利用流式细胞术检测和定量发育期斑马鱼中异常的血液形成

摘要

该实验是一种用于定量分析发育中斑马鱼胚胎中造血细胞的简单方法。将解离的斑马鱼血细胞进行流式细胞术分析，从而可在突变体动物及经遗传修饰的个体中检测血液系统缺陷。

摘要

构成脊椎动物成熟血液的多种细胞谱系来源于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的分化。这一过程在生物体的整个生命周期中持续发生，而在胚胎发育期间若相关分子通路受到干扰，则可能导致灾难性的长期后果。由于多种原因，斑马鱼（Danio rerio）已成为研究造血作用的模式生物。斑马鱼胚胎在体外发育，至受精后7天（dpf）时已产生其一生中持续存在的大多数确定型血细胞亚型。目前已开发出多种用于评估造血细胞数量的检测方法，主要依赖于特异性组织学染色、原位杂交技术以及利用血细胞特异性启动子驱动荧光蛋白表达的转基因动物显微观察。然而，大多数染色检测和原位杂交技术无法精确量化存在的血细胞数量，仅能直观显示细胞数量的显著差异。通过使用转基因动物并结合荧光或共聚焦显微镜对个体进行分析虽可实现，但此类检测的定量依赖于人工计数或昂贵的成像软件，二者均可能引入误差。开发其他可用于评估血细胞数量的新方法将更具经济性、更快速，并且甚至可实现自动化，从而大规模快速评估CRISPR介导的基因修饰、吗啉寡核苷酸介导的转录本减少以及影响造血过程的药物化合物所产生的效应。这种新型血细胞定量检测方法通过对整只斑马鱼胚胎进行解离，进而分析其中存在的荧光标记血细胞的含量。这些检测方法应有助于阐明在胚胎发育过程中负责血细胞生成、扩增和调控的分子通路，使研究人员能够进一步发现血液疾病中发生改变的新因子，以及脊椎动物造血进化过程中所必需的关键通路。

引言

血液生成（造血作用）是一种重要的发育过程，最早始于胚胎早期。该过程首先由中胚层直接生成原始红细胞和巨噬细胞，随后逐渐转变为生成造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。这些具有多向分化潜能的干细胞能够产生生物体内所有类型的成熟血细胞。由于具备自我更新能力，该系统通过这些造血干细胞持续得到补充。尽管这一过程在发育早期即已启动，但造血作用会持续整个动物生命周期，以实现将氧气运输至身体远端、在损伤后止血以及抵御感染等功能。在发育过程中，这一复杂系统的形成受到时间和空间上的精确调控，任何血液细胞生成过程中的异常都可能对机体造成灾难性后果，导致贫血、血小板减少症、白细胞减少症以及白血病等疾病。

在造血研究中，一种常用的动物模型是斑马鱼（Danio rerio），因为其血液发育过程与人类相似。事实上，造血过程中涉及的许多基因和分子通路在脊椎动物进化过程中是保守的，这使得我们可以通过研究斑马鱼来了解人类基因的功能。重要的是，斑马鱼胚胎在体外发育，并且在7天内已产生大多数成熟的血细胞类型，从而可在短时间内直接观察造血系统的发育情况。斑马鱼还具有极高的繁殖能力，使研究人员能在较短时间内观察大量样本，这对于获得可重复的实验数据也至关重要。斑马鱼较短的世代周期和体外发育特性，使其在诱变研究^1,2,3,4,5 和药物筛选^6,7,8,9,10 中更易于进行操作和观察。这使得一系列针对人类血液疾病的潜在治疗化合物能够被快速而高效地测试。

重要的是，斑马鱼在遗传操作上也具有优势，其基因组已被测序并完成注释。这种可操作性使得反向遗传学技术得以应用，例如通过吗啉代（MO）介导的基因敲低以及CRISPR介导的基因剔除。斑马鱼也被证实是进行正向遗传筛选的理想模型；许多参与脊椎动物血液形成的必需基因和信号通路正是通过这种方法被发现的。此外，多种观察血细胞的方法也已在斑马鱼中建立。除了传统的组织学染色技术外，还可对血细胞特异性转录本进行原位杂交检测。尤为重要的是，目前已存在大量转基因斑马鱼品系，这些品系可在谱系特异性启动子驱动下表达荧光蛋白，从而实现利用荧光蛋白标记特定血细胞¹¹。这使得研究人员能够对活体生物体内血细胞的发生、扩增和调控过程进行实时动态观察。

总体而言，由于造血系统的保守性、转基因品系的存在及其易于培育、易于观察以及较短的世代周期，斑马鱼已成为一种经济、快速且适应性强的造血研究模型。为了进一步丰富斑马鱼研究人员可用的技术工具，我们开发了本检测方法，以稳健地定量胚胎中的血细胞数量。该方法包括消化转基因动物并对其荧光标记的血细胞进行流式细胞术分析。通过该方法，可快速、可重复地对突变体动物、吗啉代（MO）和CRISPR修饰以及小分子处理对血细胞的影响进行定量分析。这些检测方法操作简便且成本较低，可用于计数血细胞，从而实现对血细胞生成、增殖及长期维持过程的动态观察。

方案

加州州立大学奇科分校的机构动物护理与使用委员会（IACUC）咨询委员会已批准下述所有方法。

注意：建议在受精后24小时（hpf）用1-苯基-2-硫脲（PTU；表1）处理胚胎，以防止色素形成，从而避免对流式细胞术的荧光分辨产生不利影响。以下所列所有步骤均适用于流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）。然而，如果目标是在FACS后培养造血细胞，则在样本处理过程中需遵循无菌操作。无菌条件下漂白和制备胚胎样本的方案此前已有描述¹²。

1. 48 小时受精龄斑马鱼胚胎的去壳处理

1. 将胚胎（至少5个，但不超过200个）置于10 cm的塑料培养皿中，倾斜培养皿使胚胎沉降至底部边缘。
   注意：可通过取下皿盖并将皿盖垫在培养皿的一侧边缘下方，便于倾斜培养皿。
2. 尽可能吸除并弃去E3培养液（表1），加入500 µL去壳蛋白酶溶液（10 mg/mL），室温孵育5分钟。
3. 5分钟后，拿起培养皿（保持所有胚胎位于皿的底部边缘），轻轻敲击培养皿侧面，使胚胎与皿底轻微摩擦，从而完全去除卵壳。
4. 使用挤压瓶加入约20 mL E3培养液以稀释蛋白酶。待胚胎沉降后，通过倾倒法去除E3培养液。
5. 重复步骤1.4三次，以彻底清除去壳蛋白酶的残留。
   注意：每个待分析的独立样品至少需要5个胚胎。本去壳操作每培养皿最多可处理200个胚胎。此阶段可将样品合并处理，后续再根据需要进行分离。 Alternatively，也可使用钟表匠镊子轻轻撕破卵壳以实现手工去壳。当胚胎数量较少时，此方法更具优势。通常斑马鱼胚胎在72 hpf时会自然孵化出壳。然而，严重畸形的胚胎可能无法自行孵化，需在此之后进行去壳处理（手工或化学法均可）。

2. 准备用于解离的胚胎样本

1. 使用 P1000 移液器，将 5−10 个胚胎放入一个 1.5 mL 微量离心管中。
2. 用移液器吸除 E3 培养基并弃去。
   注意：操作时需小心移液，因为在后续步骤中胚胎容易被误弃。
3. 向管中加入 1 mL 含 10 mM 二硫苏糖醇（DTT）的 E3 培养基，以去除包裹斑马鱼胚胎的黏液层^11,12,13,14。将微量离心管水平放置，并于室温孵育 30 分钟。

3. 胚胎解离

1. 用 1 mL 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗胚胎 3 次，以去除 DTT 残留。最后一次清洗后，加入 500 µL 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 DPBS 以及 5 µL 浓度为 5 mg/mL（26 U/mL）的解离蛋白酶。
   注意：可使用其他等渗缓冲液，但必须含有 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，以确保解离酶正常发挥作用。
2. 将样品置于 37 °C、185 rpm 的水平轨道摇床上孵育 60 分钟。使用 P1000 移液器吹打胚胎，直至样品完全解离。
   警告：注意避免过度消化胚胎；样品中应残留少量固体组织，不应完全均一化。过度消化可能导致目标血细胞被破坏，从而影响流式细胞仪检测结果（补充图 1）。
   注意：该方法最适合 48−72 hpf 胚胎。较晚发育阶段的胚胎可能需要更长的解离蛋白酶孵育时间。不同发育阶段的最佳处理时间需通过实验确定。尽管存在更快的胚胎组织解离替代方法，但实验经验表明，本方法虽然耗时 60 分钟，但足够温和且彻底，可高效分离出活体造血细胞。

4. 流式细胞术用解离胚胎的制备

1. 用移液器将5个已解离的胚胎转移至一个5 mL聚苯乙烯圆底管顶部的35 µm细胞筛网帽中。
2. 向含有过滤后细胞的5 mL聚苯乙烯管的筛网帽中加入4 mL不含Ca²⁺或Mg²⁺的磷酸盐缓冲液（PBS），冲洗细胞。
   注意：也可使用其他等渗缓冲溶液，但应不含Ca²⁺或Mg²⁺，以稀释并使解离酶失活。
3. 在4 °C、300 x g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。用移液器吸除并弃去上清液。将细胞重悬于500 µL不含Ca²⁺或Mg²⁺的PBS中。

5. 流式细胞术

1. 轻轻涡旋细胞悬液，并按1:1,000比例加入红色死细胞染料（材料表）。
   注意：红色死细胞染料是一种可穿透细胞膜的染料，可用于排除死细胞和碎片，是区分死细胞的理想染料选择，因为它可被633 nm激光激发，而与用于激发绿色荧光蛋白（GFP）和DsRed等常见荧光染料的488 nm激光不同。因此，死细胞与转基因血细胞之间不会产生光谱重叠。1 mg/mL的碘化丙啶（PI）是红色死细胞染料的一种经济替代品，但务必保留部分仅用PI染色的样本以及仅用目标荧光染料染色的样本，以进行仪器补偿设置。否则，PI与GFP等荧光染料的信号将发生重叠，导致假阳性结果。如果流式细胞仪还配备405 nm激光，其他染料如蓝色死细胞染料也是理想选择。
   注意：分析血细胞时需注意，某些细胞类型在30分钟后会开始吞噬红色死细胞染料。应将细胞避光并置于冰上直至分析，并在加入染料后30分钟内完成流式细胞术检测。
2. 流式细胞术分析
   注意：每台流式细胞仪略有不同，但以下步骤适用于大多数仪器的样本分析准备。对于初次使用流式细胞术的用户，建议咨询熟悉特定设备的专家。以下说明适用于BD FACSAria Fusion流式细胞仪。
   1. 开启细胞仪，让激光预热20分钟。清空废液罐，向鞘液罐中加入适当的溶液（根据流式细胞仪型号而异），并启动流体系统。
      注意：每种流式细胞仪通常都有特定的启动程序，请仔细遵循相应的启动步骤。
   2. 在分析软件中绘制五个图（图1A）。
      1. 第一个散点图以x轴表示前向散射光（FSC），y轴表示侧向散射光（SSC）。将FSC设为线性，SSC设为对数。
         注意：FSC反映细胞大小，SSC反映细胞颗粒度，这有助于区分细胞与碎片。斑马鱼胚胎血液细胞群体的大小和颗粒度分离方式不同于此前报道的成年斑马鱼血细胞¹⁵。相反，它们会与所有其他消化后的胚胎细胞出现在同一群体中。
      2. 将第二个图设为FSC高度（H）对FSC宽度（W），第三个图设为SSC（H）对SSC（W）。
         注意：此步骤用于排除双联体（即细胞在通过激光时粘连在一起的情况）。
      3. 第四个散点图以x轴表示红色死细胞染料信号（根据仪器不同，通常对应于别藻蓝蛋白[APC]所用滤光片），y轴表示SSC。这可用于区分活细胞与死细胞。
         注意：每台细胞仪的滤光片组可能不同，请确保使用正确的检测滤光片来识别死细胞染料。
      4. 第五个图用于检测所选荧光染料。可将其显示为该荧光染料的直方图（图1），或使用散点图（补充图2）。
         注意：当在同一动物中检测多个荧光染料时，建议使用散点图同时观察两个参数。如果荧光染料之间可能存在光谱重叠（补充图2），也推荐使用散点图。所有参数均应使用面积（A）设置来计算细胞仪激光脉冲生成曲线下的面积，因为该方法更为准确。
   3. 加载样本，并降低流速，防止样本迅速耗尽。调节FSC和SSC设置，使主要细胞群清晰可见（图1A）。
   4. 在细胞群周围绘制门控并标记为“细胞”。确保第二个散点图基于“细胞”门控，先对FSC单细胞进行门控，再对SSC单细胞进行门控，以排除双联体。
   5. 在第四个图中调整红色死细胞染料的设置，使阴性群体清晰可辨。在这些细胞周围绘制门控，并标记为“活细胞”。在第五个图中，对“活细胞”进行门控，观察荧光染料阴性和阳性细胞，并在阳性细胞周围绘制门控。
      注意：这种层级门控策略用于分析位于“活细胞”门控内、且同时位于“细胞”门控内的单荧光染料₊细胞。请仔细设置门控，这些门控可根据实验需求进行自定义。
   6. 运行每个样本，至少收集25,000个活细胞事件。
   7. 按照关机程序关闭流体系统。补充鞘液罐并清空废液罐。
      注意：当蛋白表达水平较低或目标细胞群体稀少时，荧光染料⁺细胞往往难以观察。为确保参数设置正确，应同时制备荧光染料^-的同胞胚胎，以便正确绘制门控并调整激光电压（补充图2）。若目标细胞群体稀少，应收集超过25,000个事件。通过5−10个消化后的个体，通常可收集到数百万个事件。还可通过这些数据获得荧光染料⁺ 细胞的总数：只需用血细胞计数板计数样本中的总细胞数，再乘以荧光染料⁺ 细胞的百分比，即可得到每条鱼中荧光染料⁺细胞的绝对数量。

结果

为了计数胚胎斑马鱼中的红细胞，lcr:GFP¹⁶ 胚胎在单细胞期分别注射 PBS、7.0 ng/nL ism1 MO 或 7.0 ng/nL ism1 MO 加 7.0 ng ism1 mRNA¹²。在 48 hpf 时，收集胚胎并进行流式细胞术分析。分析每个样本中 GFP⁺ 红细胞所占百分比（每个样本包含 5 个随机选择的胚胎；图 1A），计算所有对照组样本的平均值，并将该平均值设为 1，其余各组的百分比均以此为参照进行计算。这些数据表明，使用特异性吗啉代寡核苷酸（MO）降低 ism1 转录本水平，会减少 48 hpf 胚胎中 GFP⁺ 红细胞的数量。此外，通过外源性 mRNA 补救 ism1 表达水平的下降，可使红细胞数量恢复至正常...

讨论

斑马鱼是研究脊椎动物原始和定型造血过程的优良模型系统。在过去的几十年中，研究人员开发并优化了多种检测方法，使斑马游戏副本成为筛选药物、构建和分析基因突变体的快速且经济的模型，从而全面研究造血过程中关键的分子通路。本实验方案采用斑马鱼胚胎，可实现快速数据采集，所需饲养空间小于成体动物，且在大规模化学筛选中所需药物用量更少。此外，该模型可用于分析mRNA过表达后的定量结果、CRISPR基因编辑突变体的构建，以及通过吗啉环寡核苷酸（MO）诱导的转录本减少，从而调控早期胚胎发育过程中的特定遗传通路。尤为重要的是，该方法能够实现对血细胞的灵敏且稳健的定量分析，而原位杂交或组织学染色技术则难以达到这一效果。

该实验具有灵活性，可经修改以回答多种研究问题。一种可能的方案修改是通过操控动物的发育阶段，以定量不同类型的血细胞。例如，红细胞在斑马鱼发育早期即出现，利用如lcr:GFP¹⁶转基因品系的转基因动物，最早可在16体节期检测到红细胞。然而，若研究者希望研究血栓细胞，则可使用itga2b:GFP

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml MCF 管	FisherBrand	05-408-129
10 mm 聚苯乙烯易握培养皿	Corning Falcon	351008
5 ml 聚苯乙烯圆底管，带细胞筛网帽	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Fusion 流式细胞仪	BD Biosciences
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	646563
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS (10x)	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
Librease	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	解离蛋白酶
Pronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	去壳蛋白酶
SYTOX Red 死细胞染料	Invitrogen	S34859