一种改良的两肾一夹小鼠模型用于研究肾动脉狭窄中的肾素调节

摘要

采用聚氨酯管建立了一种改良的双肾单夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型，以诱发肾动脉狭窄，从而引起肾素表达升高和肾脏损伤。本文详细描述了制备套管并将其放置于肾动脉上的操作步骤，以构建可重复且稳定的2K1C小鼠模型。

摘要

肾动脉狭窄是冠状动脉或外周血管疾病患者中常见的病症，此类患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）过度激活。在此情况下，肾动脉发生狭窄，刺激肾素的表达和释放增加，而肾素是RAAS中的限速蛋白酶。肾素表达升高是肾血管性高血压的已知驱动因素，常与肾脏损伤及终末器官损害相关。因此，开发该病症的新型治疗方法具有重要意义。目前，肾动脉狭窄中肾素调控的分子与细胞机制尚未完全阐明，有待进一步研究。为在小鼠中诱导肾动脉狭窄，本研究采用改良的双肾单夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型。在野生型小鼠中对右肾实施肾动脉狭窄，假手术小鼠作为对照。肾动脉狭窄术后，我们检测了肾素表达及肾脏损伤情况。获取肾脏后，取新鲜皮质组织用于检测肾素的蛋白和mRNA表达水平。该动物模型可重复性强，可用于研究肾血管性高血压和肾脏损伤相关的病理生理反应、分子机制及细胞通路。

引言

肾动脉狭窄（RAStenosis）是一种难治性疾病，影响约6%的65岁以上人群，在患有冠状动脉或外周血管疾病的患者中发病率高达40%^1,2。目前对该病的治疗手段有限，因此迫切需要开发新的疗法来治疗由肾动脉狭窄引起的肾血管性高血压或难治性高血压。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）是参与肾动脉狭窄所致高血压或肾血管性高血压发病机制的关键通路^3,4。已知靶向RAAS的治疗方法，如血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂或血管紧张素受体阻滞剂，虽可缓解高血压，但需密切监测肾功能衰竭和高钾血症的风险^5,6,7。肾素催化RAAS中的限速步骤，将血管紧张素原转化为血管紧张素I。在动脉粥样硬化中，斑块形成导致肾动脉狭窄，从而促进肾素分泌，引发肾血管性高血压和肾脏损伤⁸。多项研究报道，在人类肾血管性高血压期间氧化应激水平升高，这一现象在双肾单夹（2K1C）小鼠模型及其他高血压动物模型中也得到了证实^{2,9,10,11,12,13,14,15,16}。在肾动脉狭窄所致肾血管性高血压过程中，肾素表达调控的分子机制尚不明确，有待进一步研究。

能够可靠且可重复地模拟肾动脉狭窄（RAS）的实验动物模型，对于阐明肾素表达调控的细胞与分子机制、进而开发新型治疗方法具有重要意义。双肾一夹（2K1C）小鼠模型是研究肾血管性高血压发病机制的成熟实验模型^17,18,19,20。该模型通过使用夹子缩窄肾动脉^17,20,21，造成肾动脉狭窄，从而导致肾素表达升高和高血压^17,19,20,21。然而，目前尚无技术报告详细描述在动物模型中建立肾动脉狭窄的逐步操作流程。

传统的U形银夹、聚氨酯管及其他夹子已被用于缩窄肾动脉以诱导肾动脉狭窄。一些研究表明， 夹子的设计和材料对于在2K1C动物模型中获得可靠且可重复的数据至关重要。根据Lorenz等人的研究，使用传统U形设计的银夹诱导高血压的成功率较低（40–60%）²¹。由于夹子的设计，肾动脉受到侧向压迫，导致狭窄程度较小，且更容易从肾动脉上脱落。银的延展性和可塑性可能导致夹子宽度发生变化，从而引起小鼠间高血压水平的差异。夹子表面的氧化银可能引发血管周围炎症、内膜增生和组织肉芽形成，进而改变肾动脉直径²²。由于传统U形银夹所诱导的高血压水平存在较大变异性，Warner等人和Lorenz等人已成功采用圆形设计的聚氨酯管在小鼠中诱导肾动脉狭窄，从而更可靠且一致地建立双肾单夹动物模型^20,21。

在本报告中，我们描述了一种通过使用聚氨酯管束窄小鼠肾动脉来建立实验性肾动脉狭窄（RAStenosis）的手术方案。这种圆形设计的聚氨酯套管是一种可重复性高、可靠性好且成本较低的夹闭工具，适用于在小鼠中诱导狭窄。该实验模型的目的是研究并明确肾动脉狭窄期间肾素表达调控的分子与细胞机制。我们通过检测肾素表达水平以及肾脏损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（N-GAL）来验证RAStenosis小鼠模型的成功建立。

方案

小鼠饲养和护理工作在范德堡大学医学中心（VUMC）动物护理部进行，遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南以及美国卫生与公共服务部发布的《实验动物护理和使用指南》。所有动物实验程序在开始前均已获得范德堡大学医学中心机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物准备与解剖

1. 打开发芽箱和水泵 手术开始前约30分钟开启加热垫。
2. 用锋利的手术刀截取一段0.5 mm长的聚氨酯管。沿管壁纵向切开，去除0.2 mm周长部分，制成套管。
   注意：这是肾动脉狭窄手术中的关键步骤，需要极高的精确度、细致入微的注意力和耐心。尝试同时切割多段聚氨酯管。整个操作过程需在显微镜下进行。
3. 在继续操作之前，戴上无菌外科手套和外科口罩。
4. 使用6-8周龄的C57BL/6野生型（WT）小鼠。为避免性别偏差，应使用相同数量的雄性和雌性小鼠。
5. 记录小鼠手术前的体重。使用聚氨酯管进行肾动脉狭窄手术的理想体重范围为18–22 g。注射麻醉剂时应轻柔操作小鼠，避免刺激。术前给予镇痛处理（Ketofgen，5 mg/kg 体重）。
   注意：将小鼠从饲养室转移到手术室时，应极其轻柔谨慎地操作，避免使其躁动。强烈建议用手而非推车搬运小鼠笼具。
6. 通过腹腔注射（I.P.）给予小鼠混合物（氯胺酮 100 mg/kg 体重和赛拉嗪 10 mg/kg 体重）进行麻醉。
7. 将小鼠放回笼中直至完全麻醉。通常需要约4-5分钟小鼠才会完全失去意识。用镊子夹住小鼠尾巴或脚趾以检查其是否已完全无意识，确认后即可进行手术。
8. 将小鼠仰卧置于纸巾上。使用电动剃毛器逆着毛发生长方向剃除侧腹部的毛发。剃除手术区域毛发后，用含碘（或氯己定）的外科擦洗剂清洁该区域，随后用70%乙醇（或无菌生理盐水）冲洗。  重复3次。
   注意：脱毛操作必须在距离手术操作台一定距离处进行，最好在不同的实验台进行，以避免手术过程中毛发的干扰和污染。
9. 用无菌布覆盖加热垫。将小鼠移至手术台，置于无菌布上，使其右侧面向显微镜。通过循环水维持加热垫恒定温度为37 °C。
10. 打开装有所有外科手术器械的无菌袋。在解剖显微镜下，使用无菌尖头剪刀在 flank 部位做一小切口（靠近13^th 胸椎肋骨（小鼠的最后一根肋骨），距离椎骨约0.5 cm处。沿腰椎方向推进，做一长约1英寸的切口。
11. 向后牵拉皮肤和肌肉以暴露肾脏。
12. 使用无菌棉签清理并去除周围脂肪，以分离肾动脉。用弯头镊子将肾神经从肾动脉上分离出来。
13. 进行假手术时，使用缝线缝合皮肤 并在闭合的伤口上涂抹抗生素，然后 继续进行 术后护理 若无异常，则继续进行下一节操作以使动脉狭窄。
    注意：每次实验均应设置假手术动物作为手术操作的对照。假手术动物是指接受暴露肾动脉的手术操作但不放置套管的小鼠。

2. 右肾动脉狭窄

1. 在右肾动脉下方放置两根尼龙缝线，打松结，然后将套管置于主肾动脉上，位置大约在肾脏与主动脉分叉之间等距处
2. 使用尼龙缝线闭合套管。每根缝线打四个 结，以避免术后缝线脱落的可能性。
3. 采用连续简单缝合法闭合肌肉切口。
4. 采用间断简单缝合法缝合皮肤。
5. 给予经IACUC批准的镇痛药物。
   注意：每次使用前应对手术器械进行高压灭菌。若同时进行多台手术，每次手术后需用无菌酒精纱布擦拭所有使用过的器械，并将其置于高温灭菌器中处理15-30秒。每只小鼠手术时均需更换无菌手套。

3. 术后护理

1. 将小鼠放回笼中，将笼子一半置于循环水加热垫上，一半置于其外，持续 2 - 3 小时。在笼内放入凝胶状恢复期饲料。
2. 术后次日给予小鼠腹腔注射镇痛剂（酮洛芬）（剂量：5 mg/kg 体重） 。
3. 术后连续两天称量小鼠体重；若发现小鼠体重减轻超过 20%，应咨询兽医，并根据机构 IACUC 批准的程序决定是否实施安乐死。
4. 每天观察小鼠，评估是否存在红肿、疼痛或感染迹象。
5. 根据机构 IACUC 政策，针对术后并发症及时寻求兽医咨询。

4. 组织收获

1. 手术后3周采集组织。记录每只小鼠的体重。
2. 采用经IACUC批准的程序处死小鼠。
3. 将小鼠仰卧置于无菌操作台上以进行解剖。
4. 固定并伸展四肢，以限制其移动。
5. 用70%乙醇彻底喷洒小鼠体表。
6. 使用锋利的剪刀沿中线切开腹腔和胸腔区域。
7. 向后拉开皮肤和腹膜壁。
8. 小心暴露心脏，穿刺右心室并放血以处死小鼠。
9. 使用镊子取出双侧肾脏。肾脏位于小鼠背部。
   注意：不要混淆两侧肾脏。注意区分狭窄侧、假手术侧及对侧肾脏。
10. 剥离肾包膜，清除脂肪组织，并分别记录每侧肾脏的重量。
11. 取双侧肾脏的纵向切面，于4 °C条件下在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，随后进行石蜡包埋处理，用于原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）分析。ISH和IHC操作步骤参照已有文献^23,24。
12. 分离剩余肾脏的皮质部分，用液氮速冻后用于Western blot分析。样品保存于-80 °C直至检测。
13. 按照文献所述方法^23,24，通过Western blot定量检测肾素（renin）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（N-GAL）的表达水平。

5. 统计学

1. 对于包含三个或以上条件的实验，采用单向或双向方差分析，随后进行 Bonferroni 事后检验以比较各组之间差异。将 p 值小于或等于 0.05 视为具有统计学显著性。使用软件（例如 GraphPad Prism 8.2）进行所有统计分析。

结果

肾动脉狭窄会增加狭窄侧肾脏的肾素表达，同时抑制对侧肾脏的肾素表达。双肾单夹（2K1C）或Goldblatt狭窄模型可诱导肾素表达升高并导致肾脏损伤，该模型被公认为最能代表人类单侧肾动脉狭窄的动物模型。

采用免疫印迹法检测肾素及其前体（prorenin）的表达。结果显示，与对侧肾和假手术组肾脏相比，狭窄肾中肾素和prorenin的表达均升高，提示套管导致肾动脉受压，引起肾灌注改变（图1）。为观察肾素表达的定位分布，进行了免疫组织化学染色（IHC）。IHC结果进一步证实了免疫印迹的结果，显示夹闭侧肾脏中肾素表达增加（图2）。此外，在狭窄肾的入球小动脉中可见球旁（juxtaglomerular, JG）细胞的募集现象（图2）。为探讨肾素mRNA表达水平的变化，进行了原位杂交（ISH）检测。ISH结果显示，与对侧肾和假手术组肾脏相比，狭窄肾中肾素mRNA表达升高，并伴有JG细胞的募集（

讨论

肾动脉狭窄是继发性或难治性高血压以及肾脏损伤的重要原因^1,29。双肾单夹（2K1C）Goldblatt 模型已被用于研究肾血管性高血压的肾动脉狭窄^1,17,18,19。以往多项研究采用多种动物模型表明，肾动脉狭窄是肾素过度表达和释放以及肾脏损伤的强烈刺激因素^{18,30,31,32,33,3...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
饮食凝胶	透明 H2O	Diet-Gel 76A	术后恢复饮食
EMC 加热硬垫	Hallowell	000A2788B	加热垫用于维持小鼠体温
Ethilon 尼龙缝线	Ethicon	662G	4-0（1.5 规格），用于缝合腹膜和皮肤
Ethilon 尼龙缝线	Ethicon	2815 G	8-0（0.4 规格），用于结扎套管以收缩动脉
Germinator 500	Braintree Scientific Inc.	GER 5287	用于手术间消毒外科器械
酮洛芬	Zoetis	Ketofen	镇痛药
聚氨酯	Braintree Scientific Inc.	MRE-025	该导管用于诱导狭窄
聚维酮碘消毒棉签	Medline	MDS093901	脱毛后及手术期间用于皮肤消毒
Reflex 7 施夹器	Roboz Surgical Instrument Co	204-1000	当一条或多条缝线失效时，使用该施夹器进行夹闭
无菌手术巾	Dynarex	4410	用作小鼠手术期间的床单
三重抗生素软膏	Medi-First	22312
水泵	Stryker	T/pump Professionals	用于在加热硬垫中加热水并循环，以在术中和术后维持小鼠体温