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方法文章

降解FFPE-RNA样本测序及分析的优化

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DOI：

10.3791/61060

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2020年6月8日

 ,  ,  ,  ,  , 
1NCI CCR Sequencing Facility, Frederick National Laboratory for Cancer Research, 2Advanced Biomedical and Computational Sciences, Frederick National Laboratory for Cancer Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。

摘要

通过RNA测序（RNA-seq）进行基因表达分析，能够对临床样本提供独特的见解，有助于揭示多种疾病的发病机制以及耐药性或易感性的分子基础。然而，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织虽然是临床标本中保存组织形态最常用的方法，却并非基因表达谱分析的理想材料。此类样本提取的RNA通常存在降解、断裂和化学修饰等问题，导致所构建的测序文库质量不佳，进而产生低质量的测序数据，可能无法可靠地用于基因表达分析和突变检测。为了最大限度地利用FFPE样本并从低质量RNA样本中获得尽可能优质的数据，在实验设计、测序文库构建以及数据分析过程中必须采取一系列必要的预防措施。这包括采用适当的指标进行精确的样本质量控制（QC），选择适用于各步骤的最佳文库构建方法，并进行严谨的文库质量评估。此外，在序列数据分析过程中，正确选用软件工具和参数至关重要，以识别RNA-seq数据中的技术假象，过滤污染序列和低质量读段，评估基因覆盖的均匀性，并衡量生物学重复样本间基因表达谱的可重复性。这些步骤可确保对高度异质性的RNA样本进行高准确性与高可重复性的表达谱分析。本文将详细介绍样本质量控制、文库制备与质控、测序及数据分析的各个步骤，以帮助提高从低质量RNA（如FFPE组织来源的RNA）中获取的可用数据量。

引言

新一代测序技术的应用使我们能够从各类样本中获取大量信息。然而，对于陈旧或保存不佳的样本，常规的测序数据生成方法往往难以奏效，通常需要对已建立的实验方案进行修改。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织即属于此类广泛用于临床标本的样本类型1,2,3。尽管FFPE保存方法可维持组织形态，但其中的核酸通常存在不同程度的损伤和降解，导致难以获取可能揭示多种疾病分子机制的重要基因组信息。

通过RNA测序生成的基因表达数据在研究疾病和抗性机制方面通常具有重要作用，并可补充DNA突变分析。然而，RNA更容易降解，因此从FFPE组织中获得准确的基因表达数据更具挑战性。此外，由于测序技术的广泛应用和低成本是相对近期的发展，较早的样本通常未在保持RNA完整性的条件下储存。FFPE样本存在的一些问题包括：因包埋于石蜡中导致RNA降解、RNA的化学修饰引起片段化或对测序所需的酶促反应产生抗性，以及poly-A尾的丢失，从而限制了oligo-dT作为逆转录酶引物的应用4。另一个挑战是在非理想条件下对FFPE样本进行处理或储存，可能导致组织中如RNA等不稳定分子进一步降解5。这一点对于那些在采集时尚未预见到将进行RNA测序基因表达分析的较早样本尤为相关。上述因素共同导致所提取RNA的质量和数量下降，难以生成有价值的测序数据。由于成功率较低且测序成本较高，许多研究人员因此不愿尝试从潜在有价值的FFPE样本中生成和分析基因表达数据。近年来一些研究已证明FFPE组织可用于基因表达分析2,6,7,8,9，尽管所用样本数量较少和/或较为近期。

作为一项可行性研究，我们使用了来自监测、流行病学和最终结果（SEER）癌症登记项目的三个残留组织库的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本中提取的RNA，进行RNA测序和基因表达分析10。这些FFPE组织样本购自临床病理实验室，来源于高级别卵巢浆液性腺癌，储存时间长达7至32年，储存条件各异，之后才进行RNA提取。由于大多数情况下，这些组织块在多年储存期间并未预期未来会进行任何敏感的遗传学分析，因此并未特别注意核酸的保存。因此，大多数样本的RNA质量较差，且有大量样本受到细菌污染。尽管如此，我们仍能够完成基因定量，评估基因覆盖的均匀性和连续性，并在生物学重复样本之间进行皮尔逊相关性分析以评估可重复性。基于一组关键的特征基因面板，我们将本研究中的样本与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据进行比较，证实约60%的样本具有可比的基因表达谱11。根据各项质控结果与样本元数据之间的相关性，我们确定了若干具有较好预测价值的关键质控指标，可用于识别更有可能产生可用测序数据的样本11。

本文介绍了用于FFPE-RNA质量评估的方法，从提取的RNA样本起始构建测序文库，以及对测序数据进行生物信息学分析的流程。

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方案

1. RNA 定量与质量评估

  1. 根据预定义的标准选择FFPE样本，并使用适当的方法提取RNA（例如，FFPE-核酸提取试剂盒，材料表）。
    注意：目前有多种可用于FFPE-RNA提取的方法，包括较新的显微切割技术，这些方法可在使用极少组织的情况下提取出高质量的RNA12,13,14。
  2. 在所有操作阶段均需格外注意保持RNA的完整性。这包括使用无RNase的去离子水、无RNase的塑料耗材，并使用RNase去污染试剂清洁所有接触FFPE组织块的仪器。
  3. 处理RNA时应始终小心操作，并在未特别说明的情况下将其置于冰上，以尽量减少降解。
  4. 若样本量充足，应从FFPE组织块的多个区域分别提取RNA，以尽可能生成生物学重复样本。对于部分RNA产量充足的样本，可将提取的RNA分为两份，作为技术重复进行处理。
  5. 如有可能，在提取后单独保留少量样本用于质量控制（即QC分装样本），以避免因反复操作和冻融循环导致RNA降解。
  6. 使用RNA质量控制系统（例如，Agilent Bioanalyzer系统配合RNA Nano芯片，材料表）按照制造商说明书检测RNA质量（建议使用QC分装样本）。
  7. 通过计算DV200和DV100值（即长度大于200 nt的片段所占百分比为DV200，大于100 nt的片段所占百分比为DV100），分析样本中RNA片段的分布情况（例如，使用Bioanalyzer 2100 Expert软件）。
  8. 在DV200和DV100中，选择在给定样本集中数值分布范围更广的指标，用于根据RNA完整性程度对样本进行分组。
    注意：对于RNA分子完整性较高的样本集（即DV200值较高，全部或大多数样本DV200 > 40%），DV200可能是更有用的质量控制指标；而对于转录本降解较严重的样本集（即DV200值较低，全部或大多数样本DV200 < 40%），DV100更可能具有实用价值。
  9. 根据质量控制指标，识别出DV100 < 40%的样本。由于此类程度的降解极有可能无法产生有用的测序数据11，建议避免处理这些样本。若存在可替换的样本，应检测其质量，理想情况下仅纳入DV100 > 50%的样本。

2. 测序文库制备

  1. 根据第1节中对样本质量的评估结果，确定生成测序文库的合适方法。
    1. 对于降解程度极低且DV200值较高的样本集，可采用mRNA测序（即富集带有polyA尾的转录本）、靶向RNA测序（即使用特定基因的捕获探针）、RNA外显子测序（即使用捕获探针富集编码转录组）或总RNA测序（即使用随机引物进行逆转录，以对去除核糖体RNA后的全部RNA群体进行测序）。但需注意，固定过程可能对提取的RNA引入偏差，因此即使DV200值较高，某些捕获方法在实际应用中也可能效果不佳。
    2. 若样本集中包含高度降解的样本（DV200 < 30%），应采用总RNA文库构建方法，而非依赖于转录本特定区域捕获的方法，因为这些特定区域在降解样本中可能已缺失。使用随机引物合成cDNA可提高最终文库中可用RNA的代表性，因此更适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）来源的RNA样本。
    3. 对于高度降解样本集的核糖体RNA去除，建议采用基于RNaseH的方法。该方法利用特异性识别rRNA的DNA探针与rRNA结合，形成双链结构后由RNaseH酶消化，再通过DNase清除残留探针（例如NEBNext rRNA去除试剂盒，参见材料表）。此类方法在处理降解样本时优于其他部分方法8。
  2. 在构建测序文库时，对于RNA降解程度较高的样本（DV100 < 60%），应尽可能使用更高的起始投入量。虽然质量较好的RNA样本（DV100 > 60%）即使在较低投入量下（本方案中FFPE-RNA最低测试投入量约为20 ng）也能获得良好的测序数据，但对于降解更严重的RNA样本（DV100 < 60%），建议使用更高的起始投入量（例如>100 ng）。
    注意：若样本量充足（例如>500 ng），建议至少保留一半样本以备重复建库之需。对于低投入量样本（例如<100 ng），通常建议使用全部样本量，以构建具有足够多样性的文库。
  3. 选定适用于高度降解样本总RNA测序文库构建的合适试剂盒后（例如NEBNext Ultra II RNA文库构建试剂盒（Illumina平台），参见材料表），请依照制造商提供的说明书进行文库制备。
    注意：在文库构建过程中，应对已降解的样本跳过RNA片段化步骤，并确保在第一链cDNA合成中使用随机引物。
  4. 为提高效率和速度，特别是针对低投入量样本，建议使用配备强固定磁铁的合适磁力架，用于基于磁珠的纯化和片段大小选择步骤（参见材料表）。
  5. 对连接接头后的DNA进行PCR扩增富集时，应根据投入DNA的量调整扩增循环数，以在保证文库分子最大代表性的同时，避免不必要的重复扩增。对于低投入量的FFPE-RNA样本（<100 ng），推荐进行16–18个扩增循环；而对于高投入量样本（1,000 ng），通常在12–14个循环内即可获得足够的文库产量。
  6. 按照制造商说明书完成PCR扩增及纯化后，应在适当平台上检测文库质量（例如Agilent Bioanalyzer DNA芯片，参见材料表），分析文库浓度及分子分布情况。若检测到引物二聚体峰（约80 bp）或接头二聚体峰（约128 bp），应重复纯化步骤以去除这些峰。
  7. 计算每个文库的平均片段大小（例如使用Bioanalyzer 2100 Expert软件）。

3. 测序文库质控

  1. 在确认文库不含过量引物和接头二聚体，且浓度足以进行后续测序后，使用qPCR进一步定量。
    注意：由于簇生成对文库浓度非常敏感，准确的定量对于避免测序运行效率低下或过度加载至关重要。定量实时PCR（qPCR）方法有助于在Illumina平台上优化簇密度，同时避免过度簇化。相较于基于所有文库分子的定性或定量分析方法（例如Agilent Bioanalyzer），qPCR方法更为精确和灵敏，因为它仅检测两端均含有接头序列、能够在流动池上形成簇的模板。然而，必须预先知道文库大小，以便对所有样本应用大小校正，从而使结果能够与标准曲线进行比较。
    警告：进行qPCR操作时必须始终穿戴实验服和手套，并在生物安全柜内按照制造商说明书进行操作。
    1. 使用合适的试剂盒（例如KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix for Illumina文库，属于文库定量试剂盒的一部分，参见材料表），为每个样本设置三个重复以减少误差，同时设置标准品、阳性对照（例如PhiX对照，参见材料表）和无模板对照（NTC）。NTC是指不含DNA文库的qPCR混合液。阳性对照可以是任何已知浓度和片段大小的文库。
      1. 根据供应商提供的方案，至少准备六个梯度稀释的标准品。
    2. 加入所有组分（即qPCR主混合液、文库、标准品）后，用密封膜覆盖96孔板，并使用刮板确保密封膜与板面均匀且牢固贴合。
    3. 涡旋混匀后，在1,500 rpm下离心至少1分钟。目视检查各孔底部，确保无气泡存在。
    4. 将96孔板置于热循环仪（例如CFX96 Touch系统，参见材料表）上，按照制造商推荐的程序设置运行参数。
    5. 将运行数据文件夹保存至可访问的位置，以便后续数据分析。
    6. 数据分析过程中，应确认标准曲线的斜率在-3.1至-3.6之间，扩增效率在90%至110%之间，R2（标准曲线的相关系数）不低于0.98。
  2. 文库混合：在获得各待测序文库的qPCR浓度后，根据每个样本所需的测序读长数量以及测序仪器的输出能力，将各文库按等摩尔量混合。
  3. 混合文库的质量控制：按照步骤3.1所述相同方案，再次使用qPCR对混合后的文库进行定量。

4. 测序

  1. 根据运行参数，取出测序试剂盒并按照用户指南进行解冻。请查阅Illumina官方网站，获取在Illumina仪器上测序所用的最新版所有用户指南。
  2. 确保试剂完全解冻后，将试剂托盘置于4 °C环境中。试剂解冻后应不超过2小时即启动运行，否则可能影响运行结果的质量。
  3. 轻轻翻转试剂盒5次以混匀试剂，并轻敲台面以减少气泡。
  4. 将未拆封的流动池包装置于室温下静置30分钟。
  5. 拆开流动池包装，使用无尘酒精擦拭布清洁流动池的玻璃表面，再用低尘实验室纸巾擦干玻璃表面。
  6. 打开Illumina“实验管理器”应用程序，选择“创建样本表单”，然后选择测序仪，点击“下一步”。
  7. 根据Illumina测序仪的标准创建并上传样本表单（例如，使用Illumina实验管理器或软件指南）。
  8. 在提示界面扫描试剂盒条形码，并输入运行设置参数（例如，对于单索引PE 75个循环的运行，输入76-8-76）。
  9. 根据测序仪用户指南的建议对文库混合物进行变性与稀释（例如，参照Illumina提供的NextSeq 500系统指南，见材料表）。
  10. 将对照文库PhiX（见材料表）变性并稀释至适当浓度（例如，NextSeq使用1.8 pM）。
  11. 将样本文库与PhiX对照混合，使PhiX对照的体积比达到1%。
  12. 将变性并稀释后的样本加载至试剂盒指定的储液槽中。
  13. 安装流动池、缓冲液盒和试剂盒。
  14. 执行自动检查并进行审核，确保运行参数通过系统检查。
  15. 自动检查完成后，选择开始以启动测序运行。

5. 数据分析与质量评估

注意：典型的 RNA-seq 数据分析流程（图 1）包括数据预处理与质控、比对到参考基因组及比对后质控、基因与转录本定量、样本相关性分析、不同样本组或处理条件间的差异分析，以及基因集富集与通路分析。

RNA-seq 数据可能存在影响基因表达谱准确性并导致错误结论的质量问题。因此，对测序质量、污染、测序覆盖度偏差及其他人为假象来源进行初步质控检查非常重要。建议应用类似于本文所述工作流程的 RNA-seq 质控流程，在下游分析之前检测人为假象并实施过滤或校正措施。

  1. 预处理
    注意：包括多重测序解码（demultiplexing）、序列读段质量评估、GC 含量分析、测序接头是否存在、过度表达的 k-mer 以及 PCR 重复读段的检测。这些信息有助于识别测序错误、PCR 人为偏差或污染。
    1. 使用 Illumina 软件工具 bcl2fastq2 对 Illumina 测序数据进行多重解码，以根据样本表中定义的样本生成每个样本的原始 FASTQ 文件。若无条形码冲突，允许样本索引条形码中存在一个错配，以容忍测序错误。
    2. 运行 FASTQC15 软件工具对原始 FASTQ 文件进行质量检查，以检测测序读段中是否存在低质量或异常情况。
    3. 对于接头序列和低质量碱基的修剪，使用 Cutadapt16 或 Trimmomatic17 软件工具去除测序接头和低质量碱基。将修剪后的读段保存为成对末端 fastq 文件。
    4. 污染筛查
      1. 运行 FASTQ_screen18 检测可能存在的与其他物种的交叉污染。
      2. 运行 Kraken219 中的 miniKraken 鉴定污染物种的分类学信息。
  2. 比对至参考基因组及比对后质控
    1. 使用 STAR 比对工具20 将修剪后的读段比对至参考基因组序列（GRCh Build hg19 或 hg38）。应用 Gencode 注释 GTF 文件指导剪接转录本的比对。建议运行 STAR 两步法（2-pass） 以提高对新剪接位点的检测灵敏度。在第二步中，所有读段将基于第一步识别出的已知基因、转录本及新剪接位点重新比对。
    2. 执行比对后质控。
      1. 运行 Picard21 的 MarkDuplicates 程序，通过确定样本中唯一或非重复读段的数量来评估文库复杂性。
      2. 运行 Picard 的 CollectRnaSeqMetrics 程序，收集编码区、内含子区、基因间区、UTR 区域的比对百分比以及基因体覆盖度信息。
      3. 运行 RSeQC22 分析读段对内部距离、读段在 CDS 外显子、5’UTR、3’UTR、内含子、TSS_up_1kb、TSS_up_5kb、TSS_up_10kb、TES_down_1kb、TES_down_5kb、TES_down_10kb 中的分布、读段 GC 含量、剪接位点饱和度以及文库链特异性信息。
      4. 运行 multi-QC23 生成 HTML 格式的综合质控报告。
  3. 基因定量与校正分析
    1. 运行 RSEM24 获取基因和转录本的原始计数及标准化读段计数。常用的读段计数度量包括 RPKM（每百万映射读段中每千碱基外显子模型的读段数）、FPKM（每百万映射读段中每千碱基外显子模型的片段数）和 TPM（每百万转录本数），这些是 RNA-seq 基因表达分析中最常报告的值。表达水平低于噪声阈值的基因（例如 TPM < 1 或原始计数 < 5）可被过滤掉。
    2. 进行转录本定量，使用 HTSeq-count 或 featureCounts 等程序将比对读段的原始计数汇总至各转录本序列。
    3. 使用 R 脚本 运行 主成分分析（PCA），以识别批次效应并评估给定数据集的质量分布图25。可采用不同指标间的皮尔逊相关系数进行样本相关性分析。
  4. 差异基因表达分析
    1. 使用 edgeR26,27 和/或 limma-Voom28 程序，在不同样本条件下进行基因差异分析，并采用 TPM、TMM、DESeq 或 UpperQuartile 等标准化方法。
    2. 建议至少运行两种差异分析软件工具，以获得两组差异表达基因（DEGs）列表进行比较，从而确定最终的 DEGs，以提高检测的灵敏度和准确性。
  5. 基因集富集与通路分析
    1. 基于差异表达基因（DEGs）列表中转录本的排序，进行 基因集富集分析（GSEA）29,30，以判断 DEGs 在不同生物学条件下是否表现出统计学显著且一致的变化趋势。
    2. 利用 Gene Ontology31、DAVID32,33 或其他可用软件工具进行功能分析。

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结果

上述方法应用于67份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，这些样本在不同条件下储存了7至32年（中位储存时间为17.5年）。本研究展示的数据集及分析结果此前已在Zhao等人的研究中描述并发表11。在按照前述方法检查样本质量时（即图2中的示例图谱），发现DV100比DV200更具实用性，因其对高度降解RNA样本中小片段比例的测量更为敏感。

在给定的样本集中，少于10%的样本（67个中有7个）的DV200超过Illumina推荐的30%阈值34。约26%的样本（67个中有19个）DV100 > 60%（即生成高质量测序数据的可能性较高），40%（67个中有27个）的DV100处于40%–60%范围内（即结果可接受，但生成高质量测序数据的可能性较低），约10%（67个中有7个）的DV100 < 40%（即...

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讨论

本文所述方法概述了从FFPE-RNA样本中获得高质量测序数据所需的主要步骤。使用该方法时需考虑的关键要点包括：（1）在RNA提取后，应尽可能通过减少样本操作以及冻融循环次数来保护RNA完整性；分装保存用于质控的等分试样非常有帮助。（2）应根据具体的样本集选择最合适的质控指标；RIN值和DV200通常不适用于高度降解的样本，而DV100可能是评估特定样本集质量的更优指标。（3）对于降解程度较高的样本，建议使用较高的起始样本量；较高的输入量有助于提高最终文库的多样性并降低重复率，从而提升数据质量。由于FFPE-RNA样本中的RNA普遍存在严重降解且对酶反应具有抗性，因此并非所有RNA都可用于后续实验，这些效应在FFPE-RNA样本中比在新鲜冷冻RNA样本中更为显著。（4）在逆转录步骤中应采用随机引物而非寡核苷酸dT或特异性序列作为引物；除非特异性探针组能够覆盖所有目标转录本的尽可能多的序列，否则使用随机引物是确保最大限度地将转录本（或其片段）转化为cDNA的稳妥选择。因此，与依赖poly-A尾存在的mRNA建库方法相比，总RNA文库制备方法更适用于降解样本。（5）通过定量实时PCR（qPCR）对文...

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披露

本工作由美国国家癌症研究所（NCI）和美国国立卫生研究院（NIH）资助。Leidos Biomedical Research, Inc. 是癌症研究弗雷德里克国家实验室的运营与技术支撑承包商，该实验室由 NIH 全额资助。部分作者（YZ, MM, KT, YL, JS, BT）隶属于 Leidos Biomedical Research, Inc.，但所有作者的研究经费均由国家癌症研究所全额提供，包括作者的薪酬和研究材料费用。Leidos Biomedical Research, Inc. 未为作者（YZ, MM, KT, YL, JS, BT）提供薪酬或本研究所需的材料，也未参与研究设计、数据收集、分析、发表决定或稿件撰写过程。

致谢

我们衷心感谢美国国家癌症研究所癌症控制与人口科学部的 Danielle Carrick 博士（Dr. Danielle Carrick）的持续帮助，特别是她启动了本研究，为我们提供了样本，并在数据分析过程中提出了宝贵的建议。我们诚挚感谢弗雷德里克国家癌症研究实验室 CCR 测序中心全体成员在样本制备和测序过程中提供的协助，特别感谢 Brenda Ho 在样本质量控制方面的帮助、Oksana German 在文库质量控制方面的支持，以及 Tatyana Smirnova 在测序仪运行中的贡献。我们还要感谢测序中心生物信息学小组的 Tsai-wei Shen 和 Ashley Walton 在数据分析及 RNA-seq 分析流程实施方面提供的帮助。同时，我们感谢 CCBR 和 NCBR 在 RNaseq 分析流程及最佳实践制定方面给予的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2100 生物分析仪安捷伦G2939BA
安捷伦 DNA 7500 试剂盒安捷伦5067-1506
安捷伦高灵敏度DNA试剂盒安捷伦5067-4626
安捷伦 RNA 6000 纳米试剂盒安捷伦5067-1511
AllPrep DNA/RNA FFPE 试剂盒Qiagen80234
CFX96 Touch 系统伯乐（Bio-Rad）1855195
Illumina v2文库定量试剂盒KapaBiosystemsKK4824
NEBNext Ultra II 定向RNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）新英格兰生物实验室E7765Shttps://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit
NEBNext rRNA 耗竭试剂盒（人/小鼠/大鼠）新英格兰生物实验室E6310L
NextSeq 500 测序系统IlluminaSY-415-1001NextSeq 500 系统指南：https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf
NextSeq PhiX 对照试剂盒IlluminaFC-110-3002
NSQ 500/550 高输出 KT v2.5（150 CYS）Illumina20024907
10X Genomics 磁力分离器10X Genomics120250
旋转多管混合仪VWR13916-822
C1000 Touch 梯度PCR仪Bio-Rad1851197
测序试剂盒Illumina20024907
流动池组件Illumina20024907
缓冲液盒和试剂盒Illumina20024907
0.2N 氢氧化钠溶液默克生命科学SX0607D-6
1.0 M TRIS-HCl 缓冲液，pH 7.0Fisher Scientific50-151-871

参考文献

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