植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

摘要

本方案详细描述了用于阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶免疫定位的植物材料如何进行固定、包埋于亲水性丙烯酸树脂中、切片并载于玻片上。我们将展示如何利用特异性抗体检测细胞壁相关的表位。

摘要

植物发育过程中，细胞壁的成分和结构会不断调整，以响应内部和外部刺激。细胞壁由纤维素、非纤维素多糖、蛋白质、酚类化合物和水共同组成。细胞壁中90%的成分为 多糖（例如果胶）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）。对植物组织切片中特定聚糖表位进行荧光免疫定位，仍是揭示细胞壁多糖网络、结构及组分重塑过程的关键技术。

本文报道了一种优化的荧光免疫定位方法，用于检测植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶类物质的糖链表位。采用多聚甲醛/戊二醛固定结合LR-White树脂包埋植物样品，可更好地保持组织结构和化学成分。利用超薄切片机对包埋样品进行切片，获得的超薄切片用于特异性抗体的免疫定位。该技术具有高分辨率、高特异性，并可在同一样本中同时检测多种糖链表位。该方法可实现糖链的亚细胞定位，检测其在细胞壁中的积累水平，还可揭示AGP和果胶在发育过程中时空分布的变化规律。该技术的应用有望指导后续研究方向，并将糖链结构与植物特定功能相联系。此外，所获得的信息可与生物化学和基因表达研究结果相互补充。

引言

植物细胞壁是由多糖和糖蛋白组成的复杂结构。细胞壁是高度动态的结构，其构架、组织方式和化学成分会因细胞类型、位置、发育阶段以及内外部刺激的不同而发生显著变化¹。阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶是植物细胞壁的重要组分。AGPs 是高度糖基化的蛋白质，而果胶主要是由同型半乳糖醛酸聚糖组成的多糖，它们的组成、含量和结构在植物不同的发育阶段差异显著^2,3,4。对 AGPs 和果胶的研究表明，它们参与了多种植物生理过程，如程序性细胞死亡、对非生物胁迫的响应、植物有性生殖等众多功能⁵。这些研究中的大部分最初的信息来源于免疫定位研究。

由于细胞壁结构复杂，其研究需要多种不同的工具。利用单克隆抗体（mAbs）检测聚糖表位是解析多糖和糖蛋白在此结构中分布情况的一种有效方法。目前已有大量可用于检测聚糖表位的单克隆抗体，且每种单克隆抗体的特异性仍在持续改进中⁶。本文所述技术适用于所有植物物种，是指导未来研究方向的理想工具，尤其可为可能涉及更昂贵和更复杂技术的研究提供前期依据。

在该技术中，特异性抗体通过化学方法与荧....

方案

1. 样品制备：固定、脱水和LR-White包埋

1. 固定与脱水
   注意：固定过程对于保持样品结构至关重要；通过交联分子可终止细胞代谢，确保细胞完整性并防止分子扩散。所用固定剂及其浓度必须根据此目的进行调整，使抗原充分暴露以便与抗体结合。以下方案结合了多聚甲醛的温和固定能力与戊二醛更强的固定效果。两者的比例已针对阿拉伯木聚糖蛋白（AGPs）和细胞壁组分进行了优化，但也适用于其他蛋白质和细胞结构。后续的脱水步骤将为LR-White包埋做好准备。本实验使用了多种植物物种的植物组织。Quercus suber 样品采自田间生长的树木。Trithuria submersa 样品由英国伦敦邱园（Kew Gardens）的Paula Rudall惠赠。
   1. 将所有拟南芥植株直接播种于土壤中，在室内培养设施中生长，相对湿度为60%，光照/黑暗周期为16小时光照（21 °C）和8小时黑暗（18 °C）。选择待分析的植物组织，并将样品修剪至面积不超过16 mm²。
   2. 立即将样品转移至预先装有足量冷固定液（2% 甲醛（w/v）、2.5% 戊二醛（w/v）、25 mM PIPES 缓冲液 pH 7 和 0.001% Tween-20（v/v））的玻璃小瓶中，确保样品完全浸没（图1A）。
      警告：甲醛和戊二醛均为可能通过....

结果

在成功的实验中，二抗会以明亮的绿色一致地特异性标记特定表位的位置，从而能够表征细胞、组织或器官在某一发育阶段的细胞壁组成。例如，LM6 抗体对 1,5-阿拉伯聚糖具有高亲和力，该化合物属于Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖，可大量标记发育中细胞壁 Quercus suber 花药（图2A），因此可以得出结论：这类果胶含量丰富，是初生细胞壁组成的一部分。JIM5 对通常存在于根尖的低酯化同型半乳糖醛酸聚糖具有亲和性 栓皮栎 胚胎，指定器官的机械特性（图2B）。木糖半乳糖醛酸聚糖是一类富含木糖的果胶，与细胞壁松弛相关，存在于退化细胞中。抗体LM8可特异性识别木糖半乳糖醛酸聚糖，在器官成熟过程中可用于检测退化的细胞或组织，例如种子发育末期的胚乳细胞 栓皮栎 橡果成熟图 2C).

JIM13 对存在于与生殖结构相关的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）以及与小孢子发生相关的细胞.......

讨论

本文所述植物荧光免疫定位方法虽然操作简便，但其成功依赖于多个细微步骤的准确执行。第一步是样品制备与固定。在此步骤中，使用甲醛和戊二醛的混合液对细胞的大部分组分进行交联。溶液中的甲醛提供温和且可逆的固定作用，而戊二醛则形成更强、更持久的交联；两种固定剂之间的平衡可实现适当的交联程度，从而暴露抗原表位，使其能够与一抗发生反应¹⁰。为确保固定液有效发挥作用，样品必须足够小。直径超过7 mm的较大结构很难充分固定，应进行剪切以确保固定液充分渗透。

受伤或受到胁迫后，某些植物会分泌大量单宁，形成深色沉淀物，这些沉淀物可能与甲醛发生反应，干扰固定过程。将样品置于冰上，并在固定液变浑浊时及时更换，有助于减轻这一现象。空气也可能干扰固定过程，并在后续的树脂包埋和硬化过程中产生影响。建议采用真空处理以去除大部分空气。对于特别多气的组织，可将真空处理时间延长至2小时以上，直至不再有气泡从样品中逸出且样品沉入底部。若在过夜固定后仍有样品漂浮，则应予以弃用。树脂包埋可为切片提供必要的支撑，其硬度应与所包埋的组织相近¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% (w/v) 戊二醛	Agar Scientific	AGR1010	水溶液，无甲醇
8孔玻璃反应载片	Marinfeld	MARI1216750	可使用其他品牌
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
抗大鼠IgG（全分子）-FITC抗体，山羊来源	Sigma-Aldrich	F6258
盖玻片，24 mm × 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	盖玻片应覆盖所有孔。可使用其他品牌
ddH2O	na	na
无水乙醇	na	na
荧光增白剂28	Sigma-Aldrich	F-6259
明胶胶囊	Agar scientific	AGG29211	胶囊尺寸应与样品大小相匹配。
玻璃小瓶	na	na	可使用任何简单且价格低廉、可密封的玻璃小瓶。使用后可用96%乙醇清洗以去除LR-White残留物，并可重复使用。
LR-White中等硬度包埋树脂	Agar Scientific	AGR1281	LR-White有多种类型；中等硬度适用于大多数组织，而对于较硬的组织，建议使用更硬级别的LR-White。如有可能，请使用已预先混合聚合活化剂（过氧化苯甲酰）的树脂；否则请按照供应商说明配制树脂。
脱脂奶粉	Nestlé	na	任何脱脂奶粉均可
烘箱	na	na	通用实验室烘箱
培养皿，10 cm × 10 cm 方形	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
大鼠来源的单克隆抗体	Plant probes	na	识别细胞壁组分的多种抗体 可在复杂碳水化合物研究中心 （CCRC，美国佐治亚大学）和Plant Probes（英国利兹大学Paul Knox细胞壁实验室）获得。常用单克隆抗体及其购买信息见补充表1 的简要列表 如补充表1所示
剃须刀片	na	na	普通剃须刀片
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
甲苯胺蓝-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
超薄切片机	Leica Microsystems	UC7
配有紫外光和FITC荧光滤光片的正置落射荧光显微镜	Leica Mycrosistems	DMLb
真空室	na	na
真空泵	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	可使用其他抗淬灭剂。请务必检查其与FITC及荧光增白剂28的兼容性。（注：对于非商业替代方案，参见Jonhson等198218），可通过将25 mg/mL的1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于甘油与1×PBS按9:1（v/v）比例混合的溶液中制备抗淬灭介质，并用稀盐酸调节pH至8.6。）