一种改良的两肾一夹小鼠模型用于研究肾动脉狭窄中的肾素调节

摘要

采用聚氨酯管建立了一种改良的双肾单夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型，以诱发肾动脉狭窄，从而引起肾素表达升高和肾脏损伤。本文详细描述了制备套管并将其放置于肾动脉上的操作步骤，以构建可重复且稳定的2K1C小鼠模型。

摘要

肾动脉狭窄是冠状动脉或外周血管疾病患者中常见的病症，此类患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）过度激活。在此情况下，肾动脉发生狭窄，刺激肾素的表达和释放增加，而肾素是RAAS中的限速蛋白酶。肾素表达升高是肾血管性高血压的已知驱动因素，常与肾脏损伤及终末器官损害相关。因此，开发该病症的新型治疗方法具有重要意义。目前，肾动脉狭窄中肾素调控的分子与细胞机制尚未完全阐明，有待进一步研究。为在小鼠中诱导肾动脉狭窄，本研究采用改良的双肾单夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型。在野生型小鼠中对右肾实施肾动脉狭窄，假手术小鼠作为对照。肾动脉狭窄术后，我们检测了肾素表达及肾脏损伤情况。获取肾脏后，取新鲜皮质组织用于检测肾素的蛋白和mRNA表达水平。该动物模型可重复性强，可用于研究肾血管性高血压和肾脏损伤相关的病理生理反应、分子机制及细胞通路。

引言

肾动脉狭窄（RAStenosis）是一种难治性疾病，影响约6%的65岁以上人群，在患有冠状动脉或外周血管疾病的患者中发病率高达40%^1,2。目前对该病的治疗手段有限，因此迫切需要开发新的疗法来治疗由肾动脉狭窄引起的肾血管性高血压或难治性高血压。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）是参与肾动脉狭窄所致高血压或肾血管性高血压发病机制的关键通路^3,4。已知靶向RAAS的治疗方法，如血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂，虽可缓解高血压，但需密切监测肾功能衰竭和高钾血症的风险^5,6,7。肾素催化RAAS中的限速步骤，将血管紧张素原转化为血管紧张素I。在动脉粥样硬化中，斑块形成导致肾动脉狭窄，从而促进肾素分泌，引发肾血管性高血压和肾脏损伤⁸。多项研究报道，在人类肾血管性高血压期间氧化应激水平升高，这一现象在双肾单夹（2K1C）小鼠模型及其他高血压动物模型中也得到了证实^2,

方案

小鼠饲养和护理工作在范德堡大学医学中心（VUMC）动物护理部进行，遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南以及美国卫生与公共服务部发布的《实验动物护理和使用指南》。所有动物实验程序在开始前均已获得范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物准备与解剖

1. 打开发芽箱和水泵 手术开始前约30分钟开启加热垫。
2. 用锋利的手术刀截取一段0.5 mm长的聚氨酯管。沿管壁纵向切开，去除0.2 mm周长部分，制成套管。
   注意：这是肾动脉狭窄手术中的关键步骤，需要极高的精确度、细致入微的注意力和耐心。尝试同时切割多段聚氨酯管。整个操作过程需在显微镜下进行。
3. 在继续操作之前，戴上无菌外科手套和外科口罩。
4. 使用6-8周龄的C57BL/6野生型（WT）小鼠。为避免性别偏差，应使用相同数量的雄性和雌性小鼠。
5. 记录小鼠手术前的体重。使用聚氨酯管进行肾动脉狭窄手术的理想体重范围为18–22 g。注射麻醉剂时应轻柔操作小鼠，避免刺激。术前给予镇痛处理（Ketofgen，5 mg/kg 体重）。
   注意：将小鼠从饲养室转移到手术室时，应极其轻柔谨慎地操作，避免使其躁动。强烈建议用手而非推车搬运小鼠笼具。
6. 通过腹腔注射（I.P.）给予小鼠混合物（氯胺酮 100 mg/kg 体重和赛拉嗪 10 mg/kg 体重）进行麻醉。
7. ....

结果

肾动脉狭窄会增加狭窄侧肾脏的肾素表达，同时抑制对侧肾脏的肾素表达。双肾单夹（2K1C）或Goldblatt狭窄模型可诱导肾素表达升高并导致肾脏损伤，该模型被公认为最能代表人类单侧肾动脉狭窄的动物模型。

采用免疫印迹法检测肾素及其前体（prorenin）的表达。结果显示，与对侧肾和假手术组肾脏相比，狭窄肾中肾素和prorenin的表达均升高，提示套管导致肾动脉受压，引起肾灌注改变（图1）。为观察肾素表达的定位分布，进行了免疫组织化学染色（IHC）。IHC结果进一步证实了免疫印迹的结果，显示夹闭侧肾脏中肾素表达增加（图2）。此外，在狭窄肾的入球小动脉中可见球旁（juxtaglomerular, JG）细胞的募集现象（图2）。为探讨肾素mRNA表达水平的变化，进行了原位杂交（ISH）检测。ISH结果显示，与对侧肾和假手术组肾脏相比，狭窄肾中肾素mRNA表达升高，并伴有JG细胞的募集（

讨论

肾动脉狭窄是继发性或难治性高血压以及肾脏损伤的重要原因^1,29。双肾单夹（2K1C）Goldblatt 模型已被用于研究肾血管性高血压的肾动脉狭窄^1,17,18,19。以往多项研究采用多种动物模型表明，肾动脉狭窄是肾素过度表达和释放以及肾脏损伤的强烈刺激因素^{18,30,31,32,33,3.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
饮食凝胶	透明 H2O	Diet-Gel 76A	术后恢复饮食
EMC 加热硬垫	Hallowell	000A2788B	加热垫用于维持小鼠体温
Ethilon 尼龙缝线	Ethicon	662G	4-0（1.5 规格），用于缝合腹膜和皮肤
Ethilon 尼龙缝线	Ethicon	2815 G	8-0（0.4 规格），用于结扎套管以收缩动脉
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	用于手术间消毒外科器械
酮洛芬	Zoetis	Ketofen	镇痛药
聚氨酯	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	该导管用于诱导狭窄
聚维酮碘消毒棉签	Medline	MDS093901	脱毛后及手术期间用于皮肤消毒
Reflex 7 施夹器	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	当一条或多条缝线失效时，使用该施夹器进行夹闭
无菌手术巾	Dynarex	4410	用作小鼠手术期间的床单
三重抗生素软膏	Medi-First	22312
水泵	Stryker	T/pump Professionals	用于在加热硬垫中加热水并循环，以在术中和术后维持小鼠体温