ;m 孔径
溶剂储液槽（用于 LC-MS）	Agilent Technologies	9301-6524	1 L，透明玻璃
溶剂储液槽（用于 LC-MS）	Agilent Technologies	9301-6526	1 L，琥珀色玻璃
电子表格程序	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
搅拌棒	Bionovo	6-2003	特氟龙涂层
培养的针头过滤器中等过滤	Bionovo	7-8803	再生纤维素，Ø 30 毫米，0,45 µm
用于流动相组分过滤的针头式过滤器	Bionovo	6-0018	尼龙，Ø 30 mm，0,22 µm
组织培养板	VWR	10062-900	96 孔，无菌
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
超高效液相色谱系统	Agilent Technologies	G1367D、G1379B、G1312B、G1316C	1200 Infinity 系统由自动进样器 （G1367D）、脱气机 （G1379B）、二元泵 （G1312B）、柱恒温器 （G1316C） 组成
超声浴	Polsonic	104533	型 6D
涡旋	Biosan		型 V-1 加
黄藤酸	Sigma-Aldrich	D120804	96%