利用液相色谱-质谱法同时定量分析癌细胞培养液中选定的犬尿氨酸类物质

摘要

本文介绍了一种检测癌细胞培养上清液中犬尿氨酸通路产生的四种不同色氨酸代谢物（犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、黄尿酸、3-羟基邻氨基苯甲酸）的实验方案，该方法采用液相色谱串联单四极杆质谱法进行分析。

摘要

犬尿氨酸通路及其代谢产物犬尿氨酸类物质因参与免疫调节和癌症生物学过程而受到越来越多关注。 体外 细胞培养实验常用于研究不同色氨酸代谢物在疾病机制中的作用，并用于测试治疗策略。富含分泌性代谢物和信号分子的细胞培养基可反映色氨酸代谢及其他细胞活动的状态。目前亟需建立新的可靠方法，以实现对复杂细胞培养基中多种犬尿氨酸类物质进行准确定量，从而能够快速、可靠地分析大量样本。该目标可通过液相色谱-质谱联用技术实现。这一强大技术已被广泛应用于临床和科研实验室中的代谢物定量，亦可用于犬尿氨酸类物质的检测。

本文介绍了采用液相色谱串联单四极杆质谱法（LC-SQ）同时测定体外培养癌细胞收集培养基中四种犬尿氨酸代谢物的方法，这四种代谢物分别为犬尿氨酸、3-羟基犬尿氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸和黄尿酸。in vitro 培养的癌细胞。与其它质谱仪相比，单四极杆检测器操作简便且成本较低。在单四极杆质谱分析中，样品产生多个离子，并根据其特定的质荷比（m/z）进行分离，随后采用单离子监测（SIM）模式进行检测。

本文重点阐述了所报道方法的优势并指出了某些不足之处，聚焦于液相色谱-串联质谱（LC-SQ）分析中的关键要素，包括样品制备、色谱分离及质谱分析过程。同时讨论了质量控制、方法校准条件以及基质效应等问题。我们描述了一种简便的应用方式，即使用3-硝基酪氨酸作为所有目标分析物的单一类似物标准品。通过人卵巢癌和乳腺癌细胞的实验验证，所提出的LC-SQ方法 生成可靠的结果，并可进一步应用于其他 体外 细胞模型

引言

犬尿氨酸通路（KP）是人体细胞中色氨酸（Trp）分解代谢的主要途径。肝外细胞中的吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO-1）是KP的第一步限速酶，可将Trp转化为N-甲酰犬尿氨酸¹在犬尿氨酸途径（KP）内的后续步骤中生成其他次级代谢产物，即具有多种生物学特性的犬尿氨酸类物质。犬尿氨酸（Kyn）是色氨酸（Trp）分解代谢产生的首个具有毒性的稳定代谢物，可通过与芳烃受体（AhR）结合来调控细胞事件。²随后，Kyn 通过非酶促自发反应或酶催化过程转化为多种分子，生成如 3-羟基犬尿氨酸（3HKyn）、邻氨基苯甲酸（AA）、3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）、犬尿喹啉酸（Kyna）和黄尿酸（XA）等代谢产物。另一下游代谢物 2-氨基-3-羧基-6-醛基甲酰基戊二酸（ACMS）可发生非酶促环化反应，生成喹啉酸（QA）或吡啶甲酸（PA）。¹最后，QA 进一步转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）⁺)³，KP 通路的终末代谢物，是一种重要的酶辅因子。某些犬尿氨酸类物质具有神经保护作用，如 Kyna 和 PA，而其他物质，如 3HAA 和 3HKyn，则具有毒性⁴黄尿酸由3-羟基犬尿氨酸（3HKyn）生成，具有抗氧化和血管舒张特性⁵. XA 在老化晶....

方案

1. 3NT、Kyn、3HKyn、3HAA、XA 标准品储备溶液的制备

1. 用精度最高的天平（每种试剂精确至0.3 mg）称取试剂。为获得更高准确性，可按比例放大试剂用量，并根据步骤1.2调整溶剂体积。
2. 将试剂溶解于300 µL溶剂中，配制成1 g/L的储备液。其中，3NT溶于含1%（v/v）甲酸（FA）的水溶液；Kyn、3HAA和XA溶于二甲基亚砜（DMSO）；3HKyn溶于用盐酸（HCl）调节pH至2.5的酸化水中。
   警告：3HAA对眼睛、鼻腔、咽喉和肺部具有刺激性，吸入、皮肤接触或吞咽后有害。操作时应佩戴适当的防护装备，如手套和口罩。
3. 将小瓶盖紧后置于超声水浴中1分钟，以加速溶解。
   注意：储备液应储存于-20 °C，避免反复冻融（最多不超过3次），因储备液稳定性较差。

2. 活性炭处理培养基的制备

1. 在离心管中称取280 mg活性炭，并加入5 mL为培养目标细胞而配制的液体培养基。
2. 将含有培养基和活性炭的离心管置于往复摇床中，室温下振荡2小时（设定速度为50次/分钟）。随后，在6000 × g 条件下离心15分钟。 
3. 从离心机中取出离心管，小心吸取上清液，避免扰动沉淀物。如有必要，可重复离心，以彻底去除活性炭残留。
4. 使用0.45 µm注射器滤器过滤上清液。

结果

液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）在生物活性分子的定量分析中具有无可争议的优势，尽管复杂样品中的某些组分会引起所谓的基质效应，从而干扰分析物的离子化过程。这会导致离子抑制或离子增强现象，显著降低检测的准确性，并影响LC-MS的检出限/定量限，这一问题被认为是该方法的“薄弱环节”。在本实验方案中，离子通过电喷雾离子化（ESI）在正离子模式下生成，该模式也已被用于其他色氨酸（Trp）代谢物测定的研究中¹³。然而，与大气压化学电离（APCI）相比，ESI更容易受到基质效应的影响²⁸。因此，为了准确测定细胞培养基中的Trp代谢物，我们采用了内标法和基质匹配校准法，以补偿基质对分析物信号的影响，并校正样品前处理过程中目标化合物的损失。我们对所有被研究的分析物（3HKyn、Kyn、3HAA、XA）均使用同一种内标物（3NT）。3NT在用于细胞培养的原始新鲜培养基中未被检出，且在所采用的分析条件下表现出与目标化合物相似的行为，这使其成为合适的内标物²⁷。此外，为了简化操作流程，使其更易于被广大用户所采用，我.......

讨论

本文介绍了一种详细的液相色谱-串联质谱（LC-SQ）方法，用于同时定量测定培养基中四种主要的色氨酸代谢物（3HKyn、Kyn、3HAA、XA） 体外 培养的人类癌细胞。分析过程中特别关注样品制备、色谱/质谱操作步骤以及数据解读，这些是整个分析中最关键的环节。

通常，由于液相色谱-质谱（LC-MS）分析具有高灵敏度，因此要求实验方案必须严格规范，并确保所用材料的高纯度。这包括在整个标准操作流程中使用经过彻底清洁和正确清洗的玻璃器皿，以及高纯度的化学试剂。使用新鲜配制的水相流动相溶剂至关重要，以避免微生物污染，此类污染在该高灵敏度检测方法中可能严重影响分析结果。在将样品注入液相色谱系统之前，必须仔细检查样品中是否存在任何不溶性颗粒。需要注意的是，在进行样品分析前，色谱柱必须充分平衡。若未遵守上述规定，可能导致样品、液相色谱系统或分析柱受到污染，或导致质谱离子源中样品离子化不充分，最终引起信号偏移。

为了获得最佳结果，本方案中有两个关键点需要特别强调。其中最关键的步骤是样品制备。采用不适当的处理方法会导致目标化合物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-羟基-DL-犬尿氨酸	Sigma-Aldrich	H1771
3-羟基邻氨基苯甲酸	Sigma-Aldrich	148776	97%
3-硝基-L-酪氨酸	Sigma-Aldrich	N7389
乙腈	Supelco	1.00029	LC-MS用超纯级LiChrosolv
活性炭	Supelco	05105	粉末
分析天平	Ohaus
分析柱	Agilent Technologies	959764-902	Zorbax Eclipse Plus C18快速分离HT（2.1 × 100 mm，1.8 µm）
甲酸铵	Supelco	7022	LC-MS流动相添加剂，LiChropur，≥99.0%
牛血清白蛋白	Sigma	1001887398
色谱小瓶瓶盖	Agilent Technologies	5185-5820	蓝色螺旋盖，PTFE/红色硅胶隔垫
细胞培养皿	Nest	704004	聚苯乙烯，无热原，无菌
细胞培养板	Biologix	07-6012	12孔，无热原，无细胞毒性，无菌
细胞培养箱	Thermo Fisher Scientific		HERAcell 150i Cu
离心机	Eppendorf		型号 5415R
离心机	Eppendorf		型号 5428
离心管	Bionovo	B-2278	Eppendorf型，1.5 mL
离心管	Bionovo	B-3693	Falcon型，50 mL，聚丙烯材质
色谱数据采集与分析软件	Agilent Technologies		LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)
色谱插入式小瓶	Agilent Technologies	9301-1387	100 µL
色谱小瓶	Agilent Technologies	5182-0714	2 mL，透明玻璃
二甲基亚砜	Supelco	1.02950	Uvasol
Dubelcco’s改良Eagle’s培养基（DMEM）	PAN Biotech	P04-41450
双通道pH/电导率仪	Mettler Toledo		SevenMulti
浓缩仪	Genevac		型号 EZ-2.3 Elite
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F9665
甲酸	Supelco	5.33002	LC-MS用LiChropur
试剂储存玻璃瓶	Bionovo	S-2070	50 mL，透明玻璃
保护柱	Agilent Technologies	959757-902	Zorbax Eclipse Plus-C18窄径保护柱（2.1 × 12.5 mm，5 µm）
盐酸	Merck	1.00317.1000
L-犬尿氨酸	Sigma-Aldrich	K8625	≥98%（HPLC）
磁力搅拌器	Wigo		ES 21 H
微量天平	Mettler Toledo		型号 XP6
Milli-Q纯水系统	Millipore	ZRQSVPO30	Direct-Q 3 UV带泵系统
四极杆质谱仪	Agilent Technologies	G1948B	型号 6120
青霉素-链霉素	Sigma-Adrich	048M4874V
酶标仪	Bio Tek		Synergy 2，由Gen5软件控制
氯化钾	Merck	1.04936.1000
磷酸二氢钾	Merck	1.05108.0500
蛋白检测试剂浓缩液	BioRad	500-0006
往复式摇床	Stuart	SSL4
移液管	Nest	326001	5 mL，聚苯乙烯，无热原，无菌
氯化钠	Sigma-Aldrich	7647-14-5
磷酸氢二钠	Merck	1.06346.1000
溶剂入口过滤器	Agilent Technologies	5041-2168	玻璃滤器，孔径20 μm
溶剂储液瓶（用于LC-MS）	Agilent Technologies	9301-6524	1 L，透明玻璃
溶剂储液瓶（用于LC-MS）	Agilent Technologies	9301-6526	1 L，棕色玻璃
电子表格软件	Microsoft Office		Microsoft Office Excel
搅拌子	Bionovo	6-2003	聚四氟乙烯涂层
用于培养基过滤的注射器滤器	Bionovo	7-8803	再生纤维素，Ø 30 mm，0.45 µm
用于流动相组分过滤的注射器滤器	Bionovo	6-0018	尼龙，Ø 30 mm，0.22 µm
组织培养板	VWR	10062-900	96孔，无菌
胰蛋白酶-EDTA溶液	Sigma-Aldrih	T4049-100 mL
超高效液相色谱系统	Agilent Technologies	G1367D, G1379B, G1312B, G1316C	1200 Infinity系统，包含自动进样器（G1367D）、脱气装置（G1379B）、二元泵（G1312B）、柱温箱（G1316C）
超声波清洗机	Polsonic	104533	型号 6D
涡旋振荡器	Biosan		型号 V-1 plus
黄尿酸	Sigma-Aldrich	D120804	96%