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一种用于刺激骨细胞力传导及分析骨重塑功能结果的芯片实验室平台

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DOI：

10.3791/61076

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2020年5月21日

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

本文内容

摘要

本文介绍了在芯片实验室平台上分析骨重塑的实验方案。该平台可与3D打印的机械加载装置联用，通过形变细胞基质来诱导骨细胞的机械转导。该平台还可用于定量评估破骨细胞和成骨细胞介导的骨重塑功能结果（吸收/形成）。

摘要

骨重建是一个受到严密调控的过程，对于骨骼的生长与修复以及适应机械环境的变化至关重要。在此过程中，机械敏感性骨细胞调控着分解代谢的破骨细胞与合成代谢的成骨细胞之间的拮抗反应。为了更深入地理解调控该过程的复杂信号通路，我们实验室开发了一种基础性的芯片实验室（LOC）平台，可在小规模系统内分析骨重建的功能性结果（形成与吸收）。由于骨重建是一个持续数周至数月的长期过程，我们在此系统中建立了长期细胞培养方案。成骨细胞和破骨细胞在LOC内的功能性活性基质上培养，并维持长达七周。随后拆卸芯片，以便定量分析骨形成与骨吸收。此外，我们设计了一种3D打印的机械加载装置，可与LOC平台配合使用，通过形变细胞基质来诱导骨细胞的机械转导。我们已优化了LOC平台内骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的细胞培养方案，并解决了无菌性和细胞毒性方面的问题。本文介绍了LOC的制备与灭菌、在功能性基质上接种细胞、施加机械负荷以及拆卸LOC以量化终点结果的实验方案。我们认为，这些技术为构建真正意义上的骨重建类器官芯片奠定了基础。

引言

骨是一种高度动态的组织，其功能依赖于三种主要细胞类型——骨细胞、成骨细胞和破骨细胞之间的复杂协调。这些细胞之间的多细胞相互作用，既导致了瘫痪和长期不动所引发的骨量丢失，也介导了生长和运动刺激所引起的骨形成。骨细胞是骨组织中最丰富的细胞类型，对施加于骨的机械刺激具有高度敏感性。机械刺激会改变骨细胞的代谢活性，并导致关键信号分子的增加1,2。通过这一被称为“机械转导”的过程，骨细胞能够直接调控成骨细胞（骨形成细胞）和破骨细胞（骨吸收细胞）的活动。维持骨稳态需要骨形成与骨吸收速率之间的精确平衡；然而，这一过程的紊乱可导致骨质疏松症或骨硬化症等疾病状态。

这三种细胞类型之间相互作用的复杂性非常适合利用微流控和芯片实验室（LOC）技术进行研究。为此，我们实验室近期已成功建立了一种用于分析骨重建过程中骨吸收与骨形成（功能结果）的LOC平台的概念验证。该平台可用于细胞间相互作用、不同力学载荷环境以及药物筛选研究。近年来，已有多种微流控装置被开发用于研究调控骨重建的分子信号通路；然而，这些系统中的许多仅通过间接标志物来量化骨重建过程，而这些标志物仅能反映功能活性3,4,5,6,7。我们系统的优点在于能够直接量化功能结果。骨重建是一个长期过程，因此对骨吸收和骨形成的直接量化需要一种可维持数周至数月的培养系统8,9,10,11。因此，在开发LOC平台时，我们建立了实现骨形成与吸收所必需的长期培养方案，并已在系统中成功维持细胞培养长达七周11。此外，我们在平台中整合了适用于两类细胞的适当培养基底：破骨细胞直接在骨基质上培养，而成骨细胞因其已知具有塑料黏附特性，故培养于聚苯乙烯圆片上。同时，我们还解决了与无菌性、长期细胞毒性以及芯片拆卸以进行骨重建分析相关的问题11,12。

LOC 平台还可通过基质形变诱导骨细胞的机械转导。我们开发了一种3D打印的机械加载装置，可与LOC配合使用，施加静态的面外扩张力以拉伸细胞13。为适应这种机械负荷，LOC中微孔的深度已增加。这种小型、简单的机械加载装置易于由工程经验有限的实验室制备，我们此前已公开了3D打印组件的设计图纸13。在本研究中，我们展示了成功使用LOC所需的一些创新技术。具体而言，我们演示了芯片制备、在功能化基底上接种细胞、机械加载以及为量化重塑而进行的芯片拆解。我们认为，这些技术的说明以可视化形式呈现更具优势。

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方案

1. 芯片掩模制备

注意：步骤 1.1 - 1.3 仅需在首次收到芯片掩膜时执行一次，以确保掩膜在使用过程中不会发生弯曲。11,14 微流控掩膜的设计此前已有描述。掩膜由本实验室自行设计，并通过商业途径采用高分辨率立体光刻技术加工制成（图 1A）。

  1. 用塑料薄膜覆盖掩膜的顶面，以保护该表面免受粘合剂污染。使用喷雾粘合剂将芯片掩膜固定在尺寸相同的亚克力板上。将两部分用夹具夹紧过夜，使粘合剂充分固化。待粘合剂干燥后，从掩膜顶部移除塑料薄膜。
  2. 使用双面胶带将亚克力板的底部固定到一个3D打印的调平盒上（补充图1，补充文件1-4）。用力按压，确保粘接牢固。
  3. 使用防水密封剂密封调平盒可拆卸壁附近的任何小缝隙。让密封剂固化24小时。
  4. 用70%乙醇（EtOH）清洁掩膜表面。将带有目标芯片掩膜的调平盒放入烘箱中。使用数字量角器确保掩膜顶部水平，必要时调节调平螺丝。

2. PDMS 制备

注意：功能活性（形成与吸收）检测采用浅孔（1 mm）芯片设计，而机械加载研究采用深孔（10 mm）芯片设计。深孔的底部通过连接一张独立的薄PDMS膜构成（图1B）。

  1. 盖层（第1层）
    1. 将63 g PDMS预聚物与6.3 g固化剂（10:1比例）混合于塑料杯中，使用一次性细胞刮刀充分混合，并在真空干燥器中脱气30分钟。
    2. 将混合物缓慢倒入已准备好的调平盒中。让PDMS静置30分钟，然后在45 °C下烘烤18小时。
    3. 使用锥形实验室刮刀松动PDMS边缘，并将聚合物片从调平盒中取出。
    4. 使用手术刀和3D打印模板，将单个盖片裁切至所需尺寸（70 mm × 34 mm）。
    5. 使用穿刺活检打孔器（直径1 mm）在每个盖片上打出通孔。
    6. 用包装胶带对盖片表面进行清洁。
      注：若盖片不立即使用，请用包装胶带逐个包裹，并在室温（RT）下储存。
  2. 孔井与微通道层（第2层）
    1. 将PDMS预聚物与固化剂按10:1比例混合于塑料杯中。浅孔设计需使用43 g预聚物和4.3 g固化剂，深孔设计需使用227 g预聚物和22.7 g固化剂。充分搅拌聚合物混合物，并脱气30分钟。
      注：此用量基于掩模尺寸为152.4 mm × 152.4 mm的假设。
    2. 将混合物缓慢倾倒至相应已调平的掩模上。让PDMS静置30分钟，然后在45 °C下烘烤18小时。
    3. 使用锥形实验室刮刀松动PDMS边缘，并小心地将聚合物从掩模上剥离。使用手术刀和3D打印模板切割出单个芯片。
      注：在进行装载实验时，确保芯片尺寸（70 mm × 34 mm）精确，并且孔井位于芯片中心至关重要。
    4. 用包装胶带对PDMS表面进行清洁。
      注：若芯片不立即使用，请用包装胶带逐个包裹，并在室温（RT）下储存。
  3. 薄PDMS膜层（第3层）
    注：此层仅用于深孔设计。
    1. 将12.7 g PDMS预聚物与1.3 g固化剂（10:1比例）加入塑料杯中，充分搅拌并脱气30分钟。
    2. 将聚合物缓慢倒入已准备好的调平盒中，并彻底刮净塑料杯内壁，尽可能转移全部PDMS。
    3. 使用细胞刮刀将PDMS均匀涂布在整个表面。
      注：若不手动铺展聚合物，表面张力将导致聚合物无法形成均匀的薄膜。
    4. 让PDMS静置30分钟，然后在45 °C下烘烤18小时。
    5. 使用锥形刮刀松动PDMS边缘，并小心地将PDMS膜从调平盒中取出。裁切出与第2层尺寸匹配的单个膜片。
    6. 使用卡尺测量膜片中心处的厚度。丢弃任何厚度超出目标范围（0.5 mm ± 0.1 mm）的膜片。
    7. 小心地用包装胶带清洁膜片，并将其放置在石蜡膜上。
      注：若膜片不立即使用，请用包装胶带覆盖其顶部，并在室温（RT）下储存。

3. 功能活性底物

注意：聚苯乙烯圆片和骨薄片必须分别固定在将用于成骨细胞和破骨细胞培养的孔板底部。

  1. 聚苯乙烯圆片（图1C）
    1. 将遮蔽胶带贴在经组织培养处理的聚苯乙烯盖玻片背面，使用锋利的打孔器（5.4 mm直径）从盖玻片上切割出圆形圆片。将圆片浸入70%乙醇中，过夜放置。
    2. 用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭圆片的上表面，确保圆片外缘被彻底清洁。
    3. 使用两把镊子夹住圆片，撕去背面的遮蔽胶带。将处理面朝下放置圆片，并用棉签清洁其背面。
    4. 将棉签的木端浸入脱气后的未固化PDMS混合物中，取少量聚合物滴加至目标孔的底部。
      注意：剩余未固化的PDMS可于-20 °C保存。
    5. 将聚苯乙烯圆片处理面朝上放入孔中，用棉签轻轻按压圆片。确保未固化的PDMS不与圆片的处理面接触。
      注意：若PDMS接触到圆片的处理表面，应将圆片从孔中取出，并更换新圆片，重复步骤3.1.4和3.1.5。
    6. 将芯片置于水平面上静置30分钟，随后在65 °C下烘烤4小时。
  2. 骨片
    1. 用镊子将一片骨片（直径6 mm，厚0.4 mm）放置于100 mm培养皿底部。用镊子固定骨片，再用手术刀在其背面轻轻刻划一个“X”形标记。
      注意：在成像过程中，该“X”形标记用于区分骨片背面与接种细胞的表面。
    2. 用棉签的木端蘸取少量未固化PDMS，滴加至目标孔的底部。将骨片有标记的一面朝下放入孔中，并用棉签将其压紧。
    3. 将芯片置于水平面上静置30分钟，随后在65 °C下烘烤4小时。

4. 芯片组装与灭菌

  1. 使用中等射频（RF）功率设置（相当于约10.2 W），用等离子清洗仪对第1层和第2层表面活化处理30秒。
  2. 将第1层的通路孔与第2层的微通道对齐，并将两层紧密压合在一起。
  3. 对于深孔设计，将步骤4.1重复应用于第2层和第3层。在等离子处理过程中，使用双面胶带将第3层的石蜡膜固定在平坦表面上。
  4. 使用手术刀修剪掉PDMS膜多余的材料。小心地从芯片底部剥离石蜡膜片。
  5. 将芯片在65 °C下烘烤10分钟，以增强PDMS层之间的键合强度。
  6. 将斜角加样头（18号，0.5英寸，90°）插入盖子上的通路孔中，并用双组分环氧树脂将加样头固定在盖子上。使用移液器吸头在每个加样头周围涂抹环氧树脂。
  7. 待环氧树脂完全固化后，用70%乙醇对芯片表面进行清洁，并将其置于生物安全柜中。后续所有操作均应在生物安全柜内进行。
  8. 使用无菌硅胶管（内径1/32英寸，长约10 cm）将5 mL注射器连接至加样头，并用70%乙醇充满整个芯片，至少冲洗30秒。对于浅孔设计，所有液体均通过设定流速为4 mL/h的注射泵给液；对于深孔设计，所有液体均通过手动缓慢推动注射器加样。
  9. 从芯片中移除乙醇，并用紫外光对芯片过夜灭菌。
  10. 用dH2O清洗芯片3次。将芯片充满dH2O，从加样头移除管路，并在37 °C下孵育至少48小时。

5. 机械加载装置组装

注意：3D 打印机械加载装置（图 2A-C）的设计与制造过程此前已有描述，所有打印部件的设计文件此前均已提供13。

  1. 将加载装置的所有组件在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
    注意：为避免打印部件变形，应在灭菌过程中用铝箔将每个部件单独包裹，并放置在坚硬的平面上。金属配件可一起包裹。所有后续步骤均需在生物安全柜内完成。
  2. 将一个压缩弹簧套在压头的轴上，并将压头插入底座底部中央的孔中（图 2D）。
  3. 使用四个自攻螺钉将刻度盘块固定到底座底部。
  4. 将第二个压缩弹簧套在中心螺钉上。将螺钉插入刻度盘底部的六角形孔中，并将组件旋入刻度盘块中心的螺纹孔内。
  5. 将四个公母支柱旋入底座底部。
  6. 通过逆时针旋转刻度盘以消除装置中的松动，直至压头顶端低于底座顶端。然后缓慢顺时针旋转刻度盘，直到压头顶端与底座顶端齐平。

6. 实验

注意：功能性活性实验的方案此前已有提供11,12。

  1. 加载实验（图3）
    1. 在完成步骤4.9后，使用5 mL注射器从深孔芯片中移除dH2O。在0.02 M乙酸中加入200 µL浓度为0.15 mg/mL的I型胶原蛋白（CTI），覆盖孔底，孵育1小时。
    2. 用含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS++）清洗芯片三次。
    3. 将芯片放入芯片支架中，并在最低必需培养基α（MEMα）中以2 × 104 个细胞/mL的密度接种MLO-Y4骨细胞，该培养基添加有5%小牛血清、5%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。
    4. 将输注管路从分配尖端取下，将芯片放入深孔培养皿（150 mm × 25 mm）中。在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞72小时。
    5. 将无菌管路连接至分配尖端，使用5 mL注射器从芯片中移除用过的培养基。缓慢加入新鲜培养基以重新充满芯片。
    6. 将芯片支架放入加载装置底座顶部的矩形凹槽内。将管路穿过加载装置盖板上的槽口，并用四个盘头螺钉和六角螺母将盖板固定到底座上。
      注意：为确保盖板保持水平，应先拧紧对角线位置的两个螺钉，再固定其余两个螺钉。
    7. 通过顺时针旋转旋钮对细胞施加负载，直至达到所需的压头位移。
      注意：该装置设计为旋钮每旋转一圈对应压头位移1 mm。此前已通过有限元分析（FEA）13模拟了PDMS膜顶部应变场与压头位移之间的函数关系。
    8. 将加载装置放入一个空的P1000移液器吸头盒中。在施加负载的条件下孵育细胞15分钟。
      注意：此处使用的加载时间仅为示例，也可采用其他加载时间。
    9. 孵育结束后，逆时针旋转旋钮以解除细胞上的负载，直至压头恢复至初始起始位置。取下装置盖板，将芯片支架放回深孔培养板中。继续孵育细胞90分钟，进行加载后恢复期。
      注意：此处的恢复时间同样仅为示例，也可采用其他恢复时间。对于长期实验，应每隔72小时更换一次培养基。
    10. 使用5 mL注射器从芯片中移除条件培养基。
      注意：该培养基可保存并在-80 °C下储存。
    11. 将芯片从芯片支架中取出，使用锥形刮刀破坏PDMS盖层与孔层之间的粘合。
      注意：现在可按照适用于细胞培养板的任何既定方案进行细胞检测。

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结果

浅孔结构可用于分析成骨细胞和破骨细胞的功能活性。通过成骨细胞介导的骨形成以及通过破骨细胞介导的骨吸收需要数周至数月的培养时间。使用茜素红和冯·科萨染色法对MC3T3-E1前成骨细胞的骨形成情况进行定量分析11,15。在第49天，茜素红染色的平均表面积为10.7% ± 2.2%（均值 ± 均值标准误）11，冯·科萨染色的平均表面积为6.4% ± 1.6%11。图4A展示了第49天成骨细胞培养中经茜素红和冯·科萨染色后的典型骨形成结果。使用甲苯胺蓝染色对RAW264.7前破骨细胞的骨吸收情况进行定量分析11,15。在第30天，甲苯胺蓝染色的平均表面积为30....

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讨论

本文介绍了构建用于培养骨细胞、破骨细胞和成骨细胞的骨重塑器官芯片平台的基础方法。通过改变芯片内微孔的深度和尺寸，开发出多种配置，用于对骨细胞施加机械负荷，并量化骨重塑的功能性结果（图1B）。

在芯片组装过程中，优化等离子体氧化方案对于消除泄漏问题至关重要。我们发现，将PDMS表面暴露于中等射频功率（约10.2 W）条件下产生的氧气等离子体中30秒（步骤4.1），足以在各层之间形成牢固的键合。当使用更长的处理时间或更高的射频功率时，键合的完整性会下降。这与先前的报道一致，即PDMS过度暴露于氧气等离子体会增加表面粗糙度并降低粘附性17,18。

此外，细胞存活率和典型细胞形态的维持在很大程度上依赖于PDMS的固化过程。PDMS聚合物由交联的二甲基硅氧烷低聚物组成。该交联过程受时间和温度共同影响；然而，即使经过充分固化，聚合...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了国家科学基金会资助（项目编号：CBET 1060990 和 EBMS 1700299）。此外，本材料基于获得国家科学基金会研究生研究奖学金计划资助（项目编号：2018250692）所开展的研究。本文中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者个人观点，并不一定反映国家科学基金会的观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亚克力板Optix--3.175 mm 厚
斜口分液尖Jensen GlobalJG18-0.5X-90使用前移除塑料连接头
活检打孔器Robbins InstrumentsRBP-10直径 1 mm
骨片Boneslices.com0.4 mm 厚牛皮质骨
新生牛血清HycloneSH30072
卡尺Global IndustrialT9F534164
细胞刮刀TPP99010
芯片掩模ProtoLabs定制设计打印材料：Accura SL 5530
打孔器Fisher Scientific07-865-10B
棉签Puritan806-WCL
培养皿（100 mm）Corning430591无菌，非组织培养处理
培养皿（150 mm）Corning430597无菌，非组织培养处理
双面胶带3M CompanyScotch 237
胎牛血清HycloneSH30910
镊子Fisher Scientific22-327379
调平盒定制--3D 打印
遮蔽胶带3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 前成骨细胞ATCCCRL-2593亚克隆 4
机械加载装置定制--3D 打印
最低必需培养基 α 液Gibco12571-063
MLO-Y4 骨细胞----由 Lynda Bonewald 博士惠赠
包装胶带Duck Brand--标准包装胶带
石蜡膜Bemis ParafilmPM999
青霉素/链霉素Invitrogenp4333
等离子清洗机Harrick PlasmaPDC-001扩展型等离子清洗机
聚二甲基硅氧烷试剂盒Dow CorningSylgard 184
聚苯乙烯盖玻片Nunc Thermanox174942无菌，组织培养处理
烘箱Quincy Lab12-180
RAW264.7 前破骨细胞ATCCTIB-71
手术刀BD Medical372611
硅胶管Saint-Gobain TygonABW00001内径：1/32" (0.79 mm)，外径：3/32" (2.38 mm)
SolidWorks 软件Dassault Systèmes--用于生成 3D 打印模型并进行有限元分析（FEA）
喷雾粘合剂Loctite2323879多用途粘合剂
注射器（5 ml）BD Medical309646无菌
注射泵Harvard Apparatus70-2213Pump 11 Pico Plus
锥形实验室刮刀Fisher Scientific21-401-10
双组分环氧树脂Loctite13953915 分钟快干型
I 型胶原蛋白Corning354236大鼠尾胶原
真空干燥器Bel-ArtF42010-0000
防水密封剂Gorilla8090001100% 硅酮密封剂

参考文献

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