本文介绍了一种原位趋化性检测方法的实验方案，这是一种新近开发的微流控装置，可实现对微生物行为在自然环境中的直接研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
微生物行为，如运动性和趋化性（细胞根据化学梯度改变其运动方向的能力），在细菌和古菌域中广泛存在。在空间异质环境中，趋化性可显著提升微生物获取资源的能力。此外，趋化性在共生相互作用、疾病过程以及生物地球化学循环等全球性过程中也发挥着关键作用。然而，目前的研究技术主要局限于实验室环境，难以在野外条件下应用。本文介绍了一种原位趋化性检测（in situ chemotaxis assay, ISCA）的逐步操作方案，该装置可直接在自然环境中对微生物趋化性进行可靠检测。ISCA 是一种微流控装置，包含一个由20个孔组成的阵列，可装载感兴趣的化学物质。当装置被部署于水体环境中后，化学物质从孔中扩散，形成浓度梯度，微生物通过趋化性感知并响应这些梯度，游动进入孔内。随后可采集孔内物质，用于（1）通过流式细胞术定量分析微生物对特定化合物的趋化响应强度，（2）分离和培养具有响应性的微生物，以及（3）利用分子生物学技术鉴定响应微生物的种类及其基因组潜力。ISCA 是一种灵活的平台，适用于任何含有水相的系统，包括海洋、淡水和土壤环境。
引言
多种微生物利用运动性和趋化性来利用斑块状的营养环境、寻找宿主或避开有害条件1,2,3这些微生物行为反过来会影响化学转化的速率4 并促进陆地、淡水和海洋生态系统中的共生关系2,5.
过去60年来，趋化性在实验室条件下得到了广泛研究6。首个用于研究趋化性的定量方法是毛细管实验，该方法将装有潜在趋化吸引物的毛细管浸入细菌悬液中6。化学物质从管中扩散形成浓度梯度，具有趋化性的细菌会响应此梯度而向管内迁移7。自毛细管实验发展以来——该方法至今仍被广泛使用——人们已开发出许多其他技术，以在日益可控的物理和化学条件下研究趋化性，其中最新的方法涉及微流控技术的应用8,9,10。
微流控技术结合高速视频显微镜，能够追踪单个细胞在精确控制的浓度梯度下的行为反应。尽管这些技术极大地加深了我们对趋化性的理解，但其应用一直局限于实验室环境，难以直接应用于自然生态系统的野外研究。因此，目前尚未对天然细菌群落在自然生态系统中利用趋化性的能力进行考察；这导致当前关于趋化性潜在生态重要性的认识主要基于人工实验室条件以及少数在实验室培养的细菌分离株。最新开发的ISCA克服了这些局限性11。
ISCA 基于毛细管实验的通用原理，但采用了现代微加工技术，提供了一个高度可重复、易于部署的实验平台，用于量化自然环境中微生物对目标化合物的趋化性。该装置还可通过直接分离或分子生物学技术，实现趋化性微生物的鉴定与表征。尽管首个可用装置为自行制备，由玻璃和聚二甲基硅氧烷（PDMS）构成11，但最新的注塑成型版本则采用聚碳酸酯材料，并通过高度标准化的制造工艺生产（如需了解该装置最新版本的相关信息，可联系通讯作者）。
ISCA 的大小与信用卡相同，由分布在 5×4 阵列中的 20 个孔组成，每个孔通过一个直径为 800 µm 的小孔口与外部水生环境相连（图 1）。将潜在的化学引诱剂加入孔中后，其会通过孔口扩散到环境中，趋化性微生物则会通过孔口游动进入孔内作为响应。由于多种因素可能影响 ISCA 实验在自然环境中的结果，本逐步操作方案将帮助新用户克服潜在困难，实现有效的野外部署。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
建议在开展野外实验前完成第1部分，以优化实验结果。
1. 实验室优化
注意：优化步骤中所述体积适用于单个ISCA（由20个孔组成）。
- 目标化学物质的制备
注意：每种趋化剂的最佳浓度通常需要在野外部署前通过实验室条件确定。化学物质的浓度场会随着距离源（ISCA小孔）的距离增加而降低，这意味着微生物在环境中所接触到的浓度将低于装置内部的浓度。ISCA小孔中使用的最佳浓度取决于趋化剂的扩散速率。如果小孔中的浓度过低（接近微生物的检测限），则不会观察到正向趋化性。相反，如果小孔中的浓度过高，则其周围局部环境中的浓度也会较高，导致微生物聚集在ISCA小孔上方而非进入小孔内部。因此，应对每种化合物在实验室条件下进行系列稀释实验，以确定适用于野外部署的最佳浓度。理想情况下，还应在野外测试一定浓度范围，以验证实验室结果。- 准备2.5 L含有适当盐浓度的适宜培养基（例如磷酸盐缓冲液[PBS]或人工海水）。使用蠕动泵或真空泵通过0.2 µm滤膜过滤培养基，并进行高压灭菌。
- 在1 mL无菌培养基中配制10 mM的趋化剂溶液。使用0.2 µm注射器滤膜过滤趋化剂溶液，以去除颗粒物和潜在污染物。
注意：理想情况下，最终溶液中除趋化剂外不应含有其他有机化合物。
- 通过系列稀释确定浓度范围
- 将过滤后的趋化剂储备液进行系列稀释，例如从10 mM稀释至100 µM。
注意：每个测试浓度至少需要0.7 mL的终体积。
- 将过滤后的趋化剂储备液进行系列稀释，例如从10 mM稀释至100 µM。
- 加载ISCA
- 用过滤后的趋化剂填充1 mL注射器，并连接27 G针头。手持ISCA使小孔朝上，缓慢注入物质，直至小孔顶部出现一小滴液滴。
注意：1）每种稀释液或物质必须使用独立的注射器和针头，以防止交叉污染。2）这一小滴液滴非常重要，因为它可确保小孔内无气泡滞留，否则可能阻碍微生物通过小孔迁移。3）建议每种物质或浓度填满一整行（五个小孔），以为后续分析提供足够的最小体积。4）每个ISCA应设有一行作为阴性对照，填充经过滤的、用于悬浮微生物的培养基。该处理用于校正微生物随机运动进入ISCA小孔的影响，在数据分析时应以此对含趋化剂的处理组进行归一化处理。
- 用过滤后的趋化剂填充1 mL注射器，并连接27 G针头。手持ISCA使小孔朝上，缓慢注入物质，直至小孔顶部出现一小滴液滴。
- 实验室内的部署
- 前一晚，在5 mL培养物中加入1%海洋肉汤（用于海洋细菌）或1%溶菌肉汤（LB，用于淡水细菌）进行富集培养。
注意：可使用可运动的细菌分离株或天然细菌群落进行实验室部署。 - 在室温（RT）和180 rpm条件下培养12小时。12小时后，通过显微镜直接观察确认微生物群落具有运动能力。
- 在1,500 x g条件下离心10分钟，将菌体沉淀重悬于150 mL适当培养基中（比例为1/100），培养基可为过滤海水或过滤淡水。
- 在容量为200 mL的托盘平面上贴上两小块双面胶带（1 mL移液枪头盒的盖子尺寸理想，且易于高压灭菌）。将一个ISCA放置其上，确保牢固粘附。使用50 mL刻度移液管缓慢向部署托盘中加入细菌悬液。
注意：加液至ISCA完全浸没于约1–2 cm深的液体中。若使用多个托盘，应保持各托盘液体体积一致。 - 让ISCA静置孵育1小时，以允许细菌发生趋化作用。1小时后，使用50 mL刻度移液管非常轻柔地移除培养基，以尽量减少湍流。
- 从部署托盘中取出ISCA时避免接触上表面。使用移液器和一次性擦拭纸清除ISCA表面残留液体。
注意：在此过程中务必避免触碰小孔，因为压力变化可能导致外部环境中的细菌被吸入或排出小孔，从而影响小孔内细菌的密度和组成。
- 前一晚，在5 mL培养物中加入1%海洋肉汤（用于海洋细菌）或1%溶菌肉汤（LB，用于淡水细菌）进行富集培养。
- 样品回收
- 将ISCA小孔朝下持握，使用连接在1 mL注射器上的无菌27 G针头回收小孔中的液体体积。
注意：同一行（若含有相同物质）的样品可合并，获得约550 µL的工作样本。根据后续应用需求，可将该样本分装至不同试管中。 - 通过流式细胞术12分析样品，确定被各趋化剂浓度吸引的细菌数量。选择能够最大化趋化效应的趋化剂浓度用于后续野外部署。
- 将ISCA小孔朝下持握，使用连接在1 mL注射器上的无菌27 G针头回收小孔中的液体体积。
2. 野外部署的准备工作
注意：在部署之前，必须完成材料准备和流动阻尼 enclosure 的构建（第 2 节）。
- 材料准备
- 准备 表1 中列出的所有材料。
注意：材料用量适用于一次 ISCA 实验。
- 准备 表1 中列出的所有材料。
- 流阻尼外壳的构建与准备
注意：流阻尼外壳可最大限度减少不必要的湍流，否则这些湍流会阻碍源自 ISCA 的化学梯度的形成。- 使用激光切割机从 3 mm 厚的亚克力板上切割出部署外壳的各个部件。
注意：部件的设计文件可通过以下链接获取：<https://figshare.com/articles/Flow_damping_enclosure_for_ISCA_deployments/10630220>。 - 使用亚克力胶按照 图2 所示方式组装激光切割的部件。
注意：组装时需仔细操作。若存在孔洞或部件错位，部署时可能发生泄漏，直接影响数据质量。 - 将组装好的外壳静置过夜，使其充分干燥。
- 用去离子水清洗外壳。
- 通过向外壳内倒入去离子水来检查是否存在潜在泄漏。若发现任何接缝处泄漏，需补充亚克力胶进行密封，然后重复步骤 2.2.3–2.2.5。
- 在将用于固定 ISCA 的亚克力部件上攻出螺纹。可使用与安装螺丝直径和螺距匹配的丝锥完成此操作。
- 首先，将丝锥装入丝锥扳手中，然后将待攻丝的亚克力部件固定在台虎钳上。为获得最佳效果，请确保亚克力部件尽可能水平，并确保丝锥与亚克力部件表面垂直，开始顺时针旋转丝锥扳手，同时对丝锥施加轻微压力。
- 在亚克力部件中完成数圈完整旋转后，反向旋转（逆时针）四分之一圈，以清除丝锥上的亚克力碎屑。重复此过程，直至完成整个亚克力部件深度的攻丝。
- 最后，逆时针旋转退出丝锥，并用螺丝测试螺纹是否合格。
- 使用激光切割机从 3 mm 厚的亚克力板上切割出部署外壳的各个部件。
3. 野外操作步骤
- 水过滤
- 当准备开始实验时，从野外采样点采集水样。使用50 mL注射器和0.2 µm针头滤器将每台ISCA所需的5 mL水样过滤至50 mL锥形离心管中。
注意：每台ISCA的所有孔大约需要3 mL过滤水；但建议：1）每台设备过滤5 mL，以补偿四重过滤过程中的损失；2）保留部分滤液作为分装样品，用于流式细胞术和分子实验的阴性对照。 - 使用新的50 mL注射器，将滤液通过同一个0.2 µm亲水性GP滤筒连续过滤两次，收集至新的50 mL锥形离心管中；再使用新的50 mL注射器，通过0.02 µm针头滤器将滤液过滤至新的50 mL锥形管中。
注意：此四重过滤过程应几乎完全去除水中的所有微生物和颗粒物。最终滤液在使用前应远离任何热源。该水将用于重悬ISCA中使用的所有化学物质，且应保持与部署现场水体相同的温度。否则，ISCA孔与外部环境之间的温差可能引发对流流动。 - 使用滤液分装样品将所有目标趋化剂（通常为干燥状态）在15 mL锥形离心管中重悬至所需浓度。
- 使用10 mL注射器和0.2 µm针头滤器将重悬后的趋化剂过滤至无菌15 mL锥形离心管中，以去除不需要的颗粒或水不溶性化合物（如使用提取物）。
注意：应轻柔过滤，防止颗粒穿透滤膜。必须使用来自野外采样点的超滤水重悬趋化剂，而不能将其溶解于其他溶液中。使用现场水样至关重要，原因如下：（1）确保孔内盐浓度与周围环境水体一致，防止密度驱动流；（2）保证孔内外背景营养水平相等。
- 当准备开始实验时，从野外采样点采集水样。使用50 mL注射器和0.2 µm针头滤器将每台ISCA所需的5 mL水样过滤至50 mL锥形离心管中。
- ISCA填充
- 执行第1.3节操作以填充ISCA。
注意：建议每种物质填充一行（五个孔），即每台ISCA填充三种不同物质及一份超滤海水对照。
- 执行第1.3节操作以填充ISCA。
- 野外部署
- 将ISCA（图3A）拧紧至外壳的第9部件（图2K 和 图3B）。
注意：上述减流外壳可并排容纳两台ISCA，或在中心位置放置一台ISCA。 - 关闭外壳（图3C），并用胶带密封（图3D）。
注意：应避免产生褶皱，以确保完全密封。先密封所有侧面，然后（第二步）密封侧孔，这些孔将在采样结束时用于排水。顶部和底部的孔不得密封。切勿将ISCA倒置放置，否则含有趋化剂的孔中可能发生密度驱动流，从而影响孔内细胞数量。 - 由于外壳在部署期间必须保持稳定，建议使用弹力绳将其固定在人工结构上（例如浮筒、梯子）。
注意：可在浸入水中前，使用弹力绳将外壳固定在部署臂上（此处为带垂直平台的改良夹具）。或者，在浅层基质上可将外壳填充后加小重物固定。若计划在远洋水体中部署，可将外壳一侧连接带浮标的网具，另一侧连接潜水配重。 - 将外壳完全浸入水中以开始注水。注水过程中应牢固握住外壳，防止内部水流过度扰动。当水位上升至外壳顶部时，确保内部无空气滞留。
注意：若存在气泡，可轻轻倾斜外壳，使排气孔朝上，以便气泡逸出。 - 当外壳完全充满水后，使用两个塞子密封底部和顶部的孔，塞子可由硅胶或橡胶制成，也可使用20 µL移液器吸头末端密封而成（图4）。
注意：此步骤可防止采样期间外壳内部产生水流。 - 将ISCA原位放置进行采样，持续1–3小时。
注意：最佳部署时间主要取决于水温及细菌群落的倍增时间。当水温高于20 °C时，不建议部署超过1小时，因为在1.5–2.0小时后，含趋化剂的孔中可能发生细胞分裂。然而，可在正式实验前通过向天然群落添加加载的化学物质并随时间定量细胞数量，预先测试最佳部署时间。 - 将外壳从水中取出，放置于容器上方，以便排出外壳内的水。
- 非常轻柔地移除前部孔洞上方胶带的上半部分。
注意：水流排出速度应控制为滴落状。每次处理一个孔，从外壳顶部到底部依次进行。完全排空外壳大约需要10–15分钟。 - 当水位降至ISCA顶部以下时，移除底部塞子，排尽剩余水分。
- 在ISCA仍固定于外壳时，使用1 mL移液器小心吸除ISCA顶部积聚的水分。
- 取下ISCA时避免触碰其上表面，并使用一次性擦拭纸清除表面残留液体。
注意：此过程中切勿触碰进样口，因为压力变化可能导致大量细菌进入或离开孔内，从而影响细菌计数结果。 - 通过重复步骤1.5.1从ISCA中回收样品。
- 将ISCA（图3A）拧紧至外壳的第9部件（图2K 和 图3B）。
4. 下游应用
注意：体积基于 550 µL 样品（ISCA 的一行）给出。
- 使用戊二醛（终浓度为 2%）固定 100 µL 孔内物质，用于流式细胞术定量分析每种趋化吸引物的趋化作用。
注意：样品需置于冰上（或 4 °C）保存，并于同一天内完成分析。若当天无法完成分析，可在固定后使用液氮速冻样品。流式细胞术是定量 ISCA 微孔中细胞数量的推荐方法，因其操作简便、快速且准确12。 - 将 300 µL 孔内物质在液氮中速冻，用于后续 DNA 提取与分析11。
注意：样品应保存于 -80 °C，直至进行分析。 - 取 90 µL 孔内物质加入 10 µL TE-甘油缓冲液中，随后速冻样品，用于单细胞基因组学分析13。
- 取 10–20 µL 样品涂布于含有目标培养基的琼脂平板上，用于细菌分离。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本部分介绍了利用ISCA测试海洋微生物对谷氨酰胺浓度梯度的趋化反应的实验结果，谷氨酰胺是一种已知可吸引土壤细菌的氨基酸14。在实验室测试中引发最强趋化反应的谷氨酰胺浓度被用于在海洋环境中进行趋化性检测。
为进行实验室测试，采用简单的营养添加法对采自澳大利亚悉尼沿海水域的海水微生物群落进行运动细胞富集4，具体步骤如1.4所述。将谷氨酰胺用超滤海水进行系列稀释，获得终浓度范围为10 mM至100 µM的溶液。本实验同时部署了五个ISCA重复装置，每个装置包含三种不同浓度的谷氨酰胺（每行一种浓度）以及一行过滤海水对照。部署1小时后，将每个ISCA中相同谷氨酰胺浓度的各行内容物合并，得到约550 µL的工作样品。随后用戊二醛（终浓度2%）固定该样品，并通过流式细胞术定量检测响应细菌的数量。
简而言之，细菌丰度的定量方法如下：1）使用绿色荧光DNA染料对细胞进行染色；2）采用超滤去离子水作为鞘液，通过流式细胞仪进行分析。对每个样品记录前向散射...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在水生微生物的尺度上，环境远非均质，通常表现出物理/化学梯度，这些梯度塑造了微生物群落的结构1,15。运动性微生物利用行为（即趋化性）的能力有助于在这些异质性微环境中觅食1。直接在自然环境中研究趋化性，有助于识别重要的种间相互作用和化学偏好，从而揭示特定微生物对生物地球化学过程的贡献。本方案介绍在环境中部署ISCA11，以促进原位趋化性研究的可重复性。
使用ISCA表明，谷氨酰胺在实验室条件和野外条件下均能引发正向趋化反应。谷氨酰胺在野外的ISCA部署所产生的趋化反应低于实验室条件（图5）。此前已在实验室与野外实验之间观察到类似的模式11。这可归因于环境中可运动细胞的比例低于实验室检测中所用的富集群落或单一可运动分离株。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究部分由戈登与贝蒂·摩尔基金会海洋微生物学计划资助，J.R.S. 和 R.S. 获得资助号 GBMF3801，R.S. 获得研究员奖（GBMF3783）；J.B.R. 获得澳大利亚研究理事会博士后奖学金（DE160100636）；B.S.L. 获得西蒙斯基金会奖项（594111）；R.S. 还获得西蒙斯基金会资助（542395），作为“微生物生态系统原理”（PriME）合作项目的一部分。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙烯酸胶 | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| 丙烯酸板 | McMaster-Carr | 8505K725 | 或其他公司 |
| 胶带 | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic 胶带 |
| 高压灭菌器 | Systec | D-200 | 或其他公司 |
| 台式离心机 | Fisher Scientific | 75002451 | 或其他公司 |
| 弹力绳 | Paracord Planet | 667569184000 | 或其他公司 |
| 离心管 - 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf 管 |
| 锥形离心管 - 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon 管 |
| 锥形离心管 - 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon 管 |
| 部署臂 | Irwin | 1964719 | 或其他公司 |
| 部署舱塞 | Fisher Scientific | 21-236-4 | 参见文稿中的替代选项 |
| 一次性擦拭纸 | Kimtech - Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| 流式细胞仪 | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| 戊二醛 25% | Sigma Aldrich | G5882 | 或其他公司 |
| 绿色荧光染料 | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I - 最终稀释比例 1:10,000 |
| 亲水性 GP 滤膜筒 - 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex 滤器 |
| 原位趋化性分析（ISCA） | - | - | 请联系通讯作者 |
| 激光切割机 | Epilog Laser | Fusion pro 32 | 或其他公司 |
| LB 培养基（Luria Bertani Broth） | Sigma Aldrich | L3022 | 或其他公司 |
| 2216 海洋培养基 | VWR | 90004-006 | Difco |
| 尼龙槽头平头螺钉 | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| 移液器套装 | Fisher Scientific | 05-403-151 | 或其他公司 |
| 移液器吸头 - 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | 或其他公司 |
| 移液器吸头 - 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | 或其他公司 |
| 移液器吸头 - 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | 或其他公司 |
| 海水盐 | Sigma Aldrich | S9883 | 用于配制人工海水 |
| 血清移液管 - 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | 或其他公司 |
| 注射器滤器 - 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop 滤器 |
| 注射器滤器 - 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | 或其他公司 |
| 27G 注射器针头 | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| 注射器 - 1 mL | Codau | 329650 | 胰岛素 Luer U-100 |
| 注射器 - 10 mL | BD | 303134 | 或其他公司 |
| 注射器 - 50 mL | BD | 15899152 | 或其他公司 |
| 试管架 - 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | 或其他公司 |
| 试管架 - 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | 或其他公司 |
| 未涂层高速钢通用丝锥 | McMaster-Carr | 8305A77 | 或其他公司 |
| 真空滤器 - 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop 滤器 |
参考文献
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821(2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
