子宫内双次电穿孔技术可用于靶向空间和时间上分离的细胞群体。该技术可用于在正常条件下通过荧光蛋白观察这些细胞群体之间的相互作用，也可在功能实验干扰目的基因后进行观察。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
子宫内电穿孔是一种广泛用于研究哺乳动物皮层发生的分子和细胞机制的活体DNA转染技术。该方法利用脑室系统导入目的DNA，并通过一对电极将遗传物质定向导入衬于脑室壁的神经干细胞中。该技术使研究人员能够标记特定细胞和/或操控这些细胞中目的基因的表达。其具有多种应用，包括神经元迁移、谱系追踪和轴突导向等实验。该方法的一个重要特点是具有时间和区域特异性控制能力，可规避与胚胎致死性或缺乏特异性CRE驱动小鼠相关的潜在问题。该技术的另一个重要优势在于，可显著减少建立新小鼠品系所需的时间和经济成本，这在研究不同发育阶段起源于大脑远端区域的细胞类型间相互作用时尤为重要。本文介绍一种双重电穿孔策略，可实现对在空间和时间上分离的细胞群体进行靶向操作。通过该方法，我们可在不同位置用选定的荧光蛋白标记不同亚型的细胞以实现可视化，和/或在适当时间调控这些不同细胞中目的基因的表达。该策略拓展了子宫内电穿孔的应用潜力，为研究通过迁移建立紧密接触的时空分离细胞群体以及通过轴突投射实现的长距离相互作用提供了强大工具，同时降低了时间和经济成本。
引言
大脑皮层是一个非常复杂且高度有序的结构。为了实现这种高度的组织性，皮层投射神经元必须经历一系列复杂的发育过程，包括在特定时间生成、迁移至皮层板中的最终位置，以及建立短程和远程连接1,2。长期以来，研究皮层发生的经典方法依赖于对目的基因构建小鼠的基因敲除或基因敲入模型。然而，这种策略，尤其是条件性基因敲除小鼠的使用，耗时较长且成本高昂，有时还会因基因冗余的存在或缺乏特异性的CRE驱动工具等原因带来其他问题。为应对上述挑战而发展起来的一种方法是子宫内电穿孔技术，该方法目前已被广泛用于研究皮层发育3,4。子宫内电穿孔是一种用于体细胞转基因的技术，可实现对神经干细胞及其子代细胞的体内靶向。该方法可用于通过表达荧光蛋白标记细胞5,6，进行体内基因操作（例如基因功能获得或功能缺失实验）7,8,9，以及体外分离电穿孔后的皮层组织并进行细胞培养8,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本文所述实验程序已获得瓦伦西亚大学动物福利伦理委员会及瓦伦西亚自治区农业、农村发展、气候紧急情况与生态转型部的批准，并遵循国际 国际实验动物科学理事会（ICLAS）已列入西班牙法律《皇家法令 53/2013》以及欧洲议会和理事会《2010/63/EU 指令》中予以审议。
注意：本方案包含两个不同的研究目的：1）第一项研究，称为“策略A”，用于分析同一脑半球内 Cajal-Retzius 细胞（CR细胞）与早期生成的皮层投射神经元之间的相互作用；2）第二项研究，即“策略B”，旨在研究上层胼胝体投射神经元对新皮层对侧的神经支配情况。
1. 术前准备
- DNA制备
- 转化化学感受态或电转感受态 E. coli 将含有目的质粒的DH5α细胞接种于添加适当抗生素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
注意：此处使用的所有质粒均包含驱动荧光报告蛋白表达的鸡β-肌动蛋白通用启动子（CAG）（策略A使用CAG-mCherry和CAG-EGFP，策略B使用CAG-BFP和CAG-nEGFP-2A-mtdTomato）。所有质粒均含有氨苄青霉素抗性基因（AMP）。 - 从每次质粒转化中挑取单个菌落，于细菌培养管中加入2 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基（LB+AMP），在37 °C、剧烈振荡（200 rpm）条件下培养3−4小时，启动预....
- 转化化学感受态或电转感受态 E. coli 将含有目的质粒的DH5α细胞接种于添加适当抗生素的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
起源于远端区域且在不同时间产生的邻近细胞之间的相互作用：Cajal-Retzius细胞（CR细胞）与早期迁移的皮层投射神经元（策略A）
先前研究描述，利用双电穿孔策略，CR细胞与早期皮层投射神经元之间的相互作用对于通过nectin和cadherin黏附分子调控胞体迁移是必需的8。CR细胞起源于大脑皮层边缘区域的神经上皮，并沿切向迁移至皮层最表浅的部分——边缘带17,18,19，而皮层投射神经元则在大脑皮层的增殖区生成，并沿径向迁移进入正在形成的皮层板20。这两类细胞的生成存在时间上的差异：CR细胞在胚胎发育极早期（E10.5）即开始生成21,22，而通过.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在细胞密度较高的区域（如大脑皮层）体内研究细胞间相互作用是一项复杂的任务。传统的研究方法包括使用抗体标记神经突，但由于缺乏针对不同细胞群体的特异性标记物，这些方法并不适用。利用转基因小鼠模型，使特定细胞类型表达荧光蛋白，有助于观察神经元的突起结构，但该方法依赖于此类模型的可获得性。当需要在干扰目标基因后观察两种特定细胞类型之间相互作用的可能差异时，这一任务变得更加复杂，因为这涉及使用其他动物模型（如基因敲除小鼠）。由于经济和时间成本较高，上述种种问题在过去使这类研究变得困难。
新型体外转基因技术（如子宫内电穿孔）的出现，使得设计本方案中所述的实验策略成为可能，从而避免了使用或培育报告基因与基因敲除动物的双重需求，使此类实验更具可行性。本研究发表的结果以及先前已发表的研究8表明，该方案能够：1）成功靶向具有不同时间和空间来源的细胞群体；2）实现细胞间接触的高分辨率可视化；3）有效检测功能实验后细胞接触的差异。
尽管在体电穿孔技术被广泛应用，但该技术需要经过大量训练，才能安全地实施手.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢瓦伦西亚大学动物护理设施的 Cristina Andrés Carbonell 及其成员提供的技术协助。我们还要感谢 Isabel Fariñas 和 Sacramento R. Ferrón 提供试剂并共享设备。I.M.W 由瓦伦西亚教育委员会的青年保障合同（GJIDI/2018/A/221）资助，D.dA.D 由西班牙科学、创新与大学部（MICINN） （FPI-PRE2018-086150）资助。C.Gil-Sanz 持有西班牙科学、创新与大学部（MICINN）授予的 Ramón y Cajal 奖项（RYC-2015-19058）。本研究由 RYC-2015-19058 和 SAF2017-82880-R（MICINN）项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma-Aldrich | A9518-25G | |
| 吸液管 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| 婴儿米泽止血钳（灌注用） | Fine Science Tools (FST) | 13013-14 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | WPI | 1B100-6 | |
| 布托啡诺（BUPREX 0.3 mg/ml） | Rb Pharmaceuticals Limited | 921425 | |
| CAG-BFP 质粒 | 由 U.Müller 实验室惠赠 | ||
| CAG-EGFP 质粒 | 由 U.Müller 实验室惠赠 | ||
| CAG-mCherry 质粒 | 由 U.Müller 实验室惠赠 | ||
| CAG-mtdTomato-2A-nGFP 质粒 | 由 U.Müller 实验室惠赠 | ||
| 共聚焦显微镜 | Olympus | FV10i | |
| 棉签 | BFHCVDF | ||
| 氰基丙烯酸酯胶水 | B. Braun Surgical | 1050044 | |
| 解剖显微镜 | Zeiss | stemi 305 | |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools (FST) | 11254-20 | |
| ECM830 方波电穿孔仪 | BTX | 45-0052 | |
| 电动剃须刀 | Oster | 76998 | |
| 无内毒素 TE 缓冲液 | QIAGEN | 1018499 | |
| 乙醇擦拭巾 | BFHCVDF | ||
| 超精细格拉夫镊 | Fine Science Tools (FST) | 11150-10 | |
| 眼药膏 | Alcon | 682542.6 | |
| 快绿染料 | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools (FST) | 14069-09 | |
| 荧光 LED 光源 | CoolLED | pE-300-W | |
| Genopure 质粒大提试剂盒 | Roche | 3143422001 | |
| 哈尔斯特德-蚊式止血钳（缝合用） | Fine Science Tools (FST) | 91308-12 | |
| 加热垫 | UFESA | AL5514 | |
| 倒置落射荧光显微镜 | Nikon | Eclipse TE2000-S | |
| 碘伏擦拭巾 | Lorsoul | ||
| 异氟烷蒸发器 | Flow-Meter | A15B5001 | |
| 异氟烷 | Karizoo | 586259 | |
| 氯胺酮（Anastemine） | Fatro Ibérica SL | 583889-2 | |
| Kimtech 精密擦拭巾 | Kimberly-Clark | 7252 | |
| LB（Lennox）琼脂培养基 GEN | Labkem | AGLB-00P-500 | |
| LB（Lennox）肉汤培养基 GEN | Labkem | LBBR-00P-500 | |
| 低熔点琼脂糖 | Fisher Scientific | BP165-25 | |
| 美托咪啶（Sedator） | Dechra | 573749.2 | |
| 显微镜盖玻片 | Menel-Gläser | 15747592 | |
| 显微镜载玻片 | Labbox | SLIB-F10-050 | |
| 封片介质 | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| 多孔板（24 孔） | SPL Life Sciences | 32024 | |
| 多孔板（48 孔） | SPL Life Sciences | 32048 | |
| 氯化钠（用于生理盐水溶液） | Fisher Scientific | 10112640 | |
| 25G 针头（BD Microlance 3） | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| 轨道摇床 S150 | Stuart Scientific | 5133 | |
| P Selecta 培养箱 | J. P. Selecta, s.a. | 0485472 | |
| 多聚甲醛 | PanReac AppliedChem | A3813 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| 蠕动灌注泵 | Cole-Parmer | EW-07522-30 | |
| 铂金镊状电极，直径 5 mm | Btx | 45-0489 | |
| Reflex 皮肤闭合系统 - 7 mm 夹子，每盒 100 个 | AgnThos | 203-1000 | |
| Reflex 皮肤闭合系统 - 7 mm 夹子施加器 | AgnThos | 204-1000 | |
| 环形镊 | Fine Science Tools (FST) | 11103-09 | |
| 叠氮化钠 | PanReac AppliedChem | 122712-1608 | |
| 外科吸收垫（无菌） | HK Surgical | PD-M | |
| 缝合线（Surgicryl PGA 6-0） | SMI Suture Materials | BYD11071512 | |
| 1 ml 注射器（BD plastipak） | Becton, Dickinson and Company | 303172 | |
| 组织培养皿 100 × 20 mm | Falcon | 353003 | |
| 垂直式微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co | P-30 | |
| 直立式显微镜 | Nikon | Eclipse Ni | |
| 振动切片机 | Leica | VT1200S |
参考文献
- Popovitchenko, T., Rasin, M. R. Transcriptional and post-transcriptional mechanisms of the development of neocortical lamination. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 102(2017).
- Mukhtar, T., Taylor, V. Untangling Cortical Complexity During D....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
