本方法介绍了如何提高从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）RNA样本中获得的测序数据的质量和数量。我们描述了更准确评估FFPE-RNA样本质量的方法、测序文库的制备步骤，以及对FFPE-RNA样本数据进行分析的流程。
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本文内容
摘要
摘要
通过RNA测序（RNA-seq）进行基因表达分析，能够对临床样本提供独特的见解，有助于揭示多种疾病的发病机制以及耐药性或易感性的分子基础。然而，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织虽然是临床标本中保存组织形态最常用的方法，却并非基因表达谱分析的理想材料。此类样本提取的RNA通常存在降解、断裂和化学修饰等问题，导致所构建的测序文库质量不佳，进而产生低质量的测序数据，可能无法可靠地用于基因表达分析和突变检测。为了最大限度地利用FFPE样本并从低质量RNA样本中获得尽可能优质的数据，在实验设计、测序文库构建以及数据分析过程中必须采取一系列必要的预防措施。这包括采用适当的指标进行精确的样本质量控制（QC），选择适用于各步骤的最佳文库构建方法，并进行严谨的文库质量评估。此外，在序列数据分析过程中，正确选用软件工具和参数至关重要，以识别RNA-seq数据中的技术假象，过滤污染序列和低质量读段，评估基因覆盖的均匀性，并衡量生物学重复样本间基因表达谱的可重复性。这些步骤可确保对高度异质性的RNA样本进行高准确性与高可重复性的表达谱分析。本文将详细介绍样本质量控制、文库制备与质控、测序及数据分析的各个步骤，以帮助提高从低质量RNA（如FFPE组织来源的RNA）中获取的可用数据量。
引言
新一代测序技术的应用使我们能够从各类样本中获取大量信息。然而，对于陈旧或保存不佳的样本，常规的测序数据生成方法往往难以奏效，通常需要对已建立的实验方案进行修改。福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织即属于此类广泛用于临床标本的样本类型1,2,3。尽管FFPE保存方法可维持组织形态，但其中的核酸通常存在不同程度的损伤和降解，导致难以获取可能揭示多种疾病分子机制的重要基因组信息。
通过RNA测序生成的基因表达数据在研究疾病和抗性机制方面通常具有重要作用，并可补充DNA突变分析。然而，RNA更容易降解，因此从FFPE组织中获得准确的基因表达数据更具挑战性。此外，由于测序技术的广泛应用和低成本是相对近期的发展，较早的样本通常未在保持RNA完整性的条件下储存。FFPE样本存在的一些问题包括：因包埋于石蜡中导致RNA降解、RNA的化学修饰引起片段化或对测序所需的酶促反应产生抗性，以及poly-A尾的丢失，从而限制了oligo-dT作为逆转录酶引物的应用4。另一个挑战是在非理想条件下对FFPE样本进行处理或储存，可能导致组织中如RNA等不稳定分子进一步降解5。这一点对于那些在采集时尚未预见到将进行RNA测序基因表....
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方案
1. RNA 定量与质量评估
- 根据预定义的标准选择FFPE样本，并使用适当的方法提取RNA（例如，FFPE-核酸提取试剂盒，材料表）。
注意：目前有多种可用于FFPE-RNA提取的方法，包括较新的显微切割技术，这些方法可在使用极少组织的情况下提取出高质量的RNA12,13,14。 - 在所有操作阶段均需格外注意保持RNA的完整性。这包括使用无RNase的去离子水、无RNase的塑料耗材，并使用RNase去污染试剂清洁所有接触FFPE组织块的仪器。
- 处理RNA时应始终小心操作，并在未特别说明的情况下将其置于冰上，以尽量减少降解。
- 若样本量充足，应从FFPE组织块的多个区域分别提取RNA，以尽可能生成生物学重复样本。对于部分RNA产量充足的样本，可将提取的RNA分为两份，作为技术重复进行处理。
- 如有可能，在提取后单独保留少量样本用于质量控制（即QC分装样本），以避免因反复操作和冻融循环导致RNA降解。
- 使用RNA质量控制系统（例如，Agilent Bioanalyzer系统配合RNA Nano芯片，材料表）按照制造商说明书检测RNA质量（建议使用QC分....
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结果
上述方法应用于67份福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，这些样本在不同条件下储存了7至32年（中位储存时间为17.5年）。本研究展示的数据集及分析结果此前已在Zhao等人的研究中描述并发表11。在按照前述方法检查样本质量时（即图2中的示例图谱），发现DV100比DV200更具实用性，因其对高度降解RNA样本中小片段比例的测量更为敏感。
在给定的样本集中，少于10%的样本（67个中有7个）的DV200超过Illumina推荐的30%阈值34。约26%的样本（67个中有19个）DV100 > 60%（即生成高质量测序数据的可能性较高），40%（67个中有27个）的DV100处于40%–60%范围内（即结果可接受，但生成高质量测序数据的可能性较低），约10%（67个中有7个）的DV100 < 40%（即.......
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讨论
本文所述方法概述了从FFPE-RNA样本中获得高质量测序数据所需的主要步骤。使用该方法时需考虑的关键要点包括：（1）在RNA提取后，应尽可能通过减少样本操作以及冻融循环次数来保护RNA完整性；分装保存用于质控的等分试样非常有帮助。（2）应根据具体的样本集选择最合适的质控指标；RIN值和DV200通常不适用于高度降解的样本，而DV100可能是评估特定样本集质量的更优指标。（3）对于降解程度较高的样本，建议使用较高的起始样本量；较高的输入量有助于提高最终文库的多样性并降低重复率，从而提升数据质量。由于FFPE-RNA样本中的RNA普遍存在严重降解且对酶反应具有抗性，因此并非所有RNA都可用于后续实验，这些效应在FFPE-RNA样本中比在新鲜冷冻RNA样本中更为显著。（4）在逆转录步骤中应采用随机引物而非寡核苷酸dT或特异性序列作为引物；除非特异性探针组能够覆盖所有目标转录本的尽可能多的序列，否则使用随机引物是确保最大限度地将转录本（或其片段）转化为cDNA的稳妥选择。因此，与依赖poly-A尾存在的mRNA建库方法相比，总RNA文库制备方法更适用于降解样本。（5）通过定量实时PCR（qPCR）对文.......
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披露
本工作由美国国家癌症研究所（NCI）和美国国立卫生研究院（NIH）资助。Leidos Biomedical Research, Inc. 是癌症研究弗雷德里克国家实验室的运营与技术支撑承包商，该实验室由 NIH 全额资助。部分作者（YZ, MM, KT, YL, JS, BT）隶属于 Leidos Biomedical Research, Inc.，但所有作者的研究经费均由国家癌症研究所全额提供，包括作者的薪酬和研究材料费用。Leidos Biomedical Research, Inc. 未为作者（YZ, MM, KT, YL, JS, BT）提供薪酬或本研究所需的材料，也未参与研究设计、数据收集、分析、发表决定或稿件撰写过程。
致谢
我们衷心感谢美国国家癌症研究所癌症控制与人口科学部的 Danielle Carrick 博士（Dr. Danielle Carrick）的持续帮助，特别是她启动了本研究，为我们提供了样本，并在数据分析过程中提出了宝贵的建议。我们诚挚感谢弗雷德里克国家癌症研究实验室 CCR 测序中心全体成员在样本制备和测序过程中提供的协助，特别感谢 Brenda Ho 在样本质量控制方面的帮助、Oksana German 在文库质量控制方面的支持，以及 Tatyana Smirnova 在测序仪运行中的贡献。我们还要感谢测序中心生物信息学小组的 Tsai-wei Shen 和 Ashley Walton 在数据分析及 RNA-seq 分析流程实施方面提供的帮助。同时，我们感谢 CCBR 和 NCBR 在 RNaseq 分析流程及最佳实践制定方面给予的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2100 生物分析仪 | 安捷伦 | G2939BA | |
| 安捷伦 DNA 7500 试剂盒 | 安捷伦 | 5067-1506 | |
| 安捷伦高灵敏度DNA试剂盒 | 安捷伦 | 5067-4626 | |
| 安捷伦 RNA 6000 纳米试剂盒 | 安捷伦 | 5067-1511 | |
| AllPrep DNA/RNA FFPE 试剂盒 | Qiagen | 80234 | |
| CFX96 Touch 系统 | 伯乐（Bio-Rad） | 1855195 | |
| Illumina v2文库定量试剂盒 | KapaBiosystems | KK4824 | |
| NEBNext Ultra II 定向RNA文库构建试剂盒（适用于Illumina） | 新英格兰生物实验室 | E7765S | https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit |
| NEBNext rRNA 耗竭试剂盒（人/小鼠/大鼠） | 新英格兰生物实验室 | E6310L | |
| NextSeq 500 测序系统 | Illumina | SY-415-1001 | NextSeq 500 系统指南：https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf |
| NextSeq PhiX 对照试剂盒 | Illumina | FC-110-3002 | |
| NSQ 500/550 高输出 KT v2.5（150 CYS） | Illumina | 20024907 | |
| 10X Genomics 磁力分离器 | 10X Genomics | 120250 | |
| 旋转多管混合仪 | VWR | 13916-822 | |
| C1000 Touch 梯度PCR仪 | Bio-Rad | 1851197 | |
| 测序试剂盒 | Illumina | 20024907 | |
| 流动池组件 | Illumina | 20024907 | |
| 缓冲液盒和试剂盒 | Illumina | 20024907 | |
| 0.2N 氢氧化钠溶液 | 默克生命科学 | SX0607D-6 | |
| 1.0 M TRIS-HCl 缓冲液，pH 7.0 | Fisher Scientific | 50-151-871 |
参考文献
- Carrick, D. M., et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue. PLoS One. 10 (7), 0127353(2015).
- Hedegaard, J., et al.
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