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方法文章

成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

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DOI：

10.3791/61073

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2020年10月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。

摘要

成年哺乳动物心肌细胞（CMs）的离体培养是体外研究心脏生物学最相关的实验体系。成年哺乳动物的心肌细胞是终末分化的细胞，增殖能力极低。心肌细胞的有丝分裂后状态不仅限制了其细胞周期的进程，也制约了心肌细胞的有效培养。此外，许多研究（如心肌细胞增殖及基因表达分析）都需要对成年心肌细胞进行长期培养。

小鼠和大鼠是用于心肌细胞分离的两种最常用的实验动物。尽管大鼠心肌细胞（CMs）可以进行长期培养，但成年小鼠心肌细胞容易死亡，在正常条件下无法培养超过五天。因此，迫切需要优化成年啮齿类心肌细胞的分离与长期培养方案。通过本改良方案，可成功分离并培养成年小鼠和大鼠心肌细胞超过20天。此外，分离所得心肌细胞的siRNA转染效率较以往报道显著提高。对于成年小鼠心肌细胞的分离，采用Langendorff灌流法，并使用最佳酶溶液以及足够时间以实现细胞外基质的完全解离。为获得纯化的心室心肌细胞，在开始解离和接种前，需将两个心房组织解剖并弃去。细胞被分散接种于经层粘连蛋白包被的培养板上，以实现高效且快速的贴壁。心肌细胞需静置贴壁4–6小时后，再进行siRNA转染。培养基每24小时更换一次，持续20天，随后对心肌细胞进行固定，并使用心肌特异性标志物（如肌钙蛋白）以及细胞周期标志物（如KI67）进行染色。

引言

心脏疾病是全球主要的死亡原因之一。几乎所有类型的心脏损伤都会导致成年心肌细胞（CM）显著丢失。由于成年心肌细胞具有衰老特性，成年哺乳动物心脏无法修复其损伤1。因此，任何对成年哺乳动物心脏的损伤都会造成心肌细胞的永久性丧失，进而导致心脏功能下降和心力衰竭。与成年哺乳动物不同，斑马鱼和蝾螈等小型动物的心脏能够通过现有心肌细胞的增殖实现再生2,3,4。目前全球正在积极开展研究，探索通过促进增殖或非增殖途径治疗心脏损伤的新型干预策略。在过去几十年中，已开发出多种遗传小鼠模型用于研究心脏损伤与修复过程。然而，使用体内动物模型仍是一种成本高昂的方法，且难以区分细胞自主性机制与继发性效应。此外，在体内系统中分析药物干预对心肌细胞特异性作用也存在挑战，尤其是当该干预通过心肌细胞诱导心脏保护信号通路时。

此外，成年心肌细胞（CM）的长期培养对于进行心肌细胞增殖分析是必要的。心肌细胞增殖检测至少需要4-5天，以诱导细胞进入细胞周期，并在此之后获得准确的数据。同时，利用分离的心肌细胞开展的电生理学研究、药物筛选、毒性研究以及Ca++稳态研究，均需要更优化的培养体系5,6,7。此外，近期研究表明，心肌细胞分泌的细胞因子（即心肌细胞因子，cardiokines）在心脏保护中具有重要意义8,9。为了深入探究这些心肌细胞因子在心脏修复与再生过程中的治疗作用及其分子机制，也需要进行长期培养。

成年大鼠心肌细胞（CMs）具有足够的稳定性，可用于单细胞分离以及在体外系统中进行长期培养10,11,12。然而，由于存在多种基因修饰小鼠模型，成年小鼠心肌细胞在体外检测中具有重要意义，这使得研究人员能够设计并实施多种创新性分析，而这些分析在大鼠心肌细胞中无法实现13。与成年大鼠心肌细胞的分离相比，从小鼠成年心脏中获得单细胞悬液较为困难，而对成年小鼠心肌细胞进行长期体外培养则更具挑战性。

先前已建立利用兰格多夫系统从大鼠和小鼠心脏分离成年心肌细胞（CM）的方法，以研究CM功能5,14,15。本文详细描述了从大鼠和小鼠分离成年CM的实验方案，以及对分离细胞进行改良的长期培养、转染和CM增殖的方法。

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方案

所有实验均应遵循美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》中的规定。视频中展示的所有实验方案均已获得辛辛那提大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 成年小鼠（和大鼠）心脏提取前的准备

  1. 根据表1和表2中提供的配方，分别配制用于大鼠和小鼠分离的灌注液、酶液和终止液。使用0.22 µm滤膜过滤溶液，以去除任何污染物或未溶解的颗粒。
  2. 将手术器械浸泡在70%酒精中15分钟进行清洁和灭菌，随后用双蒸水冲洗。将器械置于干净的纸巾上自然晾干。
  3. 将水浴预热至37 ºC。检查水浴中的水位，确保在操作过程中温水能够持续循环通过灌注装置。
  4. 用70%酒精以5分钟时间冲洗灌注装置。重复一次。
    注意：提高流速有助于清洗管路。
  5. 酒精冲洗后，用双蒸水冲洗10分钟，以清除残留的酒精。
  6. 准备3个中等大小的一次性聚苯乙烯称量皿，用于心脏切除后的清洗。每个称量皿中加入20 mL心肌细胞缓冲液。
  7. 使用巴斯德移液管向每个称量皿中加入2–3滴肝素，并通过多次吹打充分混匀。
  8. 取一支带有钝头针头套管的10 mL注射器。
    注意：可通过剪去洁净无菌针头的尖端制备钝头针头套管。分别使用21 G和14 G针头为小鼠和大鼠制备套管。
  9. 用灌注缓冲液（表1）填充注射器，排除所有气泡，并将其以倾斜位置放置于第三个称量皿中，用胶带固定。
    注意：对于大鼠，使用溶液A（表2）代替心肌细胞灌注缓冲液。
  10. 用外科缝合线打一个松结，并将其套在针头上。
  11. 在麻醉注射前20分钟，通过腹腔注射向小鼠注射肝素（100 USP单位/只）。
  12. 使心肌细胞灌注缓冲液（表1）流经灌注装置。将流速调至3 mL/min。
    注意：对于大鼠，使用溶液A（表2）代替心肌细胞灌注缓冲液。
  13. 5分钟后，将灌注缓冲液更换为酶溶液（表1）。在过程中持续用氧气饱和酶溶液。使用3 mL/min的流速。
    注意：对于大鼠心肌细胞分离，应使用溶液E（表2）代替。
  14. 通过腹腔注射麻醉剂对小鼠进行麻醉。根据IACUC推荐的剂量，使用适用于终末手术的适当麻醉剂量。
  15. 通过脚趾夹捏无反应确认麻醉深度足够，然后将小鼠置于手术平台上。

2. 成年小鼠（和大鼠）心脏的提取

  1. 用 70% 酒精擦拭皮肤进行消毒。
  2. 小心地打开胸腔。
  3. 切除心脏。切除过程中避免带入非心脏组织。
  4. 将心脏放入第一个培养皿中，该培养皿内盛有灌注缓冲液（表 1）。
    注意：大鼠使用溶液 A（表 2）。
  5. 通过轻柔挤压清除心脏中的血液。
  6. 将心脏转移至第二个培养皿。
  7. 清除心脏上的残留血液并去除非心肌组织，随后将心脏转移至第三个培养皿。
  8. 修剪掉肺组织及其他周围组织，经升主动脉插管。该操作应尽快完成（<5 分钟），以提高心肌细胞的质量和产量。

3. 心脏的消化

  1. 小鼠心脏的消化
    注意：所有流经小鼠心脏的溶液/缓冲液在整个操作过程中均应持续充氧。
    1. 小心地将套管针从注射器上取下，并连接至Langendorff灌流装置。
    2. 避免任何气泡进入心脏，否则可能影响酶溶液的流通和消化效果。
    3. 将水浴夹套上移，为心脏提供均匀的环境。使酶溶液以2-3 mL/min的速度流经心脏。
      注意：流经溶液的速度至关重要，对心肌细胞（CM）的数量和质量有显著影响。
    4. 让酶溶液流经心脏2分钟。
    5. 在2分钟时，向酶溶液中加入40 µL的100 µM CaCl2溶液并混匀。继续让酶溶液流经心脏10-15分钟。
      注意：当灌流变得顺畅，心脏呈现棕褐色且质地变软时，表明胶原酶已均匀分布，心脏组织得到适当消化。
  2. 大鼠心脏的消化
    注意：所有流经大鼠心脏的溶液/缓冲液在整个操作过程中均应持续充氧。
    1. 小心地将套管针从注射器上取下，并连接至Langendorff灌流装置。
    2. 避免任何气泡进入心脏，否则可能影响酶溶液的流通和消化效果。
    3. 将水浴夹套上移，为心脏提供均匀的环境。
    4. 以2-3 mL/min的速度开始灌注溶液A，持续3-5分钟，以清除心脏中的血液。
      注意：流经溶液的速度至关重要，对心肌细胞（CM）的质量有显著影响。
    5. 当心脏中的血液被清除后，从溶液A切换至溶液E（表2）。按照以下指示用CaCl2逐步滴定溶液E，使其最终浓度达到0.1 mM：
      1. 灌注10分钟后，加入12.5 µL的0.1 M CaCl2。
      2. 灌注15分钟后，加入25 µL的0.1 M CaCl2。
    6. 继续让酶溶液流经心脏30-40分钟，直至灌流速度加快且心脏变得柔软可塑。

4. CM 单细胞悬液的制备

  1. 小鼠CM单细胞悬液的制备
    1. 将心脏从兰格多夫灌流系统中取出，移至一个盛有5 mL酶溶液的60 mm培养皿中，并将培养皿转移至生物安全柜内。
      注意：在将心脏从兰格多夫灌流系统中取出之前，需确保心脏充分消化。消化时间取决于酶活性、灌流液流速以及心脏大小。
    2. 在生物安全柜中进行进一步的机械解离，以确保无菌并避免污染。
    3. 小心地去除心房（1/4th 基底部心肌组织）及多余脂肪组织。
    4. 用镊子将心脏切碎成细小碎片。
    5. 取一支无菌巴斯德吸管，将其尖端以45º角斜切。
    6. 使用该巴斯德吸管通过轻柔吹打将心肌组织分散成单细胞悬液。最佳消化效果可获得单个心肌细胞的悬液。
      注意：移除移液管狭窄的底部部分，以减少因机械剪切造成的细胞膜损伤。
    7. 然后加入5 mL终止液以终止酶活性，避免过度消化的可能性。
    8. 取一个新的50 mL锥形管，将无菌的100 µm细胞滤网置于其上。
    9. 将心肌细胞悬液通过细胞筛，以去除组织块。用另外5 mL停止液冲洗培养皿和细胞筛表1收集仍附着在滤网上的任何心肌细胞。
  2. CM单细胞悬液的制备（大鼠）
    1. 将心脏从兰格多夫灌流系统中取出，移至一个盛有5 mL溶液A的100 mm培养皿中，并将培养皿移至生物安全柜内。
      注意：在将心脏从兰格多夫灌流系统中取出之前，需确保心脏充分消化。消化时间取决于酶活性、溶液流速以及心脏大小。
    2. 在生物安全柜中进行进一步的机械解离，以确保无菌并避免污染。
    3. 小心去除心房（基底部心脏组织的1/4）及额外的脂肪组织。
    4. 用镊子将心脏切碎成细小碎片。
    5. 取一支无菌巴斯德吸管，将其尖端以45º角斜切。
    6. 使用该巴斯德吸管通过轻柔吹打将心脏组织分散成单细胞悬液。最佳消化效果可获得单个心肌细胞的悬液。
      注意：移除移液管狭窄的底部部分，以减少因机械剪切造成的CM损伤。
    7. 加入5 mL溶液B（表2将溶液加入CM悬液中，然后通过100 µm细胞滤筛，以去除残留的脂肪组织或其他未消化的组织碎片。
    8. 将滤液收集到一个新的50 mL锥形管中。
    9. 使用另外5 mL溶液B冲洗培养皿以及任何残留的CM，使其通过细胞筛。

5. 去除非心肌细胞

  1. 去除成年单细胞悬液中的非心肌细胞（小鼠）
    1. 将细胞悬液以 20 × g 离心 3 分钟。
    2. 弃去上清液，并将细胞重悬于 10 mL 停止溶液中（表 1）。
      注意：增加停止溶液中 BSA 的浓度会提高其黏度，从而降低非心肌细胞的沉降速率。
    3. 通过轻轻翻转离心管 3–5 次，重悬心肌细胞。
    4. 每隔 3 分钟，加入 10 µL 的 100 µM CaCl2 溶液并混匀，重复三次。
    5. 第四次添加后，将心肌细胞悬液以 20 × g 离心 3 分钟。
    6. 弃去上清液。
    7. 将心肌细胞重悬于预热（37 ºC）的成年小鼠心肌细胞接种培养基中（表 3）。
  2. 去除成年单细胞悬液中的非心肌细胞（大鼠）
    1. 在 25 ºC 下以 20 × g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。
    2. 弃去上清液，并将细胞重悬于 25 mL 溶液 B 中（表 2）。
    3. 通过轻轻翻转混匀细胞，然后将其置于试管架中，使心肌细胞在重力作用下沉降。
    4. 小心弃去上清液。
    5. 将细胞重悬于新鲜的 25 mL 溶液 B 中，并在 3–5 分钟间隔内逐步加入 50 µL、75 µL 和 100 µL 的 0.1 M CaCl2，逐步滴定至 CaCl2 浓度达到 1.0 mM。
      注意：此步骤中可使用更高浓度的 BSA 配制溶液 B。提高溶液 B 中 BSA 的浓度可增加其黏度，从而降低非心肌细胞的沉降速率。
    6. 在 25 ºC 下以 20 × g 离心 3 分钟，吸除上清液，然后加入适量的成年大鼠细胞培养基（表 4）。
    7. 将心肌细胞接种至经层粘连蛋白包被的培养板上。
      注意：可通过将心肌细胞预先接种于未包被的培养板上，以减少非心肌细胞的污染。

6. 成年小鼠心肌细胞接种

  1. 预铺板
    1. 将心肌细胞重悬于培养基中。
    2. 分别将细胞预铺于60 mm或100 mm培养皿中，用于小鼠或大鼠心肌细胞的培养。
    3. 将心肌细胞置于含5% CO2、37 ºC的培养箱中孵育2小时。
    4. 在预铺板孵育期间，用层粘连蛋白（10 µg/mL，溶于PBS）包被细胞培养板，用于长期心肌细胞培养。
  2. 预铺板2小时后，将心肌细胞收集至50 mL锥形管中。
  3. 从培养皿中收集细胞，并将其重新铺种于经层粘连蛋白包被的24孔培养板中，用于转染实验。
  4. 将细胞置于37 ºC、含5% CO2的培养箱中培养。培养4–6小时足以使心肌细胞贴附于表面，因此可在铺板后6小时进行转染。
    注意：含FBS的铺板培养基通常被使用，并在增殖研究中表现出更好的兼容性。然而，在分析分泌因子的实验中，可使用无血清培养基。

7. 转染

  1. 将心肌细胞接种至包被有层粘连蛋白的细胞培养板中，孵育4-6小时。
  2. 心肌细胞接种到层粘连蛋白包被的培养板4小时后，使用转染试剂（例如Lipofectamine RNAiMAX），按照生产商说明书，以目标siRNA（50 nM）转染细胞。
  3. 转染后24小时更换培养基，之后每24小时更换一次，持续最多20天。
  4. 20天后，用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞，用于后续实验，包括针对心肌特异性标志物（如肌钙蛋白）的免疫细胞化学染色，以确认心肌细胞已成功实现长期培养存活。

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结果

本改进后的实验方案可高效地在体外分离和培养大鼠与小鼠的心肌细胞（CMs）。在大鼠心肌细胞的分离过程中，共使用了3只成年（12周龄）雄性Fischer 344大鼠。图1展示了该操作所需的手术装置及分离设备，各部件已在图注中进行标注和说明。采用胶原酶II型进行消化处理，成功分离出大量高质量的心肌细胞（图2A）。分离后24小时，将这些细胞转染针对Rb1和Meis2的诱导细胞周期特异性siRNA，而实验中以cel-miR-67作为转染对照11。为观察细胞形态学变化，心肌细胞在体外培养中维持7天（图2B）或长达20天（图2C）。为评估细胞周期活性，在培养第7天固定细胞，并对心肌特异性标志物肌钙蛋白I（Troponin-I）、有丝分裂标志物KI67进行免疫染色，细胞核则通过DAPI显影（图...

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讨论

建立一种用于成年心肌细胞分离和长期培养的方案，对于开展细胞特异性的机制研究至关重要。目前仅有少数报道讨论了成年心肌细胞（CM）的分离方案，而其中可用于成年小鼠心肌细胞长期培养的方案则更为稀少15,16,17。已有研究表明，成年大鼠心肌细胞对体外培养的耐受性高于成年小鼠心肌细胞10,11,12。在本报告中，我们在常规使用方案的基础上进行少量修改，建立了一套适用于成年大鼠和小鼠心肌细胞的分离、siRNA转染、长期培养以及诱导增殖下游分析的完整实验流程。

目前用于成年心肌细胞分离的方案主要基于两种广为人知的酶——胶原酶和liberase，用于消化细胞外基质（ECM）18<...

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致谢

本工作获得了辛辛那提大学医学院病理学与实验室医学系向 Onur Kanisicak 博士提供的资助；美国国立卫生研究院向 Onur Kanisicak 博士提供的基金（R01HL148598）。 Onur Kanisicak 博士获得了美国心脏协会职业发展奖（18CDA34110117）的支持。Perwez Alam 博士获得了美国心脏协会博士后基金（AHA_20POST35200267）的支持。Malina J. Ivey 博士获得了美国国立卫生研究院 T32 基金（HL 125204-06A1）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,3-丁二酮单肟Sigma-AldrichB-0753
布雷比斯塔汀APExBIOB1387
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA3059
CaCl2Sigma-Aldrich449709
细胞培养板Corning Costar3526
细胞筛BD Biosciences352360
Cel-miR-67DharmaconCN-001000-01-50
II型胶原酶WorthingtonLS004177
一次性刻度移液管Fisherbrand13-711-20
一次性聚苯乙烯称量皿Sigma-AldrichZ154881-500EA
杜尔贝科改良伊格尔培养基Thermo ScientificSH30022.01
EdULife TechnologiesC10337
胎牛血清Corning35-015-CV
精细高精度镊子Fisherbrand22-327379
葡萄糖Sigma-AldrichG-5400
血细胞计数板Hausser Scientific1483
肝素Sagent PharmaceuticalsPSLAB-018285-02
HEPESSigma-AldrichH3375
高精度直头宽尖强头镊子/镊钳Fisherbrand12-000-128
透明质酸酶SigmaH3506
胰岛素Sigma-AldrichI0516-5ML
K2HPO4Sigma-AldrichP-8281
KClSigma-Aldrich746436
光学显微镜Nikon
Lipofectamine RNAiMAXLife Technologies13778-150
MgSO4Sigma-AldrichM-2643
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHFisher ScientificS318-500
天然小鼠层粘连蛋白Invitrogen23017-015
青霉素/链霉素Corning30-002-CI
戊巴比妥Henry Schein24352
磷酸盐缓冲液Life Technologies20012-027
蛋白酶XIVSigma-AldrichP5147-1G
硒Sigma-Aldrich229865+5G
siMeis2Dharmacons161030
siRb1Dharmacons128325
直头钝/锐解剖剪Fisher Scientific28252
直头超精细精密尖头镊子Fisherbrand16-100-120
牛磺酸Sigma-AldrichT0625
转铁蛋白Sigma-AldrichT8158-100MG
超平滑斜边剪刀Fisherbrand22-079-747
水浴锅Fisher Scientific3006S

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