本文介绍了一种利用小鼠小脑脑片培养建立脱髓鞘与再髓鞘化离体定量模型的实验方案。该方法在保持组织完整性及中枢神经系统全部细胞类型的条件下，高度模拟了体内模型，同时兼具体外系统在化学、遗传及环境操控方面的优势。
本文内容
摘要
摘要
研究髓鞘形成 体外 和 在体内存在诸多挑战。少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的分化 体外，尽管可扩展， 无法重现轴突髓鞘化过程。少突胶质前体细胞-神经元共培养和少突胶质前体细胞-纤维培养可用于体外髓鞘化研究，但缺乏体内存在的其他细胞类型，例如星形胶质细胞和小胶质细胞。在体内 小鼠模型较难进行化学、环境和遗传操作，且劳动强度大得多。本文描述 一个 离体小鼠小脑切片培养（CSC）定量系统，适用于：1）研究发育性髓鞘形成，2）建立脱髓鞘与再髓鞘化模型，3）开展转化医学研究。从小鼠出生后第0至2天（P0–2）取小脑与后脑的矢状切面进行分离，随后其可自发发生髓鞘形成 离体 培养12天。在此期间，可对脑片进行多种操作，包括添加化合物以检测其对发育性髓鞘形成的影响。此外，还可将组织固定后用于透射电镜观察，以评估髓鞘的超微结构及致密程度。为建立疾病模型，可对小脑脑片培养物（CSC）施加急性缺氧处理以诱导髓鞘发育不良。这些脑片中的脱髓鞘也可通过溶血卵磷脂诱导，从而有助于鉴定促进再髓鞘化的影响因素。除化学和环境干预外，CSC还可来源于转基因小鼠，并可响应由Ad-Cre腺病毒和他莫昔芬诱导的遗传学操作。因此，小脑脑片培养是一种快速、可重复且可定量的髓鞘形成研究模型。
引言
轴突的髓鞘化能够实现动作电位的快速传导，这一机制被称为跳跃式传导1。髓鞘的重要性在脱髓鞘疾病（如多发性硬化症，MS）中尤为突出，此类疾病可导致多种严重的功能障碍，包括视力丧失、认知障碍和瘫痪。目前尚无治愈MS的方法，现有疗法主要通过靶向外周免疫细胞来延缓疾病进展。MS及相关疾病的神经功能障碍被认为主要由髓鞘再生成失败和进行性神经退行性变所驱动。特别是在进展型MS中，可观察到脱髓鞘、萎缩以及轴突丢失2,3。因此，促进髓鞘再生成是一种具有前景的治疗策略 ，该策略可与现有治疗并行实施，并带来额外的治疗获益。
在中枢神经系统（CNS）中，髓鞘化由一种称为少突胶质细胞的特化胶质细胞完成。少突胶质前体细胞（OPCs）通过一系列高度协调的步骤分化为成熟的、具有髓鞘化能力的少突胶质细胞，这些步骤包括形成接触轴突的突起、形态复杂性的增加、髓鞘膜的扩展，以及最终髓鞘的致密化4。因此，少突胶质细胞与神经元之间的相互作用极为密切。神经元与少突胶质细胞之间的双向相互作用对于中枢神经系统的健康与维持也至关重要2。轴突活动在促进髓鞘化过程中发挥作用，而胶质细胞来源的神经营养因子则有助于维持神经元的完整性。胶质细胞之间相互对话在中枢神经系统中的重要性也日益受到重视5,6,7,8。例如，星形胶质细胞分泌的因子可影响OPCs的分化以及白质纤维束的维持。小胶质细胞也在调节OPCs分化以及清除髓鞘碎片方面发挥作用，后者是再髓鞘化过程中的关键步骤。鉴定细胞自主性因子并明确其他中枢神经系统细胞类型在脱髓鞘和再髓鞘过程中的影响，对于开发治疗脱髓鞘和发育性髓鞘异常疾病的方法具有重要价值。
本文介绍了一种利用小鼠小脑切片培养物（CSC）的离体系统，该系统可用于对完整的中枢神经系统（CNS）组织进行操作和定量分析。使用CSC可借助传统上用于体内研究的方法（如免疫染色和电子显微镜技术11,12,13）来测量髓鞘形成，或在溶血卵磷脂诱导脱髓鞘后测量再髓鞘化过程9,10。溶血卵磷脂是一种破坏细胞膜的化学物质，可导致髓鞘和少突胶质细胞迅速丧失。需要注意的一个潜在局限性是，溶血卵磷脂还可能导致损伤区域附近其他细胞类型的减少。然而，与体内实验不同，可通过添加化合物或利用Ad-Cre腺病毒进行遗传修饰，方便地对小脑的矢状切片进行操作。该方法还允许对来自转基因小鼠或经受环境损伤（如缺氧）的小鼠的分离组织进行干预11,12,13,14。因此，CSC模型可用于研究发育过程中的髓鞘形成、疾病建模以及鉴定促进或抑制髓鞘形成的因子，同时整合不同中枢神经系统细胞类型对少突胶质细胞功能的贡献。
方案
所有动物实验均经基因泰克公司机构动物护理和使用委员会授权并批准。
1. 准备受精卵解剖所需的培养基和耗材（约30–45分钟）
- 按照表1中的说明配制并经无菌过滤切片培养基（SCM）和解剖液（DM），于4 °C保存。若需在髓鞘形成检测中测试任何因子，应在使用前将其加入SCM中。
- 将1 mL SCM加入6孔板的每个孔中。
- 使用无菌镊子将组织型培养插入物放入每个孔中，确保膜下无气泡残留。将含培养基的培养板置于37 °C、7.5% CO2的培养箱中预热。
2. 解剖区域的准备（约5–10分钟）
- 所有操作步骤均须在无菌超净工作台内或使用适当的无菌技术于实验台面上进行。用70%乙醇擦拭所有区域。
- 在组织切片机上安装新刀片和硅胶切割台。在切割台下方加入约300 µL无菌水或70%乙醇，以确保其固定到位。
- 使用棉签蘸取70%乙醇轻轻擦拭组织切片机的刀片和切割台。使用组织 切片机前将其晾干。
- 将所有解剖工具喷洒70%乙醇后晾干，再进行解剖操作。
- 准备两个10 cm的培养皿：一个加入15–20 mL DM，另一个加入10 mL SCM。置于冰上保存。在不进行解剖时，所有培养基和培养皿均应保持在冰上。
3. 小脑切片培养的解剖（每只幼鼠约 15–20 分钟）
- 将含有 DM 的培养皿置于解剖显微镜下。
- 使用锋利的剪刀快速剪下出生后第 P0–2 天的小鼠幼崽头部，以实施安乐死。
- 将头部置于解剖显微镜下的含 DM 培养皿中，清除血液。
- 使用精细剪刀，在颅骨基部两侧边缘各剪一次。
- 将头部倒置浸入 DM 中，用 #5/45 镊子用力按压颅骨底部，使未受损的后脑经颅骨开口推出。
- 在解剖显微镜下，使用两把 #11 手术刀切除多余组织。确保小脑仍附着于下方的后脑组织。详细示意图见图 1A。
- 用刮铲将小脑转移至组织 切片机的切片台上，使组织贴附于后脑的吻侧面，后脑的尾侧面朝向操作者。确保脑的正中面与组织 切片机刀片完全平行。
- 使用 P200 移液器移除组织周围的过量培养基，确保组织保持湿润但不漂浮或被液体包围。
- 在解剖显微镜下，将含有 DM 的培养皿更换为含有 SCM 的培养皿。
- 使用组织 切片机将组织切成 350 µm 厚的切片。
注意：需优化刀片速度（例如，约每秒一次切割）和力度，以确保最佳切割条件。在极少数情况下，组织可能卡在刀片上。为尽量减少组织切片的损失，应将拇指置于电源按钮上，以便在需要时迅速关闭组织 切片机。 - 轻轻用移液器吸取 100 µL SCM 至组织下方，使切片漂浮起来。用刮铲在解剖显微镜下将切好的组织转移至含 SCM 的培养皿中。
- 使用棉签蘸取 70% 乙醇，轻轻擦拭组织 切片机的刀片和切片台。
- 使用手术刀（钝边）在解剖显微镜下轻轻分离切片。用手术刀和刮铲将切片转移至含 SCM 的 6 孔板中的膜上。
注意：通常最内侧的切片具有最佳的髓鞘化程度和组织完整性。平均而言，每只小鼠脑可分离出 4–6 片切片。 - 将切片在 37 °C、7.5% CO2 条件下于 SCM 中孵育。
4. 培养与换液（约15–30分钟）
- 每隔一天更换一次SCM。
- 用移液器将1 mL新鲜培养基加入新的6孔板的每个孔中，并在培养箱中预热。使用无菌镊子将膜转移至新板中，确保膜下无气泡。将培养板放回 培养箱中。
5. 标准髓鞘化与再髓鞘化
- 标准髓鞘化方案（图1B）。
- 将第3节中分离的脑片在体外培养0–12天（DIV）。若需检测任何因素对髓鞘化的影响，应在培养时（0 DIV）将其加入培养基中，并在每次换液时补充该因素。
- 在12 DIV时固定（步骤7.1），此时间点髓鞘化尚未完成，已优化用于检测培养基中添加因素对髓鞘化的促进或抑制作用11,12,13。添加100 ng/mL Activin A后得到的代表性阳性结果如图2所示 。
- 再髓鞘化方案（图1C）
- 按照第5.1节所述标准髓鞘化方案进行操作，至14 DIV，此时间点脑片已完全髓鞘化11,12,13，期间不添加额外因素。
- 按表1详述配制溶血卵磷脂储备液（125 mg/mL）。将1 mL含0.5%溶血卵磷脂的SCM加入新的6孔板每孔中，并置于培养箱内预热。
- 将膜转移至含溶血卵磷脂的孔板中，于培养箱内孵育过夜，时间为16–18小时。
- 次日，准备新的孔板并加入新鲜SCM，如需检测某些因素对再髓鞘化的影响，可将其加入培养基中。将孔板置于培养箱内预热。
- 换液时，轻轻敲击孔壁以确保完全去除含溶血卵磷脂的培养基。每次换液时均需重新补充待测因素（见第4节）。
- 在28 DIV时固定脑片（步骤7.1），此时间点再髓鞘化过程尚未完成，已优化用于检测培养基中添加因素对再髓鞘化的促进或抑制作用。添加0.1 µM XAV939后的代表性阳性结果如图3所示。
6. 髓鞘形成和再髓鞘化方案的变体
- 缺氧诱导低髓鞘化方案（图1D）11,13。
注意：本方案为第5.1节所述标准髓鞘化方案的一种变体。- 将脑片接种于不含因子的SCM培养基中。
- 在2–3 DIV期间，将脑片培养板转移至低氧培养箱（2% FiO2）中培养24小时。
- 次日，准备新的培养板并加入新鲜SCM培养基；如需检测某些因子对髓鞘化潜能的影响，可在此时添加相应因子，并将培养板置于培养箱中预热。
- 缺氧培养结束后，更换培养基（见第4节），并将培养物放回标准培养箱（37 °C，7.5% CO2）。每次后续换液时（见第4节），需重新补充所测试的因子。
- 在12 DIV时进行固定（步骤7.1）。
- 基因操作方案（图1E）13
- 按照第3节方法，从转基因小鼠中分离组织用于切片。
- 对于可诱导型转基因小鼠品系，可在1 DIV和3 DIV换液时向SCM培养基中加入他莫昔芬（100 nM，该剂量不会诱导髓鞘形成或少突胶质前体细胞分化）或Ad-Cre腺病毒。
- 在使用他莫昔芬或Ad-Cre腺病毒完成基因操作后，继续按照第4节方法每隔一天更换一次培养基（如需可添加因子）。
注意事项：一只小鼠的所有脑片均可放置于同一张膜上，从而可在解剖后保留组织用于基因型鉴定，因此使用转基因小鼠开展实验较为简便。
7. 组织处理与分析
- 在室温下，将膜轻轻浸入4%多聚甲醛中1小时，以固定切片。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻浸洗，然后将膜浸入PBS中，并置于6孔板中。
注意：此处可暂停实验流程。固定后的切片可在4 °C的PBS中保存长达一个月。若不需保存切片，则在继续下一步前用PBS清洗2次，每次5分钟。 - 使用手术刀将膜从支撑环上小心切下，并在6孔板中继续进行染色操作。染色及后续载玻片封片过程中，务必保持切片朝上（膜面朝下）。
- 在封闭液（含3%热灭活马血清、2%牛血清白蛋白和0.25% Triton-X 100的PBS溶液）中室温封闭1小时。
注意：若抗体染色需要抗原修复（例如CC1/Olig2染色），可在玻璃培养皿中进行。 - 用封口膜包裹6孔板，在4 °C下避光孵育过夜，期间加入用封闭液稀释的一抗。
- 用封闭液清洗3次：1）短暂漂洗，2）15分钟清洗，3）1小时清洗。短暂漂洗时，将小培养皿中加入溶液，用镊子轻轻夹取膜浸入溶液后迅速转移至新鲜溶液中；对于较长时间的清洗（即15分钟和1小时），将膜置于6孔板的溶液中，并放在轻柔摇床上震荡。
- 在避光条件下，于室温下用PBS按1:500比例稀释的二抗孵育2小时。
- 用PBS清洗3次：1）短暂漂洗，2）15分钟清洗，3）1小时清洗。
- 若需进行DAPI染色，则在室温下将膜浸入1:1,000的DAPI溶液中7分钟，随后短暂漂洗，再在PBS中清洗15分钟。
- 用双蒸水漂洗。
- 将膜转移至载玻片上，确保切片朝上（膜面朝下）。
注意：封片后的切片可在4 °C保存。建议在1周内完成共聚焦显微镜成像，以免膜变浑浊而影响成像质量。 - 使用共聚焦显微镜对切片进行成像，并按先前所述方法进行定量分析11,12,13。
结果
采用出生后0至2天（P0-2）小鼠的小脑脑片培养物（图1A）来研究髓鞘形成，并评估在0–12天体外培养（DIV）期间添加各种因子的影响（图1B）。为研究再髓鞘化，将培养至14 DIV的脑片先用溶血卵磷脂进行脱髓鞘处理，随后在含有待测因子的培养体系中再培养14天以促进再髓鞘化（图1C），之后对再髓鞘化程度进行定量分析。此外，通过将脑片培养物置于2% FiO2的低氧培养箱中24小时（从2–3 DIV开始），研究低氧对髓鞘形成的影响（图1D）。最后，利用转基因小鼠来源的脑片培养物研究基因敲除对髓鞘形成的作用。在此系统中，于1 DIV和3 DIV时通过添加他莫昔芬或Ad-Cre腺病毒诱导Cre重组酶活性，并在12 DIV时固定脑片进行分析（图1E）。组织固定后，通过免疫染色（图2、图3）和透射电子显微镜11,12,13对脱髓鞘和再髓鞘化程度进行定量分析。
所示代表性数据（图2、图3）展示了脑片培养中髓鞘形成与再髓鞘化的动态范围。髓鞘化指数通过Caspr（一种旁结区标记物，可间接反映致密髓鞘的存在）与神经丝蛋白H（NFH，用于标记轴突）的比值进行量化。该髓鞘化指数已通过透射电镜及钠离子通道染色验证，可准确反映致密髓鞘的形成12。溶血卵磷脂诱导的脱髓鞘9,10导致Caspr阳性旁结区完全消失（髓鞘化指数 = 0，图3A）及致密髓鞘丧失，而在再髓鞘化过程中上述结构得以恢复11,12。
为了证明髓鞘化的阳性结果，脑片按照图1B的时间线用Activin A进行培养。Activin A作用于少突胶质细胞上的activin受体，促进少突胶质细胞的分化及髓鞘的致密化15。代表性数据表明，在髓鞘化过程中用100 ng/mL Activin A处理脑片，可获得更高的髓鞘化指数（图2A、B）。与此一致，Activin A处理加速了少突胶质前体细胞（OPC）的分化，这通过CC1阳性成熟少突胶质细胞与Olig2+少突胶质细胞谱系细胞的比例量化得到证实11,13（图2C、D）。
Tankyrase 的一种小分子抑制剂 XAV939 已被证明可通过稳定少突胶质细胞中 Axin2 的水平来促进髓鞘形成及再髓鞘化11。在使用溶血卵磷脂处理后，通过髓鞘碱性蛋白（MBP）染色的碎片化以及Caspr阳性旁结节的缺失，在脑片培养中可视化并量化了脱髓鞘现象（图3A）。在再髓鞘化期间（15–28 DIV）使用 0.1 μM XAV939 处理，与溶剂对照组相比，显著提高了髓鞘化指数，该指数通过 Caspr 与 NFH 染色的比值进行量化（图3B、C）。因此，脑片培养模型可用于在完整组织中检测和量化对少突胶质前体细胞分化、髓鞘形成及再髓鞘化的影响。
图1：小脑切片培养的示意图，展示解剖过程中的关键步骤以及不同切片培养方案的时间线。（A）切片培养的制备步骤：从出生后0–2天（P0–2）的小鼠幼崽中取出脑组织，按图示修剪脑组织，使用组织切片机切割成350 µm厚的矢状切片，将切片置于6孔板中的组织培养插入式培养皿上，并在37 °C、7.5% CO2条件下孵育。*表示小脑。（B）髓鞘形成切片培养的时间线。切片培养孵育12天后固定进行分析。（C）再髓鞘化切片培养的时间线。在体外培养第14天（14 DIV）时用溶血卵磷脂（lysolecithin）处理切片16–18小时以诱导完全脱髓鞘，随后让其再髓鞘化至体外培养第28天（28 DIV）后固定进行分析。（D）缺氧损伤后髓鞘形成的时间线。在体外培养第2–3天（2–3 DIV）期间对切片施加24小时急性缺氧损伤，导致髓鞘发育不足。（E）来自基因修饰小鼠的切片培养（CSC）时间线。在体外培养第1天（1 DIV）和第3天（3 DIV）加入他莫昔芬（Tam, 100 nM）或Ad-Cre病毒以诱导基因修饰，并在体外培养第12天（12 DIV）进行分析。时间线示意图改编自先前发表的研究11,13。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：代表性数据表明 Activin A 促进髓鞘形成和少突胶质前体细胞（OPC）分化。（A）经 100 ng/mL Activin A 处理后，髓鞘（MBP）和旁结区（Caspr）增加，通过脑片培养的免疫染色显示。（B）髓鞘化指数的定量分析（Caspr+ 旁结区染色面积与 NFH+ 轴突染色面积的比值）。（C）少突胶质前体细胞分化程度的定量分析（CC1+ 少突胶质细胞与 Olig2+ 少突胶质细胞谱系细胞的比值）。（D）CC1/Olig2 染色的代表性图像。图中数值表示为均值 ± 标准差。****P < 0.0001；非配对 t 检验。比例尺：A = 25 µm，D = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：代表性数据表明XAV939促进髓鞘再生。（A）经溶血卵磷脂处理的脑片培养物中，MBP染色呈碎片化，且缺乏Caspr旁结结构，显示脱髓鞘现象。（B）溶血卵磷脂诱导脱髓鞘后，经0.1 µM XAV939处理的脑片培养物中，免疫荧光染色显示髓鞘再生（MBP）及旁结结构（Caspr）增加。（C）髓鞘化指数定量分析（Caspr阳性旁结区域与NFH阳性轴突区域的比值）。数据以均值±标准差表示。****P < 0.0001；非配对t检验。比例尺 = 25 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 切片培养基（SCM） | |
| 体积 | 试剂 |
| 100 mL | 最低必需培养基（MEM），含 HEPES，无谷氨酰胺 |
| 50 mL | 热灭活马血清 |
| 50 mL | Earle’s 平衡盐溶液 |
| 2 mL | 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） |
| 2 mL | GlutaMAX 补充剂 |
| 2888 μL | 45% 葡萄糖溶液 |
| 1 mL | 两性霉素B（Fungizone） |
| 经 0.22 µm 滤膜无菌过滤后，于 4 °C 冰箱中保存，最多可保存 2 周。 | |
| 解剖用培养基（DM） | |
| 体积 | 试剂 |
| 100 mL | MEM，含 HEPES 和 Earle’s 盐 |
| 1 mL | 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） |
| 经 0.22 µm 滤膜无菌过滤后，于 4 °C 冰箱中保存，最多可保存 2 个月。 | |
| 溶血卵磷脂储备液（125 mg/mL） | |
| 用量 | 试剂 |
| 100 mg | 溶血卵磷脂（Lysolecithin） |
| 0.8 mL | 无菌 PBS |
| 将 100 mg 溶血卵磷脂溶解于 0.8 mL 无菌 PBS 中。将储备液分装为每份 80 µL，于 -20 °C 保存。 | |
| 使用前，取出一份 80 µL 储备液解冻，并溶于 20 mL 预热至 37 °C、7.5% CO2 培养箱中的 SCM 中（终浓度为 0.5% 溶血卵磷脂）。如需要，可涡旋震荡以促进溶血卵磷脂在 SCM 中的溶解。 | |
表1：配制切片培养基（SCM）、解剖液（DM）和溶血磷脂酰胆碱溶液的组分列表及操作步骤。
讨论
本方案描述了一种器官型小脑切片培养模型，该模型在保留体外模型简便性的同时，重现了体内细胞组成的特征。该方案可进一步优化，以构建更贴近人类病理状况的模型。通过添加外周免疫细胞，小脑切片培养（CSC）有望被开发为针对特定疾病的损伤模型，例如力诱导的组织损伤、髓鞘特异性抗体诱导的损伤，或在多发性硬化（MS）中少突胶质细胞的损伤。此外，该方案也可针对从脑部其他区域及脊髓分离的组织进行优化16,17。尽管本方案聚焦于髓鞘形成的组织学定量分析，但CSC为检测多种实验终点提供了便捷的模型系统。这些培养物可用于通过单细胞RNA测序鉴定不同细胞类型，通过电子显微镜评估 轴突与髓鞘的超微结构，并通过延时成像研究 少突胶质前体细胞（OPC）的动力学行为。此外，利用转基因小鼠报告基因品系可无需进行免疫染色18,19。最后，通过使用不同年龄的小鼠幼崽、调整培养时间或切片厚度，可对CSC进行调整，以模拟不同的疾病机制10,17,18,19,20,23。
脑片培养适用于检测和量化影响髓鞘形成及再髓鞘化的各种因素，但在某些情况下对中枢神经系统的代表性有限。CSC来源于出生后0-2天（P 0-2）的脑组织，处于发育早期阶段，与衰老或神经退行性病变的脑组织具有较少相似性。鉴于人们日益认识到髓鞘在阿尔茨海默病21和精神分裂症22等中枢神经系统疾病中的重要性，亟需可用于量化和表征成年或衰老状态下髓鞘形成的模型。已有其他方案报道从较年长的啮齿类动物中分离组织，但这些动物仍处于发育阶段10,18,19,23。此外，小脑中的少突胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）与脊髓及其他脑内白质束中的细胞可能存在内在和外在的差异。相较于基于细胞的体外系统，CSC也不太适合进行大规模的CRISPR或小分子筛选。由于初始组织切片过程，脑内常驻的固有免疫细胞（即小胶质细胞和星形胶质细胞）会被激活，这是该系统的一个重要局限性24。最后，外周免疫细胞在多发性硬化症（MS）的病理过程中发挥重要作用25；而CSC中不含外周细胞，除非外源性添加，因此其并非模拟炎症性中枢神经系统微环境的理想模型。
本方案中的解剖步骤可能是最关键的环节。进行解剖操作时必须极为谨慎，以避免损伤组织及其下方结构。将脑组织在组织切片机上正确对齐 刀片可最大限度减少对组织和细胞的损伤。此外，仔细解剖和分离脑片，并将其转移至培养膜上进行培养，也至关重要。本方案中所述的时间参数已针对所描述的研究进行了优化，但在不同研究中可能需要调整以获得最佳结果。本方案将有助于希望研究发育期髓鞘形成及髓鞘修复的研究人员。
值得注意的是，目前尚无治愈多发性硬化症（MS）的方法。尽管现有疗法在抑制适应性免疫系统方面相当有效，但尚无任何疗法能够阻止疾病的进展。髓鞘再形成失败及其继发的神经退行性变被认为是导致MS进展的基础2。在慢性MS病灶中存在少突胶质前体细胞（OPCs），提示髓鞘修复失败可能是由于OPC分化受阻所致。使用小脑切片培养（CSC）为发现促进髓鞘修复的治疗方法提供了新的途径，这类疗法有望逆转MS的疾病进展并恢复神经功能。髓鞘修复疗法还可促进脊髓损伤患者的恢复，因为在这些患者中，脱髓鞘的神经通路会抑制运动功能26。因此，CSC的重要意义在于其适用于以相对高通量的方式识别影响哺乳动物脱髓鞘和再髓鞘化的因素，相较于体内动物模型更具优势。尽管已有许多研究采用原代OPCs筛选影响分化的化合物，但原代OPCs的获取与分离需要繁琐且连续的免疫筛选步骤27。此外，基于细胞的检测方法无法完全模拟体内多种细胞类型之间的多样性及其相互作用。从小鼠 幼崽制备CSC是一种快速且经济高效的模型，可用于研究髓鞘形成和再髓鞘化过程，且无需昂贵的仪器或耗材。因此，小脑切片培养代表了一种极为宝贵的定量模型，可在体外 重现髓鞘形成过程，并推动药物研发与基础科学研究。
披露
作者为罗氏集团成员公司Genentech, Inc.的雇员。
致谢
作者感谢沈云安、Roxanne Kyauk 和 Chris Bohlen 对本文提出的建设性意见和建议。此外，作者还感谢 Charles ffrench-Constant、Andrew Jarjour、Veronique Miron 和 David Rowitch 在此前已发表的相关方法学早期开发中所做出的贡献11,12,13。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #5/45 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | 解剖工具 |
| 32% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 50-980-495 | 染色固定剂 |
| 45% 葡萄糖溶液 | Sigma | G8769 | 切片培养基成分 |
| 6 孔组织培养板 | Corning | 3516 | 培养用板 |
| Alexa Fluor 羊抗鸡 647 | Thermo Fisher Scientific | A21449 | 二抗染色抗体 |
| Alexa Fluor 羊抗小鼠 647 | Thermo Fisher Scientific | A21236 | 二抗染色抗体 |
| Alexa Fluor 羊抗兔 555 | Thermo Fisher Scientific | A11006 | 二抗染色抗体 |
| Alexa Fluor 羊抗大鼠 488 | Thermo Fisher Scientific | A21428 | 二抗染色抗体 |
| 双刃刀片，PTFE 涂层不锈钢 | Ted Pella | 121-6 | 切片刀片 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A9418 | 封闭液成分 |
| 鸡抗 NFH 抗体 | Encor Biotech | CPCA-NF-H | 染色抗体 |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM780 | 成像用共聚焦显微镜 |
| Corning 250 mL 真空过滤/储存瓶系统，0.22 µm 孔径 | Corning | 431096 | 用于培养基制备 |
| Earle's 平衡盐溶液 | Sigma | E2888 | 切片培养基成分 |
| Feather 外科刀片 | Feather | 2976#11 | 解剖工具 |
| Fungizone | Thermo Fisher Scientific | 15290-18 | 解剖培养基成分 |
| GlutaMAX 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | 切片培养基成分 |
| 热灭活马血清 | Thermo Fisher Scientific | 26050-88 | 切片培养基成分 |
| 溶血卵磷脂 | Sigma | L4129 | |
| 蛋黄来源溶血磷脂酰胆碱 | Sigma | L4129 | 用于诱导脱髓鞘 |
| McIlwain 组织切片机 | Ted Pella | 10180 | 组织切片机 |
| MEM，含 Hepes，不含谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 12360-038 | 切片培养基成分 |
| MEM，含 Hepes 和 Earle's 盐 | Sigma | M7278 | 解剖培养基成分 |
| 金属刮勺 | Fisher Scientific | 470149-442 | 解剖工具 — 使用时将平头端弯成一定角度 |
| Millicell 培养板插件 30 mm 组织型 PTFE 材质 | Fisher | PICM0RG50 | 培养插件 |
| 小鼠抗 CC1 抗体 | Millipore | OP80-100UG | 染色抗体 |
| Noyes 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15012-12 | 解剖工具 |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010023 | 用于稀释固定剂 |
| 青霉素-链霉素 10,000 U/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | 切片培养基成分 |
| 兔抗 Caspr 抗体 | Abcam | ab34151 | 染色抗体 |
| 兔抗 Olig2 抗体 | Millipore | AB9610 | 染色抗体 |
| 大鼠抗 MBP 抗体 | Serotec | MCA409S | 染色抗体 |
| 手术刀柄 #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | 解剖工具 |
| 硅橡胶泡沫片 | MSC Industrial Direct Co | 31939176 | 切割基底 |
| 体视显微镜 | Olympus Life Sciences | SZ61 | 用于解剖的显微镜 |
| 学生用外科剪 | Fine Science Tools | 91401-12 | 解剖工具 |
参考文献
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