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方法文章

基于马铃薯病毒X的microRNA沉默技术（VbMS）在马铃薯中的应用

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DOI：

10.3791/61067

⸱

2020年5月11日

 ,  , 
1Texas A&M AgriLife Research Center at Dallas, Texas A&M University System, 2Department of Plant Pathology, Microbiology, Texas A&M University

本文内容

摘要

我们提供了一种基于马铃薯X病毒（PVX）的microRNA沉默（VbMS）系统的详细实验方案，用于在马铃薯中对内源性microRNA（miRNA）进行功能鉴定。将目标miRNA的靶标模拟物（TM）分子插入PVX载体中，并在马铃薯中瞬时表达，以实现对目标miRNA或miRNA家族的沉默。

摘要

基于病毒的 microRNA 沉默（VbMS）是一种用于植物中 microRNA（miRNA）功能表征的快速高效工具。VbMS 系统已开发并应用于多种植物物种，包括Nicotiana benthamiana、番茄、拟南芥、棉花，以及小麦和玉米等单子叶植物。本文中，我们描述了一种使用基于 PVX 的 VbMS 载体在马铃薯中沉默内源性 miRNA 的详细实验方案。为了降低特定 miRNA 的表达水平，需设计目标 miRNA 的模拟分子（target mimic，TM），将其插入植物病毒载体，通过Agrobacterium介导的侵染在马铃薯中表达，从而直接结合目标内源性 miRNA 并阻断其功能。

引言

植物微小RNA（miRNA）是一类长度为20–24个核苷酸、由细胞核编码的调控性RNA1，几乎参与调控植物所有生物学过程，包括生长与发育2,3、光合作用与代谢4,5,6,7、激素合成与信号传导8,9、生物与非生物胁迫响应10,11,12,13，以及营养与能量调控14,15。植物miRNA的调控作用具有高度程序化特征，通常在转录后水平通过切割靶标mRNA或抑制其翻译来实现。

在……方面已取得巨大进展 马铃薯中miRNA的鉴定、转录谱分析及靶基因预测16,17,18,19,20,21然而，由于缺乏高效且高通量的遗传学方法，植物（包括马铃薯）中miRNA的功能表征进展落后于其他生物。由于大多数miRNA属于具有显著遗传冗余的基因家族，因此通过标准的基因功能缺失分析来开展单个miRNA的功能研究具有较大挑战性。22此外，单个miRNA可以调控多个靶基因23 多个不同的miRNA可协同调节同一条分子通路24,25这些特性使得对特定miRNA或miRNA家族功能的表征变得困难。

对miRNA的功能分析在很大程度上依赖于功能获得（gain-of-function）方法，而这些方法存在明显的局限性。人工miRNA（amiRNA）技术利用内源性初级转录本（pri-miRNA）高效产生miRNA，从而抑制靶基因的表达26,27,28,29。然而，通过强组成型35S启动子进行激活标签（activation tagging）或miRNA过表达，常常导致miRNA表达水平显著升高，无法真实反映体内（in vivo）的生理状态，因此可能无法准确体现miRNA的内源性功能30。另一种替代策略是表达miRNA抗性的靶基因形式，即在结合位点和/或切割位点引入不可切割的突变31,32,33。但该方法也可能因转基因带来的技术性假象，导致对miRNA抗性靶基因所引发表型的误判。因此，对于这些功能获得研究所得出的结论应谨慎对待34。上述方法的另一主要局限在于其依赖遗传转化，该过程费时且劳动强度大。此外，依赖转基因的方法难以应用于难以转化的植物物种。因此，开发一种快速高效的基因功能缺失（loss-of-function）策略，对于揭示miRNA的功能至关重要 。

为了绕过转化程序的先决条件，病毒介导的microRNA沉默（VbMS）技术已通过将靶标模拟物（TM）策略与病毒来源的载体相结合而建立。在VbMS系统中，人工设计的TM分子由病毒骨架瞬时表达，为研究植物内源性miRNA的功能提供了一种高效、高通量且节省时间的工具35,36。VbMS最初在本氏烟（N. benthamiana）和番茄中利用烟草脆裂病毒（TRV）开发成功35,36,37，随后已扩展至拟南芥、棉花、小麦和玉米，采用的病毒表达系统包括马铃薯X病毒（PVX）38、棉花叶皱缩病毒（ClCrV）39、黄瓜花叶病毒（CMV）40,41,42、中国小麦花叶病毒（CWMV）43以及大麦条纹花叶病毒（BSMV）44,45。

马铃薯（Solanum tuberosum）是全球第四大重要的粮食作物，也是种植最广泛的非谷类作物，这主要归因于其高营养价值、高能量产出以及相对较低的投入需求46。马铃薯的多个特性使其成为一种具有吸引力的双子叶模式植物。它是一种通过营养繁殖的多倍体作物，具有较高的异交率、杂合性以及遗传多样性。然而，迄今为止，尚无利用病毒介导的微小RNA沉默（VbMS）技术对马铃薯中miRNA功能进行表征的报道。本文介绍了一种基于马铃薯X病毒（PVX）并经连接无关克隆（LIC）技术改造的VbMS方法，用于评估miRNA在马铃薯植株中的功能38。我们选择miR165/166家族来展示VbMS检测，因为miR165/166家族及其靶mRNA和III类同源异型域/亮氨酸拉链（HD-ZIP III）转录因子已被广泛研究22,47,48。HD-ZIP III基因是分生组织发育和器官极性的关键调控因子，抑制miR165/166功能会导致HD-ZIP III基因表达升高，从而引起多种发育缺陷，例如顶端优势减弱和叶片极性模式异常22,35,38,41。这些易于观察评分的发育表型与miRNA165/166的沉默密切相关，有助于准确评估基于PVX的VbMS检测的有效性。

本研究中，我们证明了基于PVX的VbMS系统能够有效阻断马铃薯中miRNA的功能。由于基于PVX的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统已在多个马铃薯品种中建立49,50,51,52，因此这种基于PVX的VbMS方法有望应用于多种二倍体和四倍体马铃薯物种。

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方案

1. 培养马铃薯植株。

  1. 在含MS培养基（Murashige和Skoog培养基）的培养管（25 × 150 mm）中扩增马铃薯离体植株 Gamborg 维生素（MS 基本盐混合物、Gamborg 维生素、30 g/L 蔗糖、3.5 g/L 琼脂，pH = 5.7）。将试管置于生长室中，温度为 20–22 °C，16小时光照/8小时黑暗光周期，光照强度120 µmol/m2∙s1.
    注意：新芽和根通常在1–2周内从植株中发育。每月用新鲜的MS/Gamborg维生素培养基对植株进行一次继代培养。
  2. 四周后，将体外培养的植株移栽至土壤中，并在温室条件下于20–22 °C，16小时光照/8小时黑暗光周期，光照强度120 µmol/m2∙s1.
    注意：新长出根系和叶片的植株适合移栽。移栽后的前3–4天内需保持植株湿润。

2. 构建VbMS载体。

  1. 设计并克隆短串联靶向模拟分子（STTM， 图1)22,53 针对目标miRNA。
    注意：根据实验数据或从 miRbase 数据库获取 miRNA 序列54,55,56,57,58,59本研究中使用的 miR166 序列此前已有描述60.
    1. 通过在miRNA反向互补序列的第10位对应位置插入错配序列（通常为5’-CTA-3’），设计TM模块th–11th miRNA的核苷酸
      注意：例如， Stu-miR160 序列是 5’-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCC-3’61，其中 10th–11th 核苷酸以粗体显示。其反向互补序列（脱氧核苷酸）为 5’-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3’，错配凸起插入位点以粗体显示。TM 分子序列（脱氧核苷酸）应为 5’-GGCATACAGG-CTA- GAGCCAGGCA-3’
    2. 设计用于克隆 STTM 片段的引物（图1使用含有48-nt间隔序列的DNA寡核苷酸作为PCR克隆的模板。上游引物包含LIC1接头（5’-CgACgACAAgACCgT-3’）、上述设计的TM分子的正向序列以及48-nt间隔序列的5’端部分序列（5’-GTTGTTGTTGTTATGGT-3’）。下游引物包含LIC2接头（5’-gAggAgAagAgCCgT-3’）、TM分子的反向互补序列以及48-nt间隔序列3’端序列的反向互补部分（5’-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3’）。
      注意：48-nt 间隔序列是 5’-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT-3’。例如，对于 STTM-miR160，正向引物应为 5’-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA- GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3’；反向引物应为 5’-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC病毒介导的 microRNA 沉默，植物功能基因组学，microRNA 靶标模拟，农杆菌浸润，PVX 载体，马铃薯，miRNA 功能研究CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3’图1).
    3. 扩增STTM片段，反应体系为50 μL µ使用合成的48-nt通用间隔序列作为模板，通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得L。
      1. 通过混合 0.5 µ每种引物各 1 μL（40 µM), 0.5 µ48-nt 间隔寡核苷酸的 L（40 µM), 5 µL 的 10x PCR 缓冲液，1 µL dNTP 混合物（各 10 mM），0.1 µL 高保真 DNA 聚合酶（10 U/µL），以及43 µL 的 ddH2O至总体积50 µL. 按照以下条件进行标准PCR扩增：94 °C 3分钟，32个循环：94 °C，45 秒，60 °C，45 秒，72 °60 秒，温度为 C
    4. 通过乙醇沉淀法纯化STTM片段。向PCR产物中加入2.5倍体积的乙醇和1/10倍体积的3 M醋酸钠（pH = 4.0），充分混匀后在14,000 x g 10 分钟。移除上清液，用 1 mL 70% 乙醇冲洗沉淀。干燥沉淀后，溶于 20 µL 的 ddH2O.
      注意：使用DNA电泳检测STTM PCR产物的扩增情况。
    5. 在冰上配制 T4 DNA 聚合酶反应体系，混合 2.5 µL 纯化的 STTM PCR 产物，0.5 µL 的 10× T4 DNA 聚合酶缓冲液，0.05 µ1 M 二硫苏糖醇（DTT）0.25 L µL of 100 mM dATP, 0.1 µL T4 DNA聚合酶（3 U/µ升）和1.6 µL 的 ddH2O至总体积5 µL. 37℃下孵育混合物 °C 下 15 分钟，然后在 75 °C孵育20分钟以灭活T4 DNA聚合酶。
  2. 制备基于PVX的VbMS载体。
    1. 消化 5 μPVX-LIC 质粒的克数38 2.5 µL of SmaI（20 U/µL）体积为 100 µL.
    2. 加入等体积的酚:氯仿:异丙醇（25:24:1，pH = 6.7/8.0）至消化后的PVX-LIC产物中，剧烈混匀。在14,000 x g 离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中。加入等体积的氯仿:异丙醇（24:1），剧烈涡旋振荡。在14,000 x g 10 分钟
      注意：PVX-LIC 载体含有用于克隆的 LIC 串联表达盒。PVX-LIC 载体的 LIC 串联表达盒包含一个 ccdB 基因和氯霉素抗性基因，需在 E. coli 菌株 DB3.1，使用含卡那霉素（50 μ克/升）和氯霉素（15 μg/L
    3. 将上清液转移至新的离心管中。加入2.5倍体积的乙醇和1/10倍体积的3 M醋酸钠（pH = 4.0），剧烈混匀。在14,000 x g 10 分钟后离心并弃去上清液。
    4. 用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，并剧烈涡旋振荡。在14,000 x g 10 分钟，弃去上清液。干燥沉淀，用 100 μL 溶解消化后的 PVX-LIC 质粒 µL 的 ddH2O.
    5. 在冰上配制 T4 DNA 聚合酶反应体系，混合 2.5 µL 已消化的 PVX-LIC 载体 DNA，0.5 µL 的 10× T4 DNA 聚合酶缓冲液，0.05 µ1 M DTT 溶液 0.25 L µL 的 100 mM dTTP，以及 0.1 µL T4 DNA聚合酶（3 U/µL）总体积为5 µL. 37℃下孵育混合物 °C 反应 15 分钟，然后在 75 ℃ 处理产物 °C孵育20分钟以灭活T4 DNA聚合酶。
  3. 使用LIC反应将STTM序列克隆至PVX-LIC载体中。将经T4 DNA聚合酶处理的STTM PCR产物（5 µL）以及经T4 DNA聚合酶处理的PVX-LIC质粒（5 µL）。70℃孵育 °C 为 5 分钟，冷却至22 °以 0.1 的速率升温至 C °℃，并保持在22℃ °使用PCR仪在C下反应30分钟。
    注意：将孵育时间延长至4℃过夜 °C 以实现更高的LIC克隆效率。
  4. 转化 5 µLIC 反应产物的 L 加入到 E. coli DH5α 并在含有50的LB平板上培养 μg/mL 卡那霉素62,63使用克隆引物和PVX-LIC载体的通用引物通过PCR筛选并验证阳性克隆，随后 测序
    1. 使用PVX-LIC的正向引物（5’-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3’）与STTM克隆的反向引物组合进行菌落PCR，以鉴定阳性克隆。PCR扩增产物的条带大小应约为300 bp。
      注意：通过终止子循环测序验证 STTM 片段的序列64,65.
  5. 从已验证的克隆中提取PVX-STTM质粒，并将其转化至 农杆菌 GV3101、GV2260 或 EHA105 菌株62,63验证 农杆菌 通过PCR鉴定克隆菌落。
    注意：确认 农杆菌 使用PVX-LIC的正向引物和STTM克隆的反向引物，通过PCR鉴定菌落。

3. 在马铃薯植株中进行基于PVX的VbMS检测。

  1. 将4周龄的体外培养马铃薯植株移栽至土壤中。移栽后的植株将在3–4天后进行VbMS检测。
  2. 接种马铃薯植株 农杆菌 含有 PVX-STTM 质粒。
    注意：对于马铃薯中的VbMS检测， 农杆菌介导的浸润与牙签划伤接种同时进行。
    1. 挑选并接种含有 PVX-STTM 载体的阳性转化子至 50 mL 含 50 μg/mL 卡那霉素和 50 μg/mL 利福平。在 28 ℃下培养 °C 摇床中 220 rpm 振荡培养 16 小时，直至 OD600 = 1.0.
    2. 同时，划线接种阳性 农杆菌 菌落转移至至少两个含有 50 的新 LB 平板上 μg/mL 卡那霉素和 50 μg/mL 利福平，28 ℃培养 °C 下放置 1 天。包含 PVX-LIC38,66 对照载体和PVX-GFP67,68 以监测病毒扩散。
    3. 收集 农杆菌 通过3,400 x离心从液体培养物中分离 g 室温下静置10分钟。重悬 农杆菌 细胞与等体积的侵染缓冲液（10 mM MgCl₂）混合2，10 mM MES 和 200 µM 乙酰丁香酮，pH = 5.6）并调节至 OD600 = 1.0. 室温孵育6 h。
    4. 浸润 农杆菌 用1 mL无针注射器将菌液接种到完全展开叶片的远轴面。
      1. 用一只手翻转并固定叶片，另一只手用一根手指从近轴面支撑叶肉的浸润部位。另一只手保持注射器垂直于叶面，进行浸润 农杆菌 将菌液接种至叶片远轴面。
    5. 刮除 农杆菌 从LB平板上挑取菌液，用牙签轻轻刮擦已侵染的马铃薯植株第一个或第二个节间的茎表面。轻轻刮破茎部表皮，避免刺穿茎组织，以免对植株造成严重损伤。
  3. 将侵染后的植株在22 °在16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下，光照强度为120 μmol/m2∙ s1 在温室中。
    注意：由miRNA沉默引起的表型通常在接种后2–4周出现图2, 图3通常在侵染后10–20天出现VbMS表型。VbMS表型取决于特定miRNA及其靶基因的特性、生长条件和马铃薯品种。

4. 进行表达分析。

  1. 接种后2–4周出现表型时，用剪刀采集VbMS植株和对照植株中具有表型的组织，如茎、叶、花或根。从采集的组织中提取总RNA。
  2. 通过电泳检测RNA质量62,63 并通过测量OD值来定量RNA浓度260 使用分光光度计测定吸光度。
  3. 采用茎环法实时逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析miRNA表达水平。
    1. 针对特定的miRNA，设计茎环反转录引物。茎环RT引物包含一个通用的5’骨架和一个位于3’端、由特定miRNA的6个核苷酸组成的延伸序列。设计一段5’通用骨架（5’- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3’），可形成茎环结构。（大写字母对应反向重复序列，小写字母对应环区）。
    2. 骨架序列中形成环状结构的5’端部分用作后续PCR扩增的反向引物（骨架序列中的加粗斜体序列）。在茎环引物上添加一段6个核苷酸的延伸序列，该序列与目标miRNA的3’端反向互补，以提供逆转录的特异性补充图 1A).
      注意：按照 Chen 等人所述的方法设计茎环反转录引物。69 和 Erika Varkonyi-Gasic 等人70,71,72例如，茎环反转录引物用于 Stu-miR160 设计为 5’-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGCATA-3’。马铃薯miR165/166家族的茎环反转录引物设计为5’-GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGGGG(A/G)A-3’。（加粗的大写序列为特定miRNA的逆转录提供了特异性。）
    3. 通过混合50–200 ng总RNA和1 µ茎环反转录引物的 L（100 μM), 2 µL 的 10 倍缓冲液，0.2 µL RNase抑制剂（40 U/µL），0.25 µL dNTP（各10 mM）和1 µL 逆转录酶（200 U/µL）置于冰上。加入无核酸酶的 ddH2O至总体积20 µL.
    4. 使用脉冲逆转录程序进行逆转录。将逆转录反应混合物在16 °C，30 分钟，进行 30 个温度循环 °C，30 秒，42 °C，30 秒，50 °C 1秒，共60个循环，并在85℃孵育以灭活逆转录酶 °5 分钟，C
    5. 对于miRNA表达的实时PCR分析，根据miRNA序列设计正向引物，但不要包含与上述设计的茎环逆转录引物重叠的序列。在正向引物的5’端添加3–7个核苷酸的延伸序列，以优化引物长度、熔解温度和GC含量。补充图1).
      注意：通用反向引物为 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。例如，用于 miR159 的茎环反向转录引物为 Stu-miR160 设计为 5’-CGGCTGCCTGGCTCC-3’。miR165/166家族的茎环反转录引物为5’-CGGCTCGGACCAGGCTT-3’。加粗序列用作引物优化的5’端延伸。可使用miRNA引物设计工具设计用于miRNA的茎环逆转录引物和实时PCR引物。73.
  4. 通过标准的逆转录 PCR（RT-PCR）合成目标 mRNA 的 cDNA。将逆转录反应体系在 37 °C 反应 60 分钟，然后加热至 85 ℃ 使逆转录酶失活 °5 分钟，C
    注意：（1）使用 psRNATarget 程序预测靶 mRNA74 如果目标mRNA未知。（2）用于mRNA的通用反转录引物是一种带锚定序列的引物，序列为5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。
  5. 设置实时 PCR 反应，针对两者 目标miRNA及其靶mRNA。混合0.5 µL 模板 cDNA，5 µL 的 2× 实时 PCR 缓冲液（含 SYBR Green），0.05 µ每对正向和反向引物各 L（40 µM）和 4.4 µL 的 ddH2总体积为5 O µ冰上放置。
  6. 在95℃孵育 °C 3分钟，40个循环：95 °C，3 秒，60 °C，30 秒。随后进行熔解曲线分析，步骤如下：在 95 °C，15 秒，降温至 60 °以20的升温速率升至C °摄氏度，保持在60 °C，60 秒，升温至 95 °以 0.2 ℃/min 的速率升温至 C °C/s，并在95℃下保存 °C，15 秒。分析 Ct使用以下数值： ΔΔCt 方法76,77 并绘制均值及标准误。
    注意：(1) 可按照所述方法设计靶标 mRNA 的实时 PCR 引物75. (2) 马铃薯 polyubiquitin 10 基因可作为马铃薯中归一化处理的内参对照。马铃薯的上游引物 polyubiquitin 10 基因为5’-ATGTTGCCTTTCTTATGTGTGGTTG-3’，反向引物为5’-TTATTTATTCACATAAACGACAGTTCAACC-3’。（3）在实时PCR分析中，污染和引物二聚体的形成可能导致假阳性结果。为监测非特异性扩增并提高实时PCR分析的可靠性，建议在实时PCR检测中设置无模板和无逆转录酶的对照。

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结果

图2显示了PVX-STTM165/166马铃薯植株（Katahdin）的叶片组织在叶脉处从叶片远轴面异位生长。还观察到更为严重的表型，例如喇叭状叶片的形成。相比之下，PVX对照植株未观察到任何表型异常。这些结果表明，VbMS系统在四倍体马铃薯植株中有效抑制了内源miRNA的功能，且PVX-VbMS系统是一种可靠的遗传工具，可用于确定特定miRNA或miRNA家族的功能。

图3显示了PVX-STTM165/166马铃薯植株（Russet Burbank）的叶片远轴面沿叶脉处出现异位叶组织生长。这些结果表明，PVX-VbMS系统可应用于其他马铃薯物种，包括主要的马铃薯栽培品种。

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讨论

我们提出了一种基于PVX的miRNA沉默系统，通过将STTM设计整合到PVX载体中，用于鉴定马铃薯内源miRNA的功能。VbMS系统在沉默马铃薯中的miRNA165/166方面表现出有效性，该miRNA家族在植物物种中高度保守。

TM 方法通过设计一种人工 miRNA 靶标模拟物（target mimic），在 miRNA 互补序列的预期切割位点处形成错配环，从而干扰 miRNA 的表达，实现对靶向 miRNA 的隔离及其活性的抑制22,35,78,79。TM 分子与靶 miRNA 的配对通过降低特定 miRNA 或 miRNA 家族的水平来阻断其功能，进而导致靶 mRNA 的上调。目前已开发出多种用于沉默 miRNA 的 TM 技术，包括内源性 miRNA 靶标模拟（eTM）79...

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致谢

感谢清华大学的 Yule Liu 博士提供 PVX-LIC 载体。本工作由德克萨斯农工大学农业生命研究机构（Texas A&M AgriLife Research）的启动资金以及美国农业部国家食品与农业研究所（USDA National Institute of Food and Agriculture）哈奇项目（Hatch Project TEX0-1-9675）对 JS 的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 µM dATP 和 100 µM dTTPOmega Bio-tek, Inc.，Norcross，GA 30071，美国TQAC136
3 M 醋酸钠，pH 4.0Teknova，Hollister，CA 95023，美国#S0297
乙酰丁香酮TCI America，美国俄勒冈州波特兰市，邮编 97203D2666-25G
农杆菌菌株：GV3101、GV2260 或 EHA105。
氯仿VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660VWRV0757-950ML
二甲基亚砜，DMSOTCI America，美国俄勒冈州波特兰市，邮编 97203D0798-25G
DTTVWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660VWRV0281-25G
E. coli DB3.1用于含 ccdB 基因的 PVX-LIC 和 pTRV2e 载体的保存
E. coli DH5α通过LIC克隆生成的目的载体
肥料：Peters Peat Lite Special 15-0-15 阴天专用肥ICL Specialty Fertilizers，美国南卡罗来纳州萨默维尔，29483G99260
高保真 PCR 试剂：KAPA HiFi DNA 聚合酶（含 dNTPs）罗氏测序与生命科学，Kapa生物系统公司
美国马萨诸塞州威尔明顿		7958960001
异戊醇VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660VWRV0944-1L
Koptec 纯乙醇 – 200 ProofDecon Labs，宾夕法尼亚州普鲁士王市，19406，美国V1005M
MESTCI America，波特兰，俄勒冈州 97203，美国M0606-250G
MgCl₂2ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，邮编 02451MFCD00149781
M-MuLV 逆转录酶New England BioLabs，美国马萨诸塞州伊普斯维奇，邮编 01938-2723M0253L
Nano-drop 分光光度计：NanoDrop OneC 带有 Wi-Fi 功能的微量紫外-可见分光光度计ThermoFisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，邮编 02451ND-ONEC-W
PCR仪：Bio-Rad MyCycler PCR系统Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫尔克里士，邮编 94547170-9703
PCR仪：Eppendorf Mastercycler proEppendorf，美国纽约州霍普奇11788950030010
pH计Sper Scientific，斯科茨代尔，亚利桑那州 85260，美国台式pH/mV计 - 860031
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），pH 6.7/8.0VWR 公司，美国宾夕法尼亚州拉德诺，邮编 19087-8660VWRV0883-400ML
Phytagel：结冷胶Alfa Aesar，Tewksbury，MA 01876，美国J63423-A1
PVX VIGS 载体：PVX-LICZhao 等，2016
实时荧光定量PCR仪：QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SystemThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA4485697
实时荧光定量 PCR 试剂：KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2x) 试剂盒罗氏测序与生命科学，Kapa生物系统公司
美国马萨诸塞州威尔明顿 01887		7959389001
限制性内切酶：SmaINew England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，美国R0141S
逆转录试剂：qScript cDNA SuperMixQuanta BioSciences，美国马里兰州盖瑟斯堡 2087795107-100
RNA提取试剂盒：E.Z.N.A. Plant RNA KitOmega Bio-tek, Inc.，Norcross，GA 30071，美国货号：D3485-01
RNase抑制剂 小鼠来源New England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，USAM0314L
RNAzol RTSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市，邮编 63103R4533
基质：Metro-Mix 360Sun Gro Horticulture，美国马萨诸塞州阿加瓦姆，01001-2907Metro-Mix 360
T4 DNA聚合酶及缓冲液New England BioLabs，Ipswich，MA 01938-2723，美国M0203S

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