成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

摘要

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。

摘要

成年哺乳动物心肌细胞（CMs）的离体培养是体外研究心脏生物学最相关的实验体系。成年哺乳动物的心肌细胞是终末分化的细胞，增殖能力极低。心肌细胞的有丝分裂后状态不仅限制了其细胞周期的进程，也制约了心肌细胞的有效培养。此外，许多研究（如心肌细胞增殖及基因表达分析）都需要对成年心肌细胞进行长期培养。

小鼠和大鼠是用于心肌细胞分离的两种最常用的实验动物。尽管大鼠心肌细胞（CMs）可以进行长期培养，但成年小鼠心肌细胞容易死亡，在正常条件下无法培养超过五天。因此，迫切需要优化成年啮齿类心肌细胞的分离与长期培养方案。通过本改良方案，可成功分离并培养成年小鼠和大鼠心肌细胞超过20天。此外，分离所得心肌细胞的siRNA转染效率较以往报道显著提高。对于成年小鼠心肌细胞的分离，采用Langendorff灌流法，并使用最佳酶溶液以及足够时间以实现细胞外基质的完全解离。为获得纯化的心室心肌细胞，在开始解离和接种前，需将两个心房组织解剖并弃去。细胞被分散接种于经层粘连蛋白包被的培养板上，以实现高效且快速的贴壁。心肌细胞需静置贴壁4–6小时后，再进行siRNA转染。培养基每24小时更换一次，持续20天，随后对心肌细胞进行固定，并使用心肌特异性标志物（如肌钙蛋白）以及细胞周期标志物（如KI67）进行染色。

引言

心脏疾病是全球主要的死亡原因之一。几乎所有类型的心脏损伤都会导致成年心肌细胞（CM）显著丢失。由于成年心肌细胞具有衰老特性，成年哺乳动物心脏无法修复其损伤¹。因此，任何对成年哺乳动物心脏的损伤都会造成心肌细胞的永久性丧失，进而导致心脏功能下降和心力衰竭。与成年哺乳动物不同，斑马鱼和蝾螈等小型动物的心脏能够通过现有心肌细胞的增殖实现再生^2,3,4。目前全球正在积极开展研究，探索通过促进增殖或非增殖途径治疗心脏损伤的新型干预策略。在过去几十年中，已开发出多种遗传小鼠模型用于研究心脏损伤与修复过程。然而，使用体内动物模型仍是一种成本高昂的方法，且难以区分细胞自主性机制与继发性效应。此外，在体内系统中分析药物干预对心肌细胞特异性作用也存在挑战，尤其是当该干预通过心肌细胞诱导心脏保护信号通路时。

此外，成年心肌细胞（CM）的长期培养对于进行心肌细胞增殖分析是必要的。心肌细胞增殖检测至少需要4-5天，以诱导细胞进入细胞周期，并在此之后获得准确的数据。同时，利用分离的心肌细胞开展的电生理学研究、药物筛选、毒性研究以及Ca⁺⁺稳态研究，均需要更优化的培养体系^5,

方案

所有实验均应遵循美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》中的规定。视频中展示的所有实验方案均已获得辛辛那提大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 成年小鼠（和大鼠）心脏提取前的准备

1. 根据表1和表2中提供的配方，分别配制用于大鼠和小鼠分离的灌注液、酶液和终止液。使用0.22 µm滤膜过滤溶液，以去除任何污染物或未溶解的颗粒。
2. 将手术器械浸泡在70%酒精中15分钟进行清洁和灭菌，随后用双蒸水冲洗。将器械置于干净的纸巾上自然晾干。
3. 将水浴预热至37 ºC。检查水浴中的水位，确保在操作过程中温水能够持续循环通过灌注装置。
4. 用70%酒精以5分钟时间冲洗灌注装置。重复一次。
   注意：提高流速有助于清洗管路。
5. 酒精冲洗后，用双蒸水冲洗10分钟，以清除残留的酒精。
6. 准备3个中等大小的一次性聚苯乙烯称量皿，用于心脏切除后的清洗。每个称量皿中加入20 mL心肌细胞缓冲液。
7. 使用巴斯德移液管向每个称量皿中加入2–3滴肝素，并通过多次吹打充分混匀。
8. 取一支带有钝头针头套管的10 mL注射器。
   注意：可通过剪去洁净无菌针头的尖端制备钝头针头套管。分别使用21 G和14 G针头为小鼠和大鼠制备套管。

结果

本改进后的实验方案可高效地在体外分离和培养大鼠与小鼠的心肌细胞（CMs）。在大鼠心肌细胞的分离过程中，共使用了3只成年（12周龄）雄性Fischer 344大鼠。图1展示了该操作所需的手术装置及分离设备，各部件已在图注中进行标注和说明。采用胶原酶II型进行消化处理，成功分离出大量高质量的心肌细胞（图2A）。分离后24小时，将这些细胞转染针对Rb1和Meis2的诱导细胞周期特异性siRNA，而实验中以cel-miR-67作为转染对照¹¹。为观察细胞形态学变化，心肌细胞在体外培养中维持7天（图2B）或长达20天（图2C）。为评估细胞周期活性，在培养第7天固定细胞，并对心肌特异性标志物肌钙蛋白I（Troponin-I）、有丝分裂标志物KI67进行免疫染色，细胞核则通过DAPI显影（图.......

讨论

建立一种用于成年心肌细胞分离和长期培养的方案，对于开展细胞特异性的机制研究至关重要。目前仅有少数报道讨论了成年心肌细胞（CM）的分离方案，而其中可用于成年小鼠心肌细胞长期培养的方案则更为稀少^15,16,17。已有研究表明，成年大鼠心肌细胞对体外培养的耐受性高于成年小鼠心肌细胞^10,11,12。在本报告中，我们在常规使用方案的基础上进行少量修改，建立了一套适用于成年大鼠和小鼠心肌细胞的分离、siRNA转染、长期培养以及诱导增殖下游分析的完整实验流程。

目前用于成年心肌细胞分离的方案主要基于两种广为人知的酶——胶原酶和liberase，用于消化细胞外基质（ECM）¹⁸<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3-丁二酮单肟	Sigma-Aldrich	B-0753
布雷比斯塔汀	APExBIO	B1387
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma-Aldrich	449709
细胞培养板	Corning Costar	3526
细胞筛	BD Biosciences	352360
Cel-miR-67	Dharmacon	CN-001000-01-50
II型胶原酶	Worthington	LS004177
一次性刻度移液管	Fisherbrand	13-711-20
一次性聚苯乙烯称量皿	Sigma-Aldrich	Z154881-500EA
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Thermo Scientific	SH30022.01
EdU	Life Technologies	C10337
胎牛血清	Corning	35-015-CV
精细高精度镊子	Fisherbrand	22-327379
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G-5400
血细胞计数板	Hausser Scientific	1483
肝素	Sagent Pharmaceuticals	PSLAB-018285-02
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
高精度直头宽尖强头镊子/镊钳	Fisherbrand	12-000-128
透明质酸酶	Sigma	H3506
胰岛素	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
K2HPO4	Sigma-Aldrich	P-8281
KCl	Sigma-Aldrich	746436
光学显微镜	Nikon
Lipofectamine RNAiMAX	Life Technologies	13778-150
MgSO4	Sigma-Aldrich	M-2643
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
天然小鼠层粘连蛋白	Invitrogen	23017-015
青霉素/链霉素	Corning	30-002-CI
戊巴比妥	Henry Schein	24352
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	20012-027
蛋白酶XIV	Sigma-Aldrich	P5147-1G
硒	Sigma-Aldrich	229865+5G
siMeis2	Dharmacon	s161030
siRb1	Dharmacon	s128325
直头钝/锐解剖剪	Fisher Scientific	28252
直头超精细精密尖头镊子	Fisherbrand	16-100-120
牛磺酸	Sigma-Aldrich	T0625
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T8158-100MG
超平滑斜边剪刀	Fisherbrand	22-079-747
水浴锅	Fisher Scientific	3006S