利用流式细胞术定量人诺如病毒样颗粒与共生细菌的结合

摘要

本实验方案的目的是定量分析真核病原体人诺如病毒与细菌的结合能力。在完成初步的病毒-细菌结合实验后，采用流式细胞术检测整个细菌群体中与病毒结合的细菌。

摘要

共生细菌对真核病毒的感染具有明确的影响。病原体与宿主微生物组之间的直接结合是多种病毒改变感染过程的原因。因此，表征病毒与细菌结合的性质是阐明细菌如何改变病毒感染机制的基础步骤。对于人诺如病毒而言，共生细菌可增强其对B细胞的感染。该病毒可直接结合这些细菌，表明这种直接相互作用参与了感染增强的机制。可采用多种技术定量细菌与病毒之间的相互作用，包括放射性标记病毒的闪烁计数和聚合酶链式反应（PCR）。这两种方法均需使用活病毒，而这类病毒可能需要在实验室中进行制备。目前，尚无足够高效的人诺如病毒体外培养系统可用于制备高浓度的病毒储备液。因此，研究中常使用病毒样颗粒（VLPs）来表征诺如病毒与细菌之间的相互作用。本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，利用病毒特异性抗体定量VLP与革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的结合情况。实验中同时设置了仅含细菌的对照组和同型对照组，以优化检测条件，减少抗体非特异性结合背景信号，从而准确量化VLP在测试细菌上的附着情况。当VLP与细菌的比例较高时，VLP可结合大部分细菌群体；然而，当VLP数量减少时，结合的细菌比例也随之下降。最终，该方法可用于后续实验，以阐明调控诺如病毒与细菌相互作用的具体条件及其结构组分。

引言

人诺如病毒（HuNoVs）是全球胃肠道疾病的首要病因，每年导致约6.85亿例感染和超过20万例死亡¹。与其他肠道病毒类似，已有研究表明，共生细菌的存在可增强该病原体及其替代病毒——小鼠诺如病毒的感染能力^2,3。然而，也有相互矛盾的报道指出，细菌可能抑制人诺如病毒的感染^4,5,6。对于多种病毒而言，病毒与细菌之间的直接相互作用似乎是影响病毒感染机制的基础^2,7,8,9,10，并且通过电子显微镜已证实人诺如病毒可直接结合到细菌表面^11,12。因此，表征这些相互作用对于阐明细菌影响病毒感染的机制至关重要。此类表征通常始于量化病毒对宿主微生物组中多种细菌....

方案

注意：本方案中所述的细菌培养条件是阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）的标准培养条件。若需对其他细菌种类进行病毒-细菌结合实验，应根据所选细菌的标准培养条件进行培养。

1. 准备细菌培养基

1. Enterobacter cloacae 培养基
   1. 通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠（NaCl）溶解于 1 L 去离子水（DI 水）中来制备液体培养基（参见材料表）。充分混合所有培养基成分，并在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。
   2. 通过将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl 和 15 g 琼脂溶解于 1 L 去离子水中来制备固体培养基。充分混合所有培养基成分，并在高压灭菌器中灭菌 30 分钟。
2. Lactobacillus gasseri 培养基
   1. 通过将 55 g 脱曼-罗戈萨-夏普（MRS；参见材料表）粉末溶解于 1 L 去离子水中来制备液体培养基。培养基应在配制后一个月内使用。灭菌时，先加热培养基 15 分钟至沸腾，随后进行高压灭菌 15 分钟。
   2. 通过将 55 g ....

结果

用于量化人诺如病毒VLP与共生细菌结合的设门策略如图1所示。代表性密度点图展示了样本的设门方式，以排除细胞碎片和细胞聚集体，从而在单细胞群体上确定VLP的结合情况（图1A）。代表性直方图显示，在不含诺如病毒VLP的细菌样本中，抗诺如病毒抗体信号水平较低；在使用同型对照抗体染色的VLP-细菌样本中，背景信号也较低（图1B）。同型对照峰与未染色样本的峰重叠，而使用抗人诺如病毒GII型抗体对相同样本进行染色则导致峰的显著偏移。

采用Overton直方图减法将抗人诺如病毒GII抗体染色样本中的PE阳性信号与相应同型对照的PE阳性信号进行比较，以确定结合人诺如病毒VLPs的细菌群体百分比（

讨论

定量分析肠道病毒与细菌结合的能力，是阐明这些细菌如何改变病毒感染机制的关键第一步。本文所述方法已优化用于检测人诺如病毒病毒样颗粒（VLP）与阴性菌 E. cloacae 以及阳性菌 L. gasseri 之间的相互作用，但也可根据需要调整用于其他任何感兴趣的哺乳动物病毒与细菌。尽管VLP在黏附实验中是活病毒的理想替代物，并且可通过流式细胞术轻松定量，但P颗粒也已被用于研究人诺如病毒与细菌之间的相互作用²⁴。在本研究中，定量的是结合到细菌上的病毒量，而非细菌群体数量，后者如本文所报告。P颗粒相较于VLP的优势在于其更易于制备，同时在抗原性上与VLP及野生型病毒均具有相似性^24,25。然而，人诺如病毒VLP目前可商业化获取，为不具备VLP或P颗粒生产能力的实验室提供了便利。P颗粒与VLP的不同之处在于：VLP保持了野生型病毒颗粒的大小，而P颗粒更小，且具有四面体对称性而非二十面.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5ml 聚苯乙烯圆底带滤网帽试管	Corning	352235	抗体染色后，样品转移至该试管中用于流式细胞术分析。
琼脂	Sigma	A7002	用于培养基制备
AnaeroPack	Thermo Scientific	R681001	用于加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）培养的厌氧气体发生包
BD FacsDiva 软件
BD LSR Fortessa 流式细胞仪
牛血清白蛋白	Fisher Bioreagents	BP1605	用于流式细胞术
流式细胞术染色缓冲液（FCSB）	BD Biosciences	554657	用于流式细胞术
小鼠 IgG2b κ 同型对照抗体（eBMG2b），PE 标记，eBioscience	Thermo Fisher Scientific	12473281	同型对照抗体。该抗体由厂家提供偶联形式。
MRS 培养基粉末	BD Biosciences	288130	用于培养基制备及加氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）的培养。
诺如病毒衣壳 G2 单克隆抗体（L34D）	Thermo Fisher Scientific	MA5-18241	诺如病毒 GII 型抗体。该抗体仅以未偶联形式提供，因此在进行所述流式细胞术检测前必须进行荧光标记。本方案中选用 PE 作为荧光素，但研究者可根据所用流式细胞仪的具体情况选择其他合适的荧光分子。
诺如病毒 GII.4 病毒样颗粒（VLP）	Creative Biostructure	CBS-V700	人诺如病毒病毒样颗粒，通过杆状病毒系统表达并重悬于含 10% 甘油的磷酸盐缓冲液中。作者通过独立的纳米颗粒追踪分析测定 VLP 的颗粒浓度，浓度约为每毫升 1011 个 VLP。根据 VLP 的蛋白浓度，在 VLP 结合实验中，每个细菌大约加入 200 个颗粒。
PBS 10X	Fisher Bioreagents	BP665	使用前稀释至 1X。
SiteClick R-PE 抗体标记试剂盒	Thermo Fisher Scientific	S10467	用于未偶联抗体的荧光标记。
氯化钠	Fisher Scientific	S271	用于培养基制备
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042	用于培养基制备
Tube Revolver 混匀仪	ThermoFisher Scientific	88881001	用于病毒-细菌结合实验，设置为最高转速（40 rpm）。
酵母提取物	BD Biosciences	212750	用于培养基制备