植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

摘要

本方案详细描述了用于阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶免疫定位的植物材料如何进行固定、包埋于亲水性丙烯酸树脂中、切片并载于玻片上。我们将展示如何利用特异性抗体检测细胞壁相关的表位。

摘要

植物发育过程中，细胞壁的成分和结构会不断调整，以响应内部和外部刺激。细胞壁由纤维素、非纤维素多糖、蛋白质、酚类化合物和水共同组成。细胞壁中90%的成分为 多糖（例如果胶）和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）。对植物组织切片中特定聚糖表位进行荧光免疫定位，仍是揭示细胞壁多糖网络、结构及组分重塑过程的关键技术。

本文报道了一种优化的荧光免疫定位方法，用于检测植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶类物质的糖链表位。采用多聚甲醛/戊二醛固定结合LR-White树脂包埋植物样品，可更好地保持组织结构和化学成分。利用超薄切片机对包埋样品进行切片，获得的超薄切片用于特异性抗体的免疫定位。该技术具有高分辨率、高特异性，并可在同一样本中同时检测多种糖链表位。该方法可实现糖链的亚细胞定位，检测其在细胞壁中的积累水平，还可揭示AGP和果胶在发育过程中时空分布的变化规律。该技术的应用有望指导后续研究方向，并将糖链结构与植物特定功能相联系。此外，所获得的信息可与生物化学和基因表达研究结果相互补充。

引言

植物细胞壁是由多糖和糖蛋白组成的复杂结构。细胞壁是高度动态的结构，其构架、组织方式和化学成分会因细胞类型、位置、发育阶段以及内外部刺激的不同而发生显著变化¹。阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）和果胶是植物细胞壁的重要组分。AGPs 是高度糖基化的蛋白质，而果胶主要是由同型半乳糖醛酸聚糖组成的多糖，它们的组成、含量和结构在植物不同的发育阶段差异显著^2,3,4。对 AGPs 和果胶的研究表明，它们参与了多种植物生理过程，如程序性细胞死亡、对非生物胁迫的响应、植物有性生殖等众多功能⁵。这些研究中的大部分最初的信息来源于免疫定位研究。

由于细胞壁结构复杂，其研究需要多种不同的工具。利用单克隆抗体（mAbs）检测聚糖表位是解析多糖和糖蛋白在此结构中分布情况的一种有效方法。目前已有大量可用于检测聚糖表位的单克隆抗体，且每种单克隆抗体的特异性仍在持续改进中⁶。本文所述技术适用于所有植物物种，是指导未来研究方向的理想工具，尤其可为可能涉及更昂贵和更复杂技术的研究提供前期依据。

在该技术中，特异性抗体通过化学方法与荧光染料（如 FITC（异硫氰酸荧光素）、TRITC（四甲基罗丹明-5-(和6)-异硫氰酸酯）或多种 Alexa Fluor 染料）偶联。免疫荧光具有多项优势，可实现糖类分子清晰且快速的亚细胞定位，能够直接在荧光显微镜下观察。该方法具有高度特异性和灵敏度，因为样品制备过程能有效保护抗原的天然结构，即使抗原含量较低也能检测。它允许在同一份样品中同时检测多种抗原，最重要的是，可获得高质量且视觉效果优异的结果。尽管荧光免疫定位研究功能强大，但由于缺乏详细描述实验各步骤的方案，该技术常被认为难以操作和实施。本文提供了一些简单指南，介绍如何执行该技术并获取高质量图像。

对于本实验方案，样品必须首先使用最合适的固定剂进行固定和包埋。尽管该技术被认为耗时且相对繁琐，但植物样品的适当固定和包埋是确保免疫定位实验成功的关键。通常采用化学固定法，使用交联型固定剂（如醛类）。交联型固定剂可在组织分子之间建立化学键，从而稳定并硬化样品。甲醛和戊二醛属于交联型固定剂，有时会联合使用这两种固定剂⁷。甲醛能够很好地保持组织结构的完整性，且作用时间较长，引起的组织收缩较小，同时适用于免疫染色。戊二醛是一种更强效且稳定的固定剂，通常与甲醛联合使用。然而，使用戊二醛存在一些需注意的缺点：它会在固定后的组织中引入一些游离醛基，可能导致非特异性标记。此外，蛋白质与其他分子之间的交联有时会使某些目标抗原表位无法被抗体识别。为避免此类问题，必须谨慎确定固定剂的用量和固定时间。

固定后，样品需包埋于合适的树脂中，使其在切片前硬化。伦敦树脂（LR-White）丙烯酸树脂是免疫定位研究的首选树脂。与其他树脂不同，LR-White 具有亲水性，可使抗体无需任何预处理即可到达其抗原。此外，LR-White 还具有自发荧光低的优点，有助于在免疫荧光成像过程中降低背景噪声。

目前有多种染色技术可用于检测细胞壁的不同组分，例如阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色或过碘酸-希夫（PAS）染色。然而，这些方法均不具备免疫定位分析所具有的强大能力⁸。该方法在聚糖检测方面具有更高的特异性，能够提供更为丰富的细胞壁组成与结构信息。

方案

1. 样品制备：固定、脱水和LR-White包埋

1. 固定与脱水
   注意：固定过程对于保持样品结构至关重要；通过交联分子可终止细胞代谢，确保细胞完整性并防止分子扩散。所用固定剂及其浓度必须根据此目的进行调整，使抗原充分暴露以便与抗体结合。以下方案结合了多聚甲醛的温和固定能力与戊二醛更强的固定效果。两者的比例已针对阿拉伯木聚糖蛋白（AGPs）和细胞壁组分进行了优化，但也适用于其他蛋白质和细胞结构。后续的脱水步骤将为LR-White包埋做好准备。本实验使用了多种植物物种的植物组织。Quercus suber 样品采自田间生长的树木。Trithuria submersa 样品由英国伦敦邱园（Kew Gardens）的Paula Rudall惠赠。
   1. 将所有拟南芥植株直接播种于土壤中，在室内培养设施中生长，相对湿度为60%，光照/黑暗周期为16小时光照（21 °C）和8小时黑暗（18 °C）。选择待分析的植物组织，并将样品修剪至面积不超过16 mm²。
   2. 立即将样品转移至预先装有足量冷固定液（2% 甲醛（w/v）、2.5% 戊二醛（w/v）、25 mM PIPES 缓冲液 pH 7 和 0.001% Tween-20（v/v））的玻璃小瓶中，确保样品完全浸没（图1A）。
      警告：甲醛和戊二醛均为可能通过吸入和接触造成伤害的固定剂。固定步骤应在通风橱中操作，并穿戴适当的防护服和腈类手套。从本步骤开始的所有溶液（包括酒精系列至70%浓度）均应保存，后续由专业人员进行去污染处理。
   3. 收集完所有样品后，更换新鲜固定液。
   4. 将小瓶转移至真空室，缓慢施加真空。当达到-60 kPa时，漂浮材料将开始下沉至小瓶底部（图1B）。
   5. 在室温下维持不超过-80 kPa的真空状态2小时。
   6. 缓慢释放真空，密封玻璃小瓶，并于4 °C过夜放置。
   7. 弃去在过夜固定过程中未下沉的样品。用25 mM PBS缓冲液（pH 7）洗涤剩余样品10分钟，随后用25 mM PIPES缓冲液（pH 7.2）洗涤20分钟。
   8. 依次使用乙醇系列（25%、35%、50%、70%、80%、90% 和 3次100%乙醇）进行脱水，每次20分钟。脱水完成后立即转移至已标记的玻璃小瓶中，准备包埋（图1C）。
      注意：脱水过程可在70%乙醇步骤暂停。
2. LR-White树脂包埋
   注意：LR-White是一种非疏水性丙烯酸树脂，黏度低，非常适合穿透具有多层厚细胞壁的组织。LR-White还提供多种硬度等级，适用于切割大多数植物样品。请确保所用树脂已预先混合适当催化剂，或按照供应商说明配制树脂。以下包埋过程较慢，但结果值得此投入。
   1. 通过将样品在乙醇中逐步增加树脂浓度（1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0）的方式，用LR-White树脂对样品进行渗透处理，每步在4 °C下孵育24小时。
      警告：LR-White树脂为低毒性丙烯酸树脂，但仍可能因接触或吸入对皮肤产生刺激。强烈建议在通风良好区域或通风橱内操作，并穿戴适当的防护装备和腈类手套。
   2. 更换新鲜LR-White树脂，在4 °C下继续孵育12小时。
   3. 准备合适尺寸的包埋明胶胶囊（尺寸1（0.5 mL）适用于不超过3 mm的样品，2 × 0.37 mL适用于不超过5 mm的样品，3 × 0.3 mL适用于不超过8 mm的样品），以及纸质标签（图1D）。
      注意：选择略大于样品的胶囊尺寸，以确保标本能被树脂完全包裹。同时，请记住使用铅笔标记标签，因为钢笔墨水或打印油墨会污染树脂，导致样品损坏。
   4. 在每个胶囊底部滴加一滴新鲜LR-White树脂。
   5. 将样品放入各明胶胶囊中，并用新鲜树脂填充至最大容量。盖上胶囊盖，轻轻按压形成密封（图1E）。
   6. 在58 °C下聚合24至48小时，或直至树脂完全硬化。
   7. 将样品在室温下保存。
      注意：聚合完成后的LR-White树脂为惰性物质。

2. 载玻片制备

注意：玻璃载玻片必须洁净，无任何灰尘、油脂或其他污染物。即使是新载玻片也必须清洗，因为一些供应商会使用油类或洗涤剂以防止载玻片粘连。任何残留的油脂或洗涤剂都会影响组织切片在载玻片上的附着，即使已使用多聚-L-赖氨酸处理过。棉绒和灰尘会影响样本的观察，极有可能导致实验失败。带有反应孔的特氟龙（Teflon）涂层载玻片非常适合此项工作。这类载玻片价格合理、可重复使用，并能显著减少所需抗体溶液的用量。只要清洗得当，即可以非常低廉的成本完成高质量的荧光免疫定位实验。

1. 载玻片清洗
   1. 将载玻片放入染色架中，并加入清洗液（0.1% SDS (w/v)，1%乙酸 (v/v)，10%乙醇 (v/v)）覆盖。
   2. 轻微振荡处理20分钟。
   3. 将染色架转移至去离子水（ddH₂O）浴中，轻微振荡10分钟，重复4次。
   4. 小心沥干染色架，随后短暂浸入100%乙醇中，然后在无尘环境中让载玻片自然干燥。
   5. 保存备用。
2. 多聚-L-赖氨酸包被（可选）
   注意：小片组织通常能很好地贴附于洁净的玻璃载玻片上。此步骤仅建议用于较大组织片（>2 mm²）。较大的组织片容易折叠和起皱，通常不推荐使用。如有需要，可使用带有较大孔径的反应载玻片。按上述方法清洗后，继续以下操作。
   1. 将洁净的载玻片放入方形培养皿中。用移液器加入0.001%多聚-L-赖氨酸溶液（w/v），使溶液刚好覆盖载玻片上的孔，避免溢出。
   2. 将培养皿盖好，在40 °C下过夜干燥。
      注意：包被后的载玻片可立即使用，也可在室温无尘环境中保存数月。

3. 样品修剪与切片

1. 样品修整
   1. 使用锋利的剃刀刀片，在体视显微镜下将LR-White包埋块修整成一个棱锥形结构，使棱锥的顶点垂直于样品的目标区域（补充图1A）。
      注：超薄切片机的样品夹是固定包埋块的理想工具。如果设备没有通用样品夹，应选用最适合圆形包埋块的夹具。
   2. 沿垂直于棱锥主轴的方向，通过逐次切去多余的树脂细片，进一步修整该棱锥结构。
   3. 持续修整，直至暴露出包含目标样品的切面。理想情况下，切面上的目标样品应被包围在一个梯形区域内。
      注：可使用锋利刀片以狭缝角度进一步修整树脂块，以减小切片表面积（图1F）。
2. 半薄切片
   注：将使用配备玻璃刀的切片机。抗体与抗原表位的结合能力将直接影响免疫标记反应的成功与否。LR-White树脂的亲水特性有助于抗体与样品切片的良好接触。切片越薄，Calcofluor荧光染色越微弱，而该染色可用于辅助定位切片并促进成像过程。此原则同样适用于后续可能施加的其他染色方法。此外，切片过厚也会影响图像采集质量。根据组织特性，切片厚度宜在200至700 nm之间选择一个合适的折中值。将包埋块牢固地安装在超薄切片机的样品夹上。
   1. 使用超薄切片机，制备厚度在200至700 nm之间的切片（图1G）。
   2. 通过将部分切片转移至载玻片上的ddH₂O液滴中来检查切片区域。将载玻片置于50 °C加热板上，待水分蒸发后，滴加一滴1%甲苯胺蓝O（w/v）溶于1%硼酸溶液（w/v）中，染色30秒。冲洗后在显微镜下观察。
   3. 找到目标结构后，将一至两个切片转移至洁净反应载片各孔中预先放置的ddH₂O液滴中。
   4. 将每张载片放入一个洁净、密闭的10 cm方形培养皿中，在50 °C下干燥。
   5. 将载片存放在洁净的归档盒中，直至使用。

4. 免疫定位

注意：荧光免疫定位实验依赖于两种抗体的依次使用。其中，一抗针对特定的目标抗原制备；二抗则专门针对一抗制备，并在荧光技术中与荧光素（本实验方案中为 FITC）偶联。一抗用于检测样品中的目标抗原，而二抗则用于标记在洗去未结合的一抗后，一抗与样品结合的位置。对照实验是本检测的重要组成部分，必须始终进行，以确保观察结果的准确性。应在载玻片上预留一个孔作为阴性对照，该孔跳过一抗处理步骤，因此在实验结束时不应观察到任何信号。实验中还必须包含阳性对照，即使用一种已知且能够明确标记的抗体处理其中一个孔。阳性对照用于验证二抗的标记效果及反应条件是否有效，而阴性对照则用于检测二抗的特异性。

1. 准备一个孵育室：在移液器吸头盒底部放置一些湿润的纸巾，并用锡箔纸包裹（补充图1B-1E）。将载玻片放入孵育室中。
2. 每8 mm孔加入50 μL封闭液（含5%脱脂奶粉（w/v）的1 M PBS），滴加后孵育10分钟。移除封闭液，并用PBS洗涤所有孔两次，每次10分钟。
3. 配制一抗溶液（参见补充表1），按1:5（v/v）比例将抗体加入封闭液中；每8 mm孔约需40 μL。
   注意：抗体浓度需根据生产商提供的操作说明进行调整。
4. 用ddH₂O进行最后一次洗涤，持续5分钟，切勿让孔完全干燥。
5. 将一抗溶液加入反应孔中，向对照孔中加入封闭液。
6. 盖好孵育室，室温孵育2小时，随后在4 °C下过夜孵育。同时配制二抗溶液，按1%（v/v）比例加入封闭液中，每孔约40 μL。用锡箔纸覆盖避光保存。
7. 所有孔用PBS洗涤两次，每次10分钟，再用ddH₂O额外洗涤10分钟。确保孔内无残留封闭液或沉淀物。
8. 向所有孔中加入二抗溶液。此后所有操作均需避光处理。
9. 在黑暗条件下室温孵育3–4小时。
10. 所有孔用PBS洗涤两次，每次10分钟，随后再用ddH₂O洗涤10分钟。
11. 向每个孔中加入一滴Calcofluor（PBS中含荧光增白剂28，1:10,000（w/v））。无需洗涤，直接向每个孔中加入一滴封片剂（参见材料表），并加盖盖玻片（图1H）。
12. 使用配备10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95和100x/1.40物镜的荧光显微镜观察，分别采用UV滤光片（用于Calcofluor染色）和FITC滤光片检测细胞壁和免疫定位（图1I）。激发/发射波长（nm）分别为：UV 358/461，FITC 485/530。
13. 为更清晰地展示结果，可使用ImageJ或类似软件将两幅图像叠加。

结果

在成功的实验中，二抗会以明亮的绿色一致地特异性标记特定表位的位置，从而能够表征细胞、组织或器官在某一发育阶段的细胞壁组成。例如，LM6 抗体对 1,5-阿拉伯聚糖具有高亲和力，该化合物属于Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖，可大量标记发育中细胞壁 Quercus suber 花药（图2A），因此可以得出结论：这类果胶含量丰富，是初生细胞壁组成的一部分。JIM5 对通常存在于根尖的低酯化同型半乳糖醛酸聚糖具有亲和性 栓皮栎 胚胎，指定器官的机械特性（图2B）。木糖半乳糖醛酸聚糖是一类富含木糖的果胶，与细胞壁松弛相关，存在于退化细胞中。抗体LM8可特异性识别木糖半乳糖醛酸聚糖，在器官成熟过程中可用于检测退化的细胞或组织，例如种子发育末期的胚乳细胞 栓皮栎 橡果成熟图 2C).

JIM13 对存在于与生殖结构相关的阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）以及与小孢子发生相关的细胞...

讨论

本文所述植物荧光免疫定位方法虽然操作简便，但其成功依赖于多个细微步骤的准确执行。第一步是样品制备与固定。在此步骤中，使用甲醛和戊二醛的混合液对细胞的大部分组分进行交联。溶液中的甲醛提供温和且可逆的固定作用，而戊二醛则形成更强、更持久的交联；两种固定剂之间的平衡可实现适当的交联程度，从而暴露抗原表位，使其能够与一抗发生反应¹⁰。为确保固定液有效发挥作用，样品必须足够小。直径超过7 mm的较大结构很难充分固定，应进行剪切以确保固定液充分渗透。

受伤或受到胁迫后，某些植物会分泌大量单宁，形成深色沉淀物，这些沉淀物可能与甲醛发生反应，干扰固定过程。将样品置于冰上，并在固定液变浑浊时及时更换，有助于减轻这一现象。空气也可能干扰固定过程，并在后续的树脂包埋和硬化过程中产生影响。建议采用真空处理以去除大部分空气。对于特别多气的组织，可将真空处理时间延长至2小时以上，直至不再有气泡从样品中逸出且样品沉入底部。若在过夜固定后仍有样品漂浮，则应予以弃用。树脂包埋可为切片提供必要的支撑，其硬度应与所包埋的组织相近¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25% (w/v) 戊二醛	Agar Scientific	AGR1010	水溶液，无甲醇
8孔玻璃反应载片	Marinfeld	MARI1216750	可使用其他品牌
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
抗大鼠IgG（全分子）-FITC抗体，山羊来源	Sigma-Aldrich	F6258
盖玻片，24 mm × 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	盖玻片应覆盖所有孔。可使用其他品牌
ddH2O	na	na
无水乙醇	na	na
荧光增白剂28	Sigma-Aldrich	F-6259
明胶胶囊	Agar scientific	AGG29211	胶囊尺寸应与样品大小相匹配。
玻璃小瓶	na	na	可使用任何简单且价格低廉、可密封的玻璃小瓶。使用后可用96%乙醇清洗以去除LR-White残留物，并可重复使用。
LR-White中等硬度包埋树脂	Agar Scientific	AGR1281	LR-White有多种类型；中等硬度适用于大多数组织，而对于较硬的组织，建议使用更硬级别的LR-White。如有可能，请使用已预先混合聚合活化剂（过氧化苯甲酰）的树脂；否则请按照供应商说明配制树脂。
脱脂奶粉	Nestlé	na	任何脱脂奶粉均可
烘箱	na	na	通用实验室烘箱
培养皿，10 cm × 10 cm 方形	na	na
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
大鼠来源的单克隆抗体	Plant probes	na	识别细胞壁组分的多种抗体 可在复杂碳水化合物研究中心 （CCRC，美国佐治亚大学）和Plant Probes（英国利兹大学Paul Knox细胞壁实验室）获得。常用单克隆抗体及其购买信息见补充表1 的简要列表 如补充表1所示
剃须刀片	na	na	普通剃须刀片
SDS	Sigma-Aldrich	L6026
甲苯胺蓝-O	Agar Scientific	AGR1727
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
超薄切片机	Leica Microsystems	UC7
配有紫外光和FITC荧光滤光片的正置落射荧光显微镜	Leica Mycrosistems	DMLb
真空室	na	na
真空泵	na	na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	可使用其他抗淬灭剂。请务必检查其与FITC及荧光增白剂28的兼容性。（注：对于非商业替代方案，参见Jonhson等198218），可通过将25 mg/mL的1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷（DABCO）溶于甘油与1×PBS按9:1（v/v）比例混合的溶液中制备抗淬灭介质，并用稀盐酸调节pH至8.6。）