原位趋化性实验检测水生生态系统中微生物行为

摘要

本文介绍了一种原位趋化性检测方法的实验方案，这是一种新近开发的微流控装置，可实现对微生物行为在自然环境中的直接研究。

摘要

微生物行为，如运动性和趋化性（细胞根据化学梯度改变其运动方向的能力），在细菌和古菌域中广泛存在。在空间异质环境中，趋化性可显著提升微生物获取资源的能力。此外，趋化性在共生相互作用、疾病过程以及生物地球化学循环等全球性过程中也发挥着关键作用。然而，目前的研究技术主要局限于实验室环境，难以在野外条件下应用。本文介绍了一种原位趋化性检测（in situ chemotaxis assay, ISCA）的逐步操作方案，该装置可直接在自然环境中对微生物趋化性进行可靠检测。ISCA 是一种微流控装置，包含一个由20个孔组成的阵列，可装载感兴趣的化学物质。当装置被部署于水体环境中后，化学物质从孔中扩散，形成浓度梯度，微生物通过趋化性感知并响应这些梯度，游动进入孔内。随后可采集孔内物质，用于（1）通过流式细胞术定量分析微生物对特定化合物的趋化响应强度，（2）分离和培养具有响应性的微生物，以及（3）利用分子生物学技术鉴定响应微生物的种类及其基因组潜力。ISCA 是一种灵活的平台，适用于任何含有水相的系统，包括海洋、淡水和土壤环境。

引言

多种微生物利用运动性和趋化性来利用斑块状的营养环境、寻找宿主或避开有害条件^1,2,3这些微生物行为反过来会影响化学转化的速率⁴ 并促进陆地、淡水和海洋生态系统中的共生关系^2,5.

过去60年来，趋化性在实验室条件下得到了广泛研究⁶。首个用于研究趋化性的定量方法是毛细管实验，该方法将装有潜在趋化吸引物的毛细管浸入细菌悬液中⁶。化学物质从管中扩散形成浓度梯度，具有趋化性的细菌会响应此梯度而向管内迁移⁷。自毛细管实验发展以来——该方法至今仍被广泛使用——人们已开发出许多其他技术，以在日益可控的物理和化学条件下研究趋化性，其中最新的方法涉及微流控技术的应用^8,9,10。

方案

建议在开展野外实验前完成第1部分，以优化实验结果。

1. 实验室优化

注意：优化步骤中所述体积适用于单个ISCA（由20个孔组成）。

1. 目标化学物质的制备
   注意：每种趋化剂的最佳浓度通常需要在野外部署前通过实验室条件确定。化学物质的浓度场会随着距离源（ISCA小孔）的距离增加而降低，这意味着微生物在环境中所接触到的浓度将低于装置内部的浓度。ISCA小孔中使用的最佳浓度取决于趋化剂的扩散速率。如果小孔中的浓度过低（接近微生物的检测限），则不会观察到正向趋化性。相反，如果小孔中的浓度过高，则其周围局部环境中的浓度也会较高，导致微生物聚集在ISCA小孔上方而非进入小孔内部。因此，应对每种化合物在实验室条件下进行系列稀释实验，以确定适用于野外部署的最佳浓度。理想情况下，还应在野外测试一定浓度范围，以验证实验室结果。
   1. 准备2.5 L含有适当盐浓度的适宜培养基（例如磷酸盐缓冲液[PBS]或人工海水）。使用蠕动泵或真空泵通过0.2 µm滤膜过滤培养基，并进行高压灭菌。
   2. 在1 mL无菌培养基中配制10 mM的趋化剂溶液。使用0.2 µm注射器滤膜过滤趋化剂溶液，以去除颗粒物和潜在污染物。
      注意：理想情况下，最终溶液中除趋化剂外不应含有其他有机化合物。
2. 通过系列稀释确定浓度范围
   ....

结果

本部分介绍了利用ISCA测试海洋微生物对谷氨酰胺浓度梯度的趋化反应的实验结果，谷氨酰胺是一种已知可吸引土壤细菌的氨基酸¹⁴。在实验室测试中引发最强趋化反应的谷氨酰胺浓度被用于在海洋环境中进行趋化性检测。

为进行实验室测试，采用简单的营养添加法对采自澳大利亚悉尼沿海水域的海水微生物群落进行运动细胞富集⁴，具体步骤如1.4所述。将谷氨酰胺用超滤海水进行系列稀释，获得终浓度范围为10 mM至100 µM的溶液。本实验同时部署了五个ISCA重复装置，每个装置包含三种不同浓度的谷氨酰胺（每行一种浓度）以及一行过滤海水对照。部署1小时后，将每个ISCA中相同谷氨酰胺浓度的各行内容物合并，得到约550 µL的工作样品。随后用戊二醛（终浓度2%）固定该样品，并通过流式细胞术定量检测响应细菌的数量。

简而言之，细菌丰度的定量方法如下：1）使用绿色荧光DNA染料对细胞进行染色；2）采用超滤去离子水作为鞘液，通过流式细胞仪进行分析。对每个样品记录前向散射.......

讨论

在水生微生物的尺度上，环境远非均质，通常表现出物理/化学梯度，这些梯度塑造了微生物群落的结构^1,15。运动性微生物利用行为（即趋化性）的能力有助于在这些异质性微环境中觅食¹。直接在自然环境中研究趋化性，有助于识别重要的种间相互作用和化学偏好，从而揭示特定微生物对生物地球化学过程的贡献。本方案介绍在环境中部署ISCA¹¹，以促进原位趋化性研究的可重复性。

使用ISCA表明，谷氨酰胺在实验室条件和野外条件下均能引发正向趋化反应。谷氨酰胺在野外的ISCA部署所产生的趋化反应低于实验室条件（图5）。此前已在实验室与野外实验之间观察到类似的模式¹¹。这可归因于环境中可运动细胞的比例低于实验室检测中所用的富集群落或单一可运动分离株。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酸胶	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
丙烯酸板	McMaster-Carr	8505K725	或其他公司
胶带	Scotch	3M 810	Scotch Magic 胶带
高压灭菌器	Systec	D-200	或其他公司
台式离心机	Fisher Scientific	75002451	或其他公司
弹力绳	Paracord Planet	667569184000	或其他公司
离心管 - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf 管
锥形离心管 - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon 管
锥形离心管 - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon 管
部署臂	Irwin	1964719	或其他公司
部署舱塞	Fisher Scientific	21-236-4	参见文稿中的替代选项
一次性擦拭纸	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
流式细胞仪	Beckman	C09756	CYTOFlex
戊二醛 25%	Sigma Aldrich	G5882	或其他公司
绿色荧光染料	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 最终稀释比例 1:10,000
亲水性 GP 滤膜筒 - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex 滤器
原位趋化性分析（ISCA）	-	-	请联系通讯作者
激光切割机	Epilog Laser	Fusion pro 32	或其他公司
LB 培养基（Luria Bertani Broth）	Sigma Aldrich	L3022	或其他公司
2216 海洋培养基	VWR	90004-006	Difco
尼龙槽头平头螺钉	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
移液器套装	Fisher Scientific	05-403-151	或其他公司
移液器吸头 - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	或其他公司
移液器吸头 - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	或其他公司
移液器吸头 - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	或其他公司
海水盐	Sigma Aldrich	S9883	用于配制人工海水
血清移液管 - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	或其他公司
注射器滤器 - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop 滤器
注射器滤器 - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	或其他公司
27G 注射器针头	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
注射器 - 1 mL	Codau	329650	胰岛素 Luer U-100
注射器 - 10 mL	BD	303134	或其他公司
注射器 - 50 mL	BD	15899152	或其他公司
试管架 - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	或其他公司
试管架 - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	或其他公司
未涂层高速钢通用丝锥	McMaster-Carr	8305A77	或其他公司
真空滤器 - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop 滤器