我们提出一种体外血管疾病模型，用于研究全血与患者来源内皮细胞的相互作用。该系统可在不同条件下研究原代内皮细胞的血栓形成特性。该方法特别适用于评估凝血不同阶段的原位血栓形成能力及抗凝治疗效果。
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摘要
摘要
血栓的形成涉及内皮细胞、其下方的基质、多种血细胞以及蛋白质之间的复杂相互作用。内皮是多种主要止血分子的主要来源，这些分子调控血小板聚集、凝血和纤溶过程。尽管血栓形成机制已被研究数十年，体外研究主要集中在血管损伤后内皮下基质暴露的情况，或细胞与单一血液成分之间的相互作用。我们的方法可用于研究全血与完整、融合的血管细胞网络之间的相互作用。
通过利用原代人血管内皮细胞，本方案提供了研究内皮细胞对血栓动态影响的独特机会，并能够 为血栓性疾病发病机制提供了宝贵的见解。使用定制的微流控流动通道，可应用疾病特异性的血管几何结构，并模拟特定的血管形态学改变。通过实时记录血栓形成过程，并对血小板黏附和纤维蛋白沉积进行定量表征，实现对血栓动态的分析。通过免疫荧光染色特定分子进行后续分析，可确定内皮功能在血栓动力学改变中的作用。
代表性结果描述了实验设置、数据采集和数据分析。根据研究问题的不同，各部分的参数均可调整，包括细胞类型、剪切速率、通道几何形状、药物治疗以及后续分析程序。本方案通过定量分析慢性血栓栓塞性疾病患者肺动脉内皮上的血栓形成进行验证。
引言
内皮细胞构成血管的内层细胞层，将血液与周围组织分隔开来。内皮细胞被认为是一个动态器官，能够主动调节其微环境并对外部刺激作出反应。1由于内皮直接与流动的血液接触，因此在止血和血栓形成调控中起关键作用，也是多种主要调节分子的主要来源，这些分子调控血小板聚集、凝血和纤溶过程。2健康的非活化内皮细胞（EC）可产生多种分子以拮抗血小板活化，防止凝血和血栓形成，从而维持血液流动，例如前列环素、血栓调节蛋白或组织因子途径抑制物（TFPI）。2,3这可防止血小板黏附、血小板聚集及血栓形成。血管壁受损或激活后，会呈现促凝血的内皮表型，从而启动局部血小板黏附和血凝块形成。2,4内皮细胞活化后，血小板 黏附于内皮细胞（ECs）释放的多聚体蛋白——血管性血友病因子（VWF），或黏附于暴露的内皮下基质结合位点。随后，血小板发生分子改变，并暴露组织因子（TF），从而启动凝血系统的活化，通过纤维蛋白聚合诱导血栓形成5,6由此形成的血凝块共同为再内皮化介导的伤口闭合提供了基础7凝血系统的紊乱可能导致出血性疾病，例如血管性血友病、血友病或血栓形成，这些疾病通常源于 内皮止血途径中失调的促凝与抗凝平衡2,3.
止血过程在动脉和静脉循环中均会发生。然而，动脉血栓形成与静脉血栓形成的机制在本质上截然不同。动脉血栓形成（如缺血性心脏病中所见）主要是在高剪切应力条件下由动脉粥样硬化斑块破裂所引发，而静脉血栓形成则大多在无内皮损伤的情况下，于血流淤滞状态下发生。8,9,10深静脉血栓可能脱落并随血流移行至肺动脉，导致肺栓塞。这可引起慢性血管阻塞，造成显著的功能能力下降。 可能促进慢性肺部疾病的发展 包括慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）的发生11,12,13,14慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）的特征是由于肺动脉被血栓栓塞性物质阻塞，导致肺动脉压力升高，且该阻塞持续至少三个月 数月的抗凝治疗15除了肺栓塞外，人们推测在慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）中，肺血管内皮提供了一种促血栓形成的环境，从而促进血栓的形成与持续存在。 原位 肺动脉血栓形成和慢性阻塞，导致血压升高，若不及时治疗，最终可能引发心力衰竭16,17.
近年来，多项研究推动了检测血栓形成的实验方法的发展，这些方法通过测量血小板功能和凝血过程来实现18。然而，大多数实验要么研究全血与单一细胞外基质成分（如胶原或纤维蛋白）之间的相互作用，要么研究内皮细胞与单一血液成分（如内皮-血小板或内皮-白细胞相互作用）之间的功能关系19,20,21,22。这些实验通常使用人脐静脉 内皮细胞（HUVEC）进行，因为这类细胞易于获取。然而，止血相关基因在不同血管树、血管类型及器官系统中的表达存在差异23,24，因此使用HUVEC来代表参与动脉血栓形成或肺栓塞的内皮细胞具有局限性23。
除了内皮细胞的可塑性之外，疾病特异性的血流动力学改变以及血管形态的变化也可能促进正常内皮细胞上血栓的形成25。例如，由于局部血管收缩或血管几何结构改变导致的较高剪切速率，可能引发急性血栓形成，造成狭窄，从而加速血流停止26。使用定制的微加工流动通道，可以特异性地设计出能够代表（病理）生物学特征的血管几何结构。通过这种方式，能够研究局部生物力学力对健康或病变内皮细胞的影响27。
有多种抗凝治疗可针对凝血级联反应的不同阶段和分子，这些治疗均具有 特定风险与益处可能因不同疾病而异。本文所述的疾病建模方法特别适用于检测各种抗凝和抗血小板治疗对血栓动态的影响。
本研究旨在建立一种包含原代内皮细胞（ECs）的血栓形成模型，该模型具有良好的可变性，可根据所使用的原代ECs 类型，用于分析不同形式的血栓形成。作为示例，我们采用了慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者的肺动脉内皮细胞，与包含血栓形成所有相关组分（血小板、白细胞、红细胞、凝血蛋白及辅因子）的全人血进行相互作用。该方法可应用于商业化的平行流体通道，也可用于具有特定血管结构设计的定制微流控流体通道。因此，该模型最终可用于血栓形成与溶解过程的研究、疾病模型中炎症反应的评估、抗血小板或抗凝治疗的评价，以及实现个体化医学的应用。
本研究描述了原代人肺动脉内皮细胞的分离方法。对于其他类型原代人内皮细胞的分离，我们参考已发表的方法，包括肺微血管内皮细胞25、人脐静脉内皮细胞28以及血液循环中的内皮集落形成细胞 图1A29。
方案
本研究经荷兰阿姆斯特丹 VU 医学中心机构医学伦理审查委员会批准（METC VUmc，NL69167.029.19）。在获得受试者书面知情同意后，按照《赫尔辛基宣言》的规定进行人源原代细胞分离和血液采集。
1. 人肺动脉内皮细胞（PAEC）原代细胞的分离与培养
- 在37 °C水浴中预热完全内皮细胞培养基（cECM），该培养基添加5%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1%内皮细胞生长补充物（ECGS）和1%非必需氨基酸（NEAA）。使用120 °C干热灭菌器或70%乙醇对手术剪、镊子和手术刀进行灭菌。在超净工作台中无菌条件下进行肺动脉内皮细胞（PAEC）的分离。
- 包被高亲和力细胞结合60 mm细胞培养皿（参见 材料清单) 加入 2 mL 的 5 µg/mL 纤连蛋白，37 ˚C 孵育至少 15 分钟。
- 从手术中获取肺动脉（PA）组织例如，肺叶切除术或肺动脉内膜切除术），置于4 ˚C的冷导联缓冲液（4 mM 氯化钾、140 mM 氯化钠、10 mM HEPES、11 mM D-葡萄糖和1% 青霉素/链霉素，pH = 7.3）中，并在冰上保存直至进行细胞分离。
- 在组织取出后2小时内分离肺动脉（PA）中的内皮细胞。用镊子夹取肺动脉，放入10 cm培养皿中，用PBS洗涤。若肺动脉仍呈环状，用剪刀将其剪开。操作过程中务必小心，避免器械接触血管最内层，因为内皮层极易受损或被剥离。
- 从细胞培养皿中移除纤连蛋白，加入 4 mL cECM 培养基。
- 用镊子夹取PA组织并置于培养基中。同时，用手术刀小心刮取血管内层至培养基中。血管壁中常可见脂质沉积，应尽量避免取到这些区域，因其会影响细胞的迁出。
- 继续培养细胞，直至内皮细胞开始形成小菌落。
- 每隔一天更换一次培养基。如果培养物中存在成纤维细胞污染，则使用CD144磁珠分选试剂盒，按照制造商说明书进行磁性亲和细胞分离纯化（参见 材料表）。初始纯化采用双柱法，后续每次纯化均采用单柱法。通常，当流式细胞术检测到污染细胞≤10%时，视为培养物纯度达标。
- 以1:3至1:4的比例传代培养细胞，直至获得足够数量的PAEC用于实验。当PAEC准备就绪后，继续进行下一步操作。
- 纯化后，需对原代内皮细胞进行表征，以检测内皮细胞特异性标志物的存在（例如，VE-钙黏蛋白、CD31、TIE2）以及缺乏平滑肌细胞（α-SMA）、成纤维细胞（波形蛋白）和上皮细胞（细胞角蛋白）标志物图1B).
2. 流式腔室和肺动脉内皮细胞单层的制备
注意：根据研究假设，使用市售的流动小室（参见材料表和协议的图1C 选项A，步骤2.1）或自制的微流控流动小室（协议的图1C 选项B，步骤2.2）。
- 商业微载玻片中内皮单层细胞的接种
关键词：细胞接种，内皮单层，微载玻片，商业化产品
注意：市面上可购得的流室使用便捷，可在整个通道内产生可用于高剪切速率的层流模式。这些微流控载玻片设计用于实现多通道平行实验，并提供准确且可重复的流体分布。由于其专为倒置显微镜优化，可获取高质量的荧光图像。此外，市面上提供多种不同通道尺寸或几何形状的流室规格。本实验优先选用6通道流室，因其微流控载玻片尺寸较小，便于进行多通道平行实验。- 用于包被一个6孔流式滑片通道（3.5 mm 宽 × 0.4 mm 高 × 17 mm 长）时，使用 30 µL 每通道加入0.1%明胶，37 ˚C孵育至少15分钟。
- 为接种一个通道，用胰蛋白酶处理10 cm2 汇合的PAECs离心，300 x g 室温（RT）下孵育7分钟。
- 将PAECs重悬于 600 µL cECM 和移液管 100 µL （1.5 cm2 将细胞悬液加入一个通道中，通过毛细作用使微载玻片被液体覆盖。若操作过慢，则会形成气泡。加样时可稍加用力，以避免气泡产生。
注意：细胞密度会影响内皮细胞表型。总共 1.5 cm2 每通道的融合细胞数量过密，因为该通道的表面积为0.6 cm²2实验开始前，在通道内继续培养这些细胞6天，直至达到最大汇合度。 - 添加一个额外的 50 µL 将cECM加入通道中，以提供足够的培养基，在37 °C、5% CO₂条件下过夜孵育2第二天更换培养基以洗去未结合的细胞。
- 将细胞在 37 ˚C、5% CO₂ 条件下培养 6 天2 以使PAEC形成牢固、融合的单层细胞。每隔一天更换一次培养基 150 µL 细胞外基质
- 第7天，用PAEC处理 100 µL 的 1 µM 在检测前，用含组胺的ECM及1% FBS但不含任何其他添加剂的培养基孵育30分钟。刺激物可自行选择 随意例如，TNF-α 常被用作炎症激活剂。
- 定制微流控流动室的制备
注意：定制的流动小室可根据用户需求进行调整，因为其尺寸和几何形状均可根据需要轻松改变。例如，为了模拟更具生理相关性的血管，可引入狭窄结构（图1D该方法可利用微血管疾病中所见的极小血液量。- 使用图案化晶圆对聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻
- 在微量天平上按1:10的比例混合PDMS固化剂与预聚体，并使用通用实验室混合器充分混匀。
- 为去除产生的气泡，将PDMS置于干燥器中抽真空约1小时。
- 用铝箔衬里玻璃培养皿，并加入几滴水，然后将晶片放入衬有铝箔的培养皿中。该晶片将用作定制微通道的模具。
注意：晶圆或模具由洁净室设施提供。将负性光刻胶涂布于晶圆上，以形成凸起的通道状结构，其典型尺寸如下： 300 µm 宽度 x 270 µm 高度 × 14 毫米长度。 - 将脱气的PDMS倒入置于玻璃培养皿中的晶圆上。
- 将浇注到晶圆上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）放入干燥器中脱气15分钟，以去除浇注过程中可能产生的任何气泡。
- 将含有霉菌和PDMS的培养皿从干燥器中取出，放入60 ˚C烘箱中至少4 h，以使PDMS交联。
- 制备用于与载玻片键合的交联聚二甲基硅氧烷
- 从烘箱中取出模具和交联的PDMS，转移至横向流动罩内，以无尘操作PDMS。
- 使用手术刀去除模具底部的任何PDMS，并将交联PDMS的顶层从模具上取下。
- 用粘性胶带覆盖暴露的图案化PDMS平板，以防止灰尘颗粒接触PDMS通道。
- 使用穿孔器在PDMS芯片上切割出1 mm直径的入口和出口，并将芯片裁剪至所需尺寸。
- PDMS微流控通道与玻璃载片的灭菌与键合
- 用乙醇彻底冲洗玻璃显微镜载玻片，随后用异丙醇冲洗。每次冲洗后，用氮气枪彻底吹干载玻片。
注意：如果使用共聚焦显微镜进行分析，也可使用盖玻片。 - 打开等离子体腔室，将已清洗的显微镜载玻片和去除保护胶带的微流控芯片装入其中。
- 关闭腔室，用氮气吹扫1分钟，然后用过滤空气填充腔室，直至压力达到500 mTorr。
- 将玻璃载玻片和PDMS芯片置于50 W功率、5 kHz频率的等离子体中处理40秒。
- 等离子体处理后，立即键合玻璃载片与微流控芯片。将器件置于无菌培养皿中保存。
- 用乙醇彻底冲洗玻璃显微镜载玻片，随后用异丙醇冲洗。每次冲洗后，用氮气枪彻底吹干载玻片。
- 使用图案化晶圆对聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行软光刻
- 微流控通道中内皮单层细胞的接种
- 通过移液将定制微通道进行包被 10 µL 每通道加入0.1 mg/mL I型胶原或0.1%明胶，37 ˚C孵育30分钟。
- 为接种四个微通道，用胰蛋白酶处理25 cm²培养瓶中的细胞2 汇合的PAECs以300 x g离心沉淀 g 室温下孵育7分钟。
注意：仅有小部分细胞会贴附于表面，因此必须使用过量的细胞以获得融合的单层细胞。 - 将PAEC悬浮于 20 µL 细胞外基质（cECM）的制备与应用 5 µL 每个通道加入细胞悬液。由于通道尺寸较小，毛细作用力会充满微载玻片并防止气泡形成。
- 孵育3–4小时后更换培养基，以洗去未结合的细胞。
- 将细胞培养6天，使PAEC形成牢固的融合单层。由于培养体积较小，需每天更换培养基 150 µL 细胞外基质（cECM）。将含有培养基的移液 tip 留在入口处，并在出口处放置一个空 tip。这将作为储液 reservoir，为细胞提供充足的营养物质和生长因子，并防止玻片干燥。
- 第7天，用Hoechst（1:5,000，溶于cECM中）对活细胞的细胞核进行染色，在37 °C、5% CO₂条件下孵育最多10分钟。2.
- 用 cECM 仔细洗涤 3 次，并进行处理 1 µM 在检测前，于 ECM 中添加 1% FBS 并孵育 30 分钟以刺激组胺释放。刺激物可选择 随意摄取例如，TNF-α 常被用作炎症激活剂。
- 使用直径为1.27 mm的90°弯角不锈钢接头将PDMS芯片的出口连接至管路。
3. 人全血的制备
- 使用含0.109 M枸橼酸钠抗凝剂的试管采集受试者的静脉血。受试者可以是健康个体或未接受抗凝治疗的患者。轻轻颠倒混匀试管。实验所需血液总量主要取决于所选的流速。当使用ibidi 6孔载玻片且流速为25 mL/h时，总共2 mL血液并略多出少量以填充管路和流动通道即足够。
- 将血液转移至50 mL离心管中，并加入Calcein AM（1:10,000）以荧光标记血细胞，同时加入Alexa488标记的纤维蛋白原（15 µg/mL）以结合自体纤维蛋白原。将血液在37 ˚C孵育15分钟，以确保充分吸收。
- 在实验开始前立即用再钙化缓冲液（154 mM氯化钠、10.8 mM枸橼酸三钠、2.5 mM氯化钙和2 mM氯化镁）将血液按1:1比例稀释。
注意：最大50%的血液稀释度不会影响凝血反应时间30。此外，人血可能含有病毒及其他病原体，因此处理血液样本存在感染风险。强烈建议采取适当的安全防护措施，并谨慎操作。
4. 组装流体系统
- 连接管路前，使用装有洗涤缓冲液（36 mM 柠檬酸、103 mM 氯化钠、5 mM 氯化钾、5 mM EDTA 和 0.35% wt/vol 牛血清白蛋白 [BSA]，pH = 6.5）的 20 mL 注射器冲洗流管，以防止血液在管路中凝结。
- 使用新的注射器将 HEPES 缓冲液（132 mM 氯化钠、20 mM HEPES、6 mM 氯化钾、1 mM 氯化镁、1% BSA 和 5.5 mM D-葡萄糖，pH = 7.4）注入流管中，并使用弯头型鲁尔接头小心地将其连接至装有培养基中内皮细胞（EC）的微流控载片。在将接头连接至微通道时，应尽量避免载片中产生气泡。气泡会损伤内皮层并影响实验结果。彻底清除洗涤缓冲液，并防止缓冲液接触细胞，以免抑制凝血过程。
- 按照图1E所示设置流动系统。使用 20 mL 注射器吸取 2 mL 洗涤缓冲液，以防止血液进入注射器时发生凝结。将空注射器插入注射泵，并使用雌性鲁尔接头将出口管路连接至该注射器。将进样管插入盛有人源抗凝全血的容器中。
- 开启注射泵并计算流速。流体在通道中的流动剖面呈抛物线分布。假设血液表现为牛顿流体，使用以下公式计算流速：
（公式 1）
其中
τ = 剪切应力![表面张力单位公式 \([ \text{dyn/cm}^2 ]\)，与流体动力学研究相关。](/files/ftp_upload/61068/61068eq2.jpg "figure-protocol-2")
η = 动力黏度
Q = 体积流速![静态平衡；公式 [mm²/s]；测量单位示意图；用于教学。](/files/ftp_upload/61068/61068eq4.jpg "figure-protocol-4")
h = 通道高度
w = 通道宽度
注：对于商用六通道微流控载片（矩形截面，高度为 0.4 mm，宽度为 3.5 mm）中肺动脉血流条件，通常采用 25 mL/h 的体积流速持续 5 分钟。由于自制流动通道的尺寸不同，流动特性也会相应变化。请调整参数以确保剪切应力相等。 - 将 20 mL 注射器的直径设定为 19.05 mm，并将程序设置为抽取。通过施加负压将血液抽吸通过细胞包被的通道，可确保剪切速率恒定，并最大程度减少对细胞层的损伤。
5. 设置显微镜以进行图像采集
- 使用 20 倍物镜，将微载玻片放置在倒置相差荧光显微镜的载物台上。启动显微镜软件，移动载物台的 Z 轴方向，以聚焦于细胞单层。
- 在每个流道的起始、中间和末端位置选择感兴趣区域（ROI）。起始和末端位置应距离通道的入口和出口至少 3 mm。设置蓝色、绿色和红色荧光滤光片，并调节激光功率和光照强度，使背景信号最小。
6. 全血在肺动脉内皮细胞上的灌注
- 当所有部件按图1E所示连接完毕且显微镜已准备就绪可进行记录时，点击开始以录制视频。同时在注射泵上点击开始，使血液流经内皮层。
- 一旦血液开始流经内皮层，立即以预设的激活通道和ROI位置每15秒采集一次图像，持续5分钟。
- 灌注5分钟后，停止记录并关闭注射泵。拆卸流室装置，并非常小心地移除管路。若操作用力过大，常会形成气泡。应尽量避免此情况，因为气泡会冲走内皮层。
7. 固定与后续分析
注意：为了排除因灌注实验导致内皮损伤而引起的血小板黏附假阳性结果，有必要对内皮细胞的间隙形成及单层完整性进行表征。可通过针对 VE-钙黏蛋白的常规免疫荧光染色实现。
- 灌注完成后，拆卸管路，用 HEPES 清洗微流控通道。将 HEPES 用移液器加入通道，推动血液至出口端，再用另一支移液器吸除多余液体。
- 可选步骤：使用 PBS++（含 0.5 mM 氯化镁和 0.9 mM 氯化钙）清洗通道，以防止蛋白上清液沉淀，从而降低背景信号。但额外的清洗步骤可能改变细胞行为和形态，进而影响后续分析成像。
- 吸除 HEPES，通过移液加入 37 ˚C 预热的 4% 多聚甲醛（PFA），固定附着血小板和沉积纤维蛋白的内皮层，室温孵育 15 分钟。
注意：固定自制微流控芯片时需格外小心，因为这些通道尺寸更小，操作过程中通道内剪切力更高。 - 从通道中移除 PFA，并用 PBS 洗涤 3 次。此时微流控载片已准备好进行标准染色流程，可用于表征内皮细胞标志物（如 VE-钙黏蛋白、CD31、P-选择素或整合素）、血小板黏附标志物 CD42b 或白细胞标志物 CD45。
- 染色完成后，使用常规共聚焦显微镜至少采集五张图像，用于分析共定位情况。
8. 图像分析
- 在 ImageJ 中打开包含荧光标记血小板或荧光纤维蛋白的流式分析图像。将所选图像拖入 ImageJ。
- 图像以 RGB 彩色模式拍摄。为便于分析，建议使用 8 位图像，因此将图像转换为 8 位： 图像 | 类型 | 8位.
- 为减少背景干扰，采用滑动抛物面法进行背景扣除，其中滚动球算法可局部计算并从原始图像中减去背景像素： 过程 | 减去背景 | 滚动球半径 = 50 像素 | 滑动抛物面.
注意：图像大小以像素为单位定义。然而，为了测量面积，必须设置比例尺。当使用数值孔径为0.45的20倍物镜拍摄图像时，显微镜的比例尺为每微米2个像素 µm大多数情况下，设置比例尺所需的信息已存储在图像的元数据中，ImageJ 可自动读取并使用这些信息： 分析 | 设定比例尺. - 设置阈值以定义黏附的血小板或沉积的纤维蛋白。使用三角法，阈值将自动调整： 图像 | 调节 | 阈值.
- 使用以下方法分析血小板或纤维蛋白覆盖的区域： 分析颗粒 命令。将大小设置为2至无穷大，因为血小板的最小尺寸为 2 µm: 分析 | 分析颗粒.
- 结果将提供总面积 µm2，聚集体的平均尺寸为 µm2 以及覆盖区域的百分比。
结果
代表性结果可分为三个部分，分别对应实验设置、数据采集和数据分析的各个步骤。根据研究问题的不同，每个步骤的参数均可调整。所展示的数据用于研究内皮对血栓形成的影响。
实验设置
已知内皮细胞在结构和功能上具有高度异质性，其特性取决于生理或病理状态下的位置和时间23。为研究内皮细胞与血液的相互作用，可采用多种来源的内皮细胞，本实验中使用的是 commercially available HUVECs 和 PAECs（图1A）。HUVECs 是实验室模型中最常用的细胞类型，而 PAECs 则是从肺动脉中分离获得的患者来源细胞。此外，已有成熟的实验方案可用于从肺循环中分离微血管内皮细胞（MVEC），或从外周血中分离内皮集落形成细胞（ECFC）25,28,29。
分离后，通过VE-cadherin、CD31和TIE2染色对内皮细胞进行表征，以确认其内皮表型。对αSMA和细胞角蛋白的检测结果表明，不存在成纤维细胞或上皮样表型。图1B）。在获得高纯度的内皮细胞（ECs）群体后，使用第3至5代细胞接种于商用显微滑片或定制的微流控流动通道中（图1C）。虽然市面上可购得的微流控载玻片主要为平行流动腔室，或具有特定高度或分支角度参数的Y形通道，但使用微流控载玻片使得根据实验需求调整实验参数成为可能 体内 血管几何结构与血流动力学31然而，定制的微流控芯片尺寸更小，往往限制细胞铺展，并导致更多的细胞死亡32,33. 使用过量的细胞可弥补仅有小部分细胞能够黏附的不足。当引入狭窄结构时，观察到内皮细胞相较于平行的微流控通道呈现出更长的表型。图1D）。商用流体腔室具有更大的细胞可结合表面积，因此接种时所需的细胞数量更少。
为研究内皮细胞与血液的相互作用，将全血灌注于内皮单层细胞上。实验当天采集枸橼酸盐抗凝血，并在灌注前立即重新钙化。在灌注前30分钟，用组胺刺激细胞以诱导VWF释放及血小板黏附（图1E）34,35。由于微流控通道尺寸较小，定制的微流控通道可减少所需血液体积。
数据采集
为了研究血栓在PAECs上的形成，将Calcein AM-Red荧光标记的血细胞和Alexa488偶联的纤维蛋白在2.5 dyne/cm2条件下灌注5分钟（图2A–C）。对黏附的血细胞和沉积的纤维蛋白进行定量分析。每30秒采集一次图像，并使用ImageJ软件进行定量。重要的是要扣除背景信号，以消除未黏附血小板的自发荧光。采用三角算法进行阈值设定，以确定最低背景水平，从而能够检测到微小的血小板聚集体（图2D）。
在非刺激条件下，血小板和纤维蛋白未与内皮细胞结合，这符合预期。为促进血管性血友病因子（VWF）释放及血小板结合，用组胺刺激肺动脉内皮细胞（PAECs），结果在刺激后2.5分钟内血小板黏附迅速增加并达到平台期。此时，血小板开始分泌自分泌因子，诱导血小板聚集以及纤维蛋白原裂解为纤维蛋白。纤维蛋白在3分钟后开始沉积，并在4分钟后与血小板形成稳定的聚集体（图2E）。
为了研究这种效应是否可被直接口服抗凝药（DOAC）抑制，将血液与10 nM的达比加群共同孵育。达比加群被加入血液稀释液中，可抑制凝血途径中的凝血因子IIa，从而阻止纤维蛋白原裂解形成纤维蛋白纤维。当经达比加群处理的血液流经刺激后的PAECs时，血栓形成可被直接抑制，主要表现为延迟纤维蛋白沉积（图2F）。
数据分析
为研究不同内皮来源对血栓形成的影响，分析了血液灌注5 min后发生的细胞变化。内皮细胞经固定后，用CD42b标记黏附的血小板，随后在共聚焦显微镜下成像。该方法可对血小板与纤维蛋白的共定位进行详细分析，从而提示血液中是否存在凝血因子功能障碍。通过标准免疫荧光染色确定内皮细胞（EC）在凝块形成中的作用。VE-钙黏蛋白染色证实内皮细胞间的细胞连接保持完整，表明血凝块形成于内皮单层细胞表面，而非内皮细胞间隙下的基质上（图3）。此外，使用不同细胞来源导致在内皮上形成的血栓模式存在差异。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为静脉内皮细胞，其血小板黏附和纤维蛋白沉积较少；而来自慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者的病变原代肺动脉内皮细胞（PAEC）在组胺刺激下，相较于健康PAEC，表现出显著增多的血小板黏附和更丰富的纤维蛋白沉积。这表明CTEPH患者的内皮对血管激活具有更高的反应性，从而导致血栓形成增加。
图1：实验方案的示意图概述。（A）分离并培养了多种来源和不同类型的内皮细胞，用于微流控流动通道中的灌注实验。不同类型的内皮细胞的代表性明场图像。比例尺 = 50 µm。（B）通过免疫荧光染色对分离的细胞进行表征，以确认其内皮表型。比例尺 = 50 µm。（C）细胞可接种于商用流动载片或自制微流控通道中。（D）在不同通道几何结构中培养的HUVEC的代表性明场图像。比例尺 = 50 µm。（E）血液灌注实验的实验装置。采集柠檬酸抗凝血，用生理缓冲液稀释后，通过注射泵灌注于内皮细胞上。本图中的肺和脐静脉图像经Servier Medical Art修改，许可协议为Creative Common Attribution 3.0通用许可。http://smart.servier.com/ 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：血栓形成图像的采集与定量分析。（A）全血在未刺激的PAECs（B）和组胺刺激的PAECs上灌注后1、3和5分钟时，黏附的Calcein AM-Red标记血小板及沉积的Alexa488标记纤维蛋白的代表性延时成像。（C）全血经达比加群孵育后，在组胺刺激的PAECs上灌注1、3和5分钟时，血小板黏附与纤维蛋白沉积的代表性延时图像。比例尺 = 50 µm。（D）在ImageJ中进行图像定量分析的示意图。（E）在未刺激和组胺刺激的内皮上，每30秒对血小板黏附和纤维蛋白沉积进行定量分析。（F）达比加群对血栓形成影响的定量分析，通过血小板黏附和纤维蛋白沉积进行评估。数据以均值 ± 标准差表示，n = 3。请点击此处查看本图的放大版本。
图 3：表征血小板黏附和纤维蛋白沉积过程中内皮细胞上血栓形成的流动实验代表性共聚焦图像。 通过VE-钙黏蛋白对内皮细胞间连接进行表征，并在对照PAECs、CTEPH患者来源的PAECs以及HUVEC中进行测量。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
凝血是内皮细胞与血液成分之间复杂且受时间调控的相互作用的结果。 体外 该检测方法可用于实时研究内皮细胞的血栓形成特性。可使用多种类型的原代人内皮细胞，便于 原位 器官和患者特异性的血栓形成 方式。本研究通过比较来自健康供体与慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者的肺动脉内皮细胞（PAECs）的血栓形成特性，展示了该方案的应用。通过将健康受试者的全血灌注到细胞表面，观察活体血栓的形成过程 组胺激活的内皮细胞，同时测试了一种直接口服抗凝药（DOAC）作为抗血栓剂的效果。
除了使用商品化微通道外，如代表性结果所示，引入定制微流控通道可实现对血管几何结构变化影响血栓形成的研究。例如，分支点或狭窄处的血流减少会导致剪切应力升高，进而引起更多的血小板活化。36然而，这些定制微流控通道的一个显著局限性是需要大量细胞才能形成稳定的内皮细胞单层，如步骤2.3.2所述。这可能带来 当患者来源的细胞数量有限时，这成为一个限制因素。商用微载玻片的优点在于其表面经过修饰，适用于细胞培养，且生长区域更大，从而允许内皮细胞（ECs）形成融合且稳定的单层。然而，较大的表面积会导致管腔更大。根据 公式 1这需要更大的血量才能达到与自制微流控装置相似的流速。
一种改进方法 该方案可用于研究活体EC 屏障完整性丧失或改变。EC 本方案中，损伤仅在实验结束时进行测量。对于活细胞示踪，可例如使用mCherry标记的VE-钙黏蛋白对内皮细胞进行标记。37然而，由于这需要一种具有高效病毒转染的优化程度很高的实验方案，因此可采用细胞电阻抗传感技术（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS）作为替代方法来研究内皮完整性及屏障功能38通过特殊的ECIS流动通道进行灌注，可实现对流动条件下内皮屏障完整性的长期监测。这些特定的ECIS功能支持内皮屏障特性与血栓形成的并行检测。在定制阵列中，实现内皮屏障并行测量的其他方法包括在灌注液中使用荧光标记的葡聚糖，其从管腔内的渗出程度取决于内皮细胞屏障的通透性。
所述方案的一个局限性在于，内皮细胞（ECs）被从人体中取出后，在组织培养塑料上进行培养，而这种塑料是一种坚硬的人工基质。细胞会适应其生物物理环境，这可能会影响内皮细胞对血小板活化的反应，因为血小板活化与管壁硬度之间存在关联。39尽管这些细胞对培养塑料具有适应性，但细胞仍会 保留疾病特异性特征，这些特征可通过与来自健康供体的ECs进行直接比较而识别，如所示 对照、CTEPH-PAEC 和 HUVEC 血液灌注5分钟后，血小板黏附和纤维蛋白沉积呈现不同模式。
与其他方案不同，该系统使用全血，而其他方案则使用 研究内皮细胞与单一血液成分（如血小板和白细胞）的相互作用19,20,21已开发出更先进的微流控模型，可在具有圆形血管几何结构和柔软细胞外基质的血管模型中研究内皮功能。然而，这些模型经过优化后主要适用于人脐静脉内皮细胞（HUVECs）40,41,42所述方案的新颖之处在于使用原代内皮细胞与全血相结合 建立模型 原位 血栓形成更接近一步 体内 条件。通过优化使用患者来源的内皮细胞和患者来源血液的实验方案，可进一步优化疾病建模。 体外，从而实现对个体化血栓形成及药物治疗效果的评估。
所述方案可用于研究抗凝治疗对患者来源细胞的影响。尽管我们使用达比加群抑制 血栓形成，但也可使用其他 抗凝剂，例如直接抑制凝血级联反应中Xa因子的利伐沙班。同样可研究氯吡格雷或阿司匹林等直接血小板抑制剂，因为这些药物作用于止血的初级阶段，即血小板与内皮细胞（ECs）结合的阶段。最终，可通过患者特异性内皮细胞与其自身血液相互作用下的血栓形成能力，预测抗凝治疗对个体患者的个性化效果。此外，对特定蛋白进行敲低可提供额外的功能信息。
在所述方案中，有一些步骤对于成功进行灌注实验至关重要。首先，在分离原代细胞的过程中，必须获得高纯度的内皮细胞（EC）培养物。其次，内皮细胞形成稳定且融合的单层结构非常重要；若未达到此状态，轻微的剪切应力变化即可导致内皮损伤并激活凝血级联反应，或者血小板可能开始结合至基底膜，从而产生假阳性结果。第三，必须避免气泡的产生，因为气泡会损伤内皮层，进而影响实验结果。
在使用氯化钙和氯化镁对枸橼酸抗凝血进行再钙化后，应立即开始灌注实验。再钙化会迅速引发血小板活化和血栓形成，导致样本快速凝固。
综上所述，我们描述了一种高度通用的方案，用于研究血栓形成过程中全血与内皮细胞之间的相互作用。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢荷兰阿姆斯特丹大学医学中心学术医学中心、Sanquin 研究所及兰德施泰纳实验室血浆蛋白部的 Jan Voorberg 对本文提出的宝贵意见。本研究得到了荷兰心血管联盟（DCVA）[2012-08, 2014-11] 向 Phaedra 和 Reconnect 联盟以及 2018 年向 Phaedra IMPACT 联盟颁发的推动计划资助。这些资助包括由荷兰心脏基金会、荷兰大学医学中心联合会、荷兰健康研究与发展组织以及荷兰皇家艺术与科学学院提供的联合资金。此外，本研究还获得了欧洲研究理事会“VESCEL”高级资助计划（资助编号：669768）的资助。XDM 由荷兰阿姆斯特丹 VU 大学医学中心心血管研究所（ICaR-VU）的研究基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Merck | 106404 | |
| 20 mL 注射器 | BD | 300613 | |
| 20倍物镜 | Olympus | N1492900 | LUCPLFLN20XPH/0.45 |
| 2-丙醇（IPA） | Boom | 760514555000 | |
| Aladdin 注射泵 | World Precision Instruments | AL-4000 | |
| Alexa488-纤维蛋白原 | Invitrogen | F13191 | 15 µg/mL |
| Alexa647-山羊抗兔抗体 | Invitrogen | A21245 | 1:100 |
| 1 mm 直径活检打孔器 | Ted Pella | 15110-10 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| CaCl₂ | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcein AM-Red | Invitrogen | C3099 | 1:1000 |
| CD42b-APC | Miltenyi Biotec | 130-100-208 | 1:100 |
| 柠檬酸 | Merck | 100244 | |
| Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Corning | 354249 | 0.1 mg/mL |
| Corning CellBIND 表面 60 mm 培养皿 | Corning | 3295 | |
| 横向气流罩 | Basan | ||
| 干燥器 | Duran | 2478269 | |
| D-葡萄糖 | Merck | 14431-43-7 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 内皮细胞培养基（ECM） | ScienCell | 1001 | |
| 人血浆纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 流体管路 | ibidi | 10831, 10841 | |
| 明胶 | Merck | 104070 | 0.1% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 1:1000 |
| micron-Slide VI 0.4 流动腔室 | ibidi | 80606 | |
| ImageJ | NIH | v1.49 | |
| KCl | Merck | 7447-40-7 | |
| 实验室烘箱 | Quincy | 10GC | |
| LS720 荧光显微镜 | Etaluma | LS720 | |
| Luer 接头 | ibidi | 10802, 10825 | 公端弯头接头，母端管接头 |
| MACS 磁珠（抗 CD144） | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | 1:5 |
| MgCl₂ | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| 显微镜载玻片，76 × 26 mm | Thermo Scientific | AAAA000001##12E | |
| 负性光刻胶 SU-8 | Microchem | ||
| 非必需氨基酸（NEAA） | Lonza | 13-114E | |
| 多聚甲醛（PFA） | Merck | 818715 | PBS 中含 4% PFA |
| 青霉素/链霉素（P/S） | Gibco | 15140-122 | 1% |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | 14190-094 | 不含钙或镁 |
| 等离子体处理腔室，CUTE | Femto Science | ||
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS），Sylgard 184 | Dow | 101697 | |
| 枸橼酸钠抗凝采血管 | BD | 363048 | |
| 三钠枸橼酸 | Merck | 106448 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Gibco | 25300-045 | |
| VE-钙黏蛋白（D87F2）-XP | Cell Signaling | 2500 | 1:300 |
参考文献
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