基于通量的骨关节炎自噬调节剂筛选检测方法

摘要

本文详细介绍了通过基于细胞成像的筛选来监测自噬流，以鉴定新的分子。

摘要

自噬是调节稳态的核心机制。自噬的异常与衰老相关疾病的发生发展密切相关。用于鉴定自噬调控因子的表型筛选方法可用于发现新的治疗手段。本文介绍了一种基于细胞成像的筛选流程，用于在人软骨细胞中以LC3作为自噬流报告分子（mCherry-EGFP-LC3B）来监测自噬流。数据采集采用自动化高内涵成像筛选系统显微镜完成。本研究开发并验证了一种基于算法的自动化图像分析方案，用于识别可激活自噬流的分子。文中报告了关键实验步骤、说明性注释以及相较于现有自噬监测方案的改进之处。针对衰老特征的生理相关性表型筛选策略，有助于为衰老相关肌肉骨骼疾病开发更有效的药物发现路径。

引言

许多慢性疾病与衰老的特征相关，包括缺陷 自噬¹骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，对老年人群的日常活动能力有重大影响，但目前尚无有效的预防措施或可改变疾病进程的治疗方法。².

关节老化和骨关节炎（OA）与软骨退变进展的标志性特征相关，包括自噬功能障碍和细胞衰老^3,4。针对肌肉骨骼组织中的自噬过程，有助于发现风湿性疾病的新疗法^5,6。在临床前疾病模型中，药理学调控自噬是一种具有前景且相关的干预机制⁷。在骨关节炎中，激活自噬已被用于预防关节功能障碍⁸。基于可靠且可重复的实验方案、能够实现定量分析的自噬监测方法，可用于发现新型药物，并推动针对衰老相关疾病特征的药理学干预。

自噬流反映自噬降解活性，是识别激活自噬新分子的相关检测指标⁹。本研究描述了一种通过使用人软骨细胞（TC28a2）中的自噬报告细胞系测量自噬降解活性来确定自噬流的方法。通过瞬时表达mCherry-EGFP-LC3，可在活细胞溶酶体中利用GFP与mCherry-LC3信号对pH敏感性的差异，同步监测自噬溶酶体的形成与降解过程¹⁰。

将此流式细胞术报道的方法应用于活软骨细胞中的稳定表达成像监测系统，可能有助于识别在软骨生物学背景下激活自噬流的分子。

方案

1. 永生化人软骨细胞自噬报告细胞系的构建

注意：通过建立流式细胞术定量读数，以稳定转染 pBABE-mCherry-GFP-LC3 构建自噬报告细胞系的方法此前已有描述¹¹。逆转录病毒转染实验中使用了两种细胞系：在共转染过程中使用 HEK 293-T17，在感染步骤中使用 T/C28a2。

1. 共转染过程
   1. 准备HEK 293-T17细胞的培养基：500 mL Eagle最小必需培养基（EMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。将培养基储存在4 °C，每次使用前预热至37 °C。
   2. 接种 1 × 10⁶ 每孔接种 HEK 293-T17 细胞至 100 mm 细胞培养皿中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养₂，并确保在开始共转染过程前细胞融合度达到约75%。
   3. 移除培养基，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗，然后加入8 mL含2% FBS和1% P/S的EMEM。
   4. 在锥形管中，分别加入 10 μg、3 μg 和 7 μg 的 pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B、VSV.G 和 pCL-Eco 质粒。然后加入 200 μL 1x 低血清培养基（材料表）。加入转染试剂（材料表) 作为非脂质体形式的脂质混合物，其比例为1:3（1 μg DNA : 3 μg 转染试剂；终体积 = 60 μL）。
      注意：每块10 cm细胞培养板转染需准备20 μg混合物。
   5. 室温孵育混合物20分钟。将转染混合物逐滴小心加入HEK 293-T17包装细胞中。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂ 至少在荧光显微镜检测绿色和红色蛋白表达前48 h。
      注意：在此条件下，应有超过75%的细胞呈荧光阳性。确保转染效率较高（例如，超过75%的细胞呈阳性）。使用高质量的质粒DNA（例如，以超螺旋为主，无基因组DNA、RNA和蛋白质污染，高浓度，无内毒素和盐类）以及高质量的细胞培养物（例如，均一性好、低代次、单层贴壁生长、处于指数生长期转染，无支原体污染）。
2. 在共转染当天，准备 T/C28a2 软骨细胞。
   1. 配制T/C28a2细胞培养基：500 mL达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。将培养基储存于4 °C，每次使用前预热至37 °C。
   2. 接种 2 × 10⁵ 在两块6孔多孔板中培养T/C28a2软骨细胞，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育48 h₂.
3. 逆转录病毒感染过程
   1. 吸弃步骤1.1.5中获得的HEK 293-T17逆转录病毒包装细胞的培养基。用4 mL HBSS冲洗1次，吸弃HBSS。
   2. 加入2 mL胰蛋白酶，在37 °C孵育2分钟。加入6 mL HEK 293-T17培养基中和胰蛋白酶，将细胞和培养基转移至15 mL锥形管中。
   3. 以 400 x 离心细胞 g 5 分钟后，将上清液通过 0.45 μm 滤膜转移至无菌滤器中。
   4. 吸弃6孔多孔板中T/C28a2软骨细胞的培养基。每孔加入2 mL病毒悬液（步骤1.3.3），对T/C28a2细胞进行感染。设一孔为对照组（即未转染细胞），加入2 mL T/C28a2细胞生长培养基代替病毒悬液。
   5. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 48 小时₂.
4. 为进行筛选过程，对转染细胞使用抗生素筛选，以消除未转染的细胞并获得均一的细胞群体。
   注意：pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B 逆转录病毒载体可使哺乳动物细胞获得对嘌呤霉素的抗性，从而在病毒转染后实现稳定细胞系的筛选。为有效筛选出高表达外源基因的细胞克隆，应预先针对 T/C28a2 软骨细胞建立杀灭曲线，以确定嘌呤霉素的最佳使用浓度。
   1. 制备T/C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B稳定细胞系培养基：500 mL DMEM、10% FCS、1% P/S和2.5 µL/mL嘌呤霉素。将培养基于4 °C保存，每次使用前预热至37 °C。
   2. 更换培养基。对于每个6孔板，吸除培养基，用2 mL HBSS冲洗1次，然后吸除HBSS。加入2 mL新鲜培养基，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂这是筛选过程的开始。
   3. 每2天更换一次培养基，观察死亡细胞及嘌呤霉素抗性细胞群体。将结果与未转染的对照细胞进行比较，后者不具有嘌呤霉素抗性并会死亡。
5. 开始克隆筛选前，需确认单克隆群体已生长。对于每个6孔板：
   1. 向96孔板的每个孔中加入200 µL培养基。
      注意：从6孔板中选出的每个单细胞将分别接种于96孔板的各个孔中。
   2. 使用显微镜鉴定6孔多孔板中的每个单克隆群体，可观察到由单个细胞形成的克隆。
   3. 从6孔板中吸除培养基，用2 mL HBSS冲洗1次，然后吸除HBSS。
   4. 向每个单克隆群体中加入 10 µL 胰蛋白酶，将单个细胞转移至 96 孔板的每个孔中。在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 48 小时₂.
6. 48小时后，每孔更换为100 μL新鲜培养基。重复此操作，直至单个细胞扩增形成克隆。
7. 单个细胞充分扩增后，将每个单克隆群体分别接种至24孔、6孔和100 mm细胞培养板的独立孔中。
8. 使用单细胞分选方法建立稳定的单克隆细胞系
   1. 从100 mm细胞培养板中吸除培养基，加入8 mL HBSS冲洗一次，随后吸除。
   2. 每孔加入 2 mL 胰蛋白酶，37 °C 孵育 2 分钟。加入 8 mL 培养基以中和胰蛋白酶。
   3. 以 252 x g 离心细胞 g 5 分钟后弃去上清液。向每份细胞沉淀中加入 4 mL HBSS，轻轻重悬，并转移至流式管中。
   4. 将每份细胞样品注入流式细胞仪（材料表利用细胞分选技术，分离出绿色和红色荧光较强的细胞。
   5. 将选定的细胞转移至15 mL离心管中，在252 x g条件下离心细胞 g 5分钟。将细胞沉淀加入含有9 mL稳定细胞系生长培养基的T-25培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂.
      注意：细胞分选后，获得三个单克隆群体（表1应获取。
9. 24小时后，弃去培养基，加入8 mL新鲜培养基。每2天重复此操作，直至细胞达到汇合状态。
   注意：为研究自噬流，可使用两种对照：雷帕霉素作为高自噬流信号参照，氯喹作为低自噬流信号参照. 配制10 mM雷帕霉素（rapamycin）储备液于二甲基亚砜（DMSO）中，以及30 mM氯喹（chloroquine）储备液于H₂O，并在 -20 °C 下保存。为通过检测 mCherry 和 GFP 表达筛选最佳单克隆群体，可采用两种方法：流式细胞术（步骤 1.10）或高内涵荧光图像分析（步骤 1.11）。
10. 流式细胞术
    1. 接种 2.5 × 10⁵ 每12孔板中各单克隆细胞群接种细胞，每孔加入1 mL稳定细胞系生长培养基，处理前至少培养24小时，于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.
    2. 在处理当天，吸除培养基，每孔加入1 mL含2% FCS的稳定细胞系生长培养基。向含2% FCS的稳定细胞系生长培养基中加入10 μM雷帕霉素和30 μM氯喹，于37 °C、5% CO₂条件下孵育16 h。₂.
    3. 吸除培养基，每孔用 1 mL HBSS 洗涤一次，然后吸除。
    4. 每孔加入 500 µL 胰蛋白酶，37 °C 孵育 1 分钟，再加入 500 µL 培养基以中和反应。刮取细胞并转移至锥形管中。
    5. 以 252 x g 离心细胞 g 5分钟，吸除上清液。用500 µL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞沉淀。在252 x g 5 分钟后弃去上清液。
    6. 加入 500 µL PBS，将细胞转移至流式管中，然后将每个样本注入流式细胞仪。每种条件下收集 10,000 个事件。
    7. 使用488 nm激光激发EGFP，633 nm激光激发mCherry，通过流式细胞术筛选单克隆细胞群。随后，建立mCherry与EGFP荧光的比值，以筛选自噬流高和低的细胞群体。
11. 高内涵荧光图像分析
    1. 种子 4 x 10³ 每孔接种384孔板（黑色壁/透明底）中各单克隆细胞群体的细胞，培养基中添加10% FCS、1% P/S和2.5 µL/mL嘌呤霉素。37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 处理前24小时
    2. 吸去培养基，每孔加入含 2% FCS 的稳定细胞系生长培养基 50 µL，其中添加 10 μM 雷帕霉素和 30 μM 氯喹。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16 小时。₂.
    3. 吸除培养基，每孔用 50 µL HBSS 洗涤一次，吸弃。加入 4% 多聚甲醛（PFA）于 37 °C 固定 10 分钟。移除 PFA，每孔用 50 µL HBSS 洗涤一次。
    4. 用 Hoechst 33342（2.5 µg/mL）在 37 °C 下染色 10 分钟以标记细胞核。吸除 Hoechst 33342 染液，每孔加入 50 µL HBSS 洗涤一次，随后每孔加入 50 µL PBS。
    5. 按照第3节所述，对高通量筛选平台获得的自噬流数据进行采集与分析。
       注意：单克隆群体的筛选标准取决于雷帕霉素或氯喹处理后自噬流是增加还是减少（表1mCherry 和 GFP 表达水平较高的克隆更适合用于自噬流的高内涵荧光图像分析定量。

2. 活体软骨细胞中基于成像的自噬流检测

注意：在筛选出克隆后，开始进行实验以定量自噬流。

1. 使用手持式电子384通道移液器，将选定克隆（步骤1.11）的4 × 10³个细胞接种至384孔板（黑色孔壁/透明孔底）中，每孔体积为50 µL，培养基为含10%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素（P/S）和每孔2.5 µL/mL嘌呤霉素的稳定细胞系生长培养基。在处理前，于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
2. 在实验当天，准备用于添加化合物的中间稀释板。
   1. 分别使用声波液体处理技术及电子384通道移液器，向中间稀释板中加入各化合物/对照品以及稳定细胞系生长培养基，以获得所需的中间浓度。
      注：本实验中的对照包括添加2% FCS的稳定细胞系生长培养基、30 μM氯喹和10 μM雷帕霉素。中间浓度取决于所需的最终浓度。例如，在本实验中，每孔加入50 µL含稳定细胞系生长培养基的溶液，使氯喹和雷帕霉素的中间浓度分别为300 µM和100 µM。
   2. 使用微孔板洗板机机器人，自动吸除细胞培养板中的培养基，并向每孔加入45 µL含2% FCS的稳定细胞系生长培养基。
   3. 然后使用另一台自动化液体处理工作站，将中间稀释板中每孔5 µL液体转移至检测板，以获得最终浓度。
3. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育16小时。使用微孔板洗板机机器人吸除培养基。
4. 每孔加入50 µL 4%多聚甲醛（PFA），于37 °C固定10分钟。随后每孔用50 µL HBSS洗涤一次。
5. 用Hoechst 33342（2.5 µg/mL）对细胞核染色10分钟（37 °C）。吸除Hoechst 33342染液，并用每孔50 µL HBSS冲洗。
6. 每孔加入50 µL PBS。此时，该微孔板已准备好进行读板、数据采集及后续分析。
   注：本方案适用于高通量筛选（HTS）。然而，若仅使用少量化合物，也可手动添加，无需依赖自动化仪器。使用校准过的液体处理设备和/或电子移液器对细胞和上清液进行最小程度的操作，有助于成功制备细胞单层，用于通过高内涵荧光成像分析定量自噬流。

3. 自噬流的数据采集与分析

1. 进行数据采集时，使用高内涵筛选系统（HCS）和自动显微镜，该系统可通过图像处理算法实现自动化的图像采集与分析。
2. 为建立采集方案，选择多个通道和曝光时间（表2），以识别自噬流过程中细胞核以及自噬小体和自噬溶酶体的形成情况。
3. 对每个孔，从覆盖孔表面的四个视野区域采集图像，并以8 µm为起始位置、以0.2 µm的工作距离间隔采集四层焦平面图像。使用60倍物镜拍摄图像，以获得详细的细胞成像。
4. 使用HCS显微镜配套的图像分析软件进行数据分析。为建立稳健的自噬流监测分析方案算法，需选择最适合的自动细胞图像分割方法，并特异性检测对应LC3激活的斑点信号。按以下描述添加方法、细胞分割步骤和定量指令，完成最终的分析流程：
   1. 点击Find Nuclei模块，选择核染料通道Hoechst 33342。选择Method，并设定输出群体为Nuclei。
   2. 点击Find Cytoplasm模块，选择胞质染料通道Fluorescein。选择Method | Individual Threshold。
   3. 点击Find Cytoplasm (2)模块，选择胞质染料通道RFP。选择Method | Individual Threshold。
   4. 点击Population模块，选择研究群体Nuclei。选择方法Common filters (Remove border objects)，并设定输出群体为Nuclei Inside Borders。
   5. 点击Find Spots模块，选择特异性标记通道Fluorescein。选择研究群体为Nuclei Inside borders，并选择研究区域为Cytoplasm。选择Method，并设定输出群体为Spots Inside Borders。
   6. 点击Find Spots (2)模块，选择特异性标记通道RFP。选择研究群体为Nuclei Inside borders，并选择研究区域为Cytoplasm (2)。选择Method，并设定输出群体为Spots (2) Inside Borders。
   7. 点击Calculate Intensity Properties模块，选择特异性标记通道Fluorescein。选择研究群体为Nuclei Inside Borders，并选择研究区域为Spot。选择Method，并设定输出参数为Intensity Spot Fluorescein Inside Borders。
   8. 点击Calculate Intensity Properties模块，选择特异性标记通道RFP。选择研究群体为Nuclei Inside Borders，并选择研究区域为Spot (2)。选择Method，并设定输出参数为Intensity Spot (2) RFP Inside Borders。
   9. 点击Define Results模块，选择群体Nuclei Inside Borders，选择Number of Objects of Nuclei (Mean)，选择Relative Intensity Spots Fluorescein – mean per well，并选择Relative Intensity Spots (2) – RFP – mean per well。
5. 为定量自噬流，采用此前用于流式细胞术分析的相同方法¹¹。计算mCherry/EGFP的相对强度斑点比值。
   注意：自噬流较高的细胞绿色较弱，导致细胞中mCherry/EGFP比值升高。准确识别并定量来自细胞自噬流事件的相关信号数量，对于确立具有统计学意义的差异至关重要。

结果

可通过药物调节或细胞应激反应来监测细胞中的自噬流。本研究采用永生化人软骨细胞（T/C28a2）构建以LC3为荧光报告分子（mCherry-EGFP-LC3B）的自噬报告细胞系。图1展示了筛选实验的示意图，包括在人软骨细胞中构建自噬报告细胞系（mCherry-EGFP-LC3-T/C28a2）、通过药物调节诱导或抑制自噬流，以及随后使用高内涵成像显微镜进行数据分析。图2展示了基于细胞成像的检测方法示意图，通过监测自噬流来鉴定自噬调节剂。该系统的基础在于EGFP荧光对自噬溶酶体酸性环境的敏感性高于mCherry。图3展示了从基于细胞的图像中定量分析自噬流的步骤序列。图4展示了分别以氯喹和雷帕霉素处理后，低和高自噬流的代表性图像，其自噬水平由mCherry/GFP比值表示。

讨论

自噬功能障碍是衰老相关关节退变的重要特征，但目前尚无针对软骨退变、以自噬为靶点的预防性或疾病修饰性治疗手段²。鉴于其重要性及临床意义，自噬已成为药物发现与开发的关注靶点，然而直接监测这一关键稳态机制变化的方法仍面临挑战。

本文介绍了一种基于细胞的表型检测方法，用于测定活体人软骨细胞中的自噬流。该方法采用含自噬激活双报告系统 mCherry-EGFP-LC3 的质粒，利用 GFP 与 mCherry 在活细胞中对 pH 敏感性的差异，通过流式细胞术同时监测自噬溶酶体的形成与降解过程¹¹。稳定高表达 mCherry-EGFP-LC3B 的人软骨细胞可用于精确监测自噬小体流的动力学变化。利用软骨细胞进行基于细胞成像的检测可识别自噬调节剂，因为自噬溶酶体形成所引起的动态 pH 变化可被实时观察。当自噬被激活时，吞噬泡和自噬小体形成并捕获待降解的底物。LC3 的脂化修饰、整合至自噬小体膜以及与底物受体的相互作用，形成 pH ≥ 6.0 的碱性环境，对应绿色荧光发射。若自噬流持续进行，自噬小体将与溶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养板	Corning	430167	细胞培养板
12 孔多孔板	Corning	353043	细胞培养板
15 mL 离心锥形管	Falcon-Corning	352095	离心锥形管
24 孔多孔板	Corning	351147	细胞培养板
25 cm² 细胞培养瓶	Falcon-Corning	353014	细胞培养瓶
384 孔多孔板细胞载体	Perkin Elmer	6007550	细胞培养板
6 孔多孔板	Corning	351146	细胞培养板
96 孔多孔板	Corning	353077	细胞培养板
声波液体处理技术	Labcyte	−	https://www.labcyte.com
氯喹	Sigma-Aldrich	C6628	自噬流抑制剂
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D2650	溶剂
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)	Lonza, Basel, Switzerland	BE-604F	T/C28a2 细胞生长培养基
伊格尔最低必需培养基 (EMEM)	ATCC	30–2003	HEK 293-T17 细胞生长培养基
FACScalibur 流式细胞仪	Becton Dickinson, CA	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
胎牛血清 (FBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	F9665	HEK 293-T17 细胞用血清
新生牛血清 (FCS)	Gibco by Life Technologies, CA	26010–074	血清
FuGene	Promega	E2691	一种非脂质体脂质混合物，用于质粒递送以构建自噬报告细胞系
手持式电子 384 通道移液器	Integra	−	https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Sigma-Aldrich	H6648	缓冲液
HEK 293-T17	ATCC	CRL-11268	肾细胞系。用于辅助逆转录病毒包装
高内涵筛选系统	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	62249	DNA 染色剂
图像分析软件	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
液体处理工作站	Perkin Elmer	−	https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
微孔板洗板机器人	Biotek	−	https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)	Thermo Fisher Scientific	11058	转染培养基
多聚甲醛 (PFA)	Sigma-Aldrich	158127	固定剂
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B	Addgene, Cambridge, MA	22418	质粒
pCL-Eco	Addgene, Cambridge, MA	12371	质粒
青霉素-链霉素 (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	抗生素
磷酸盐缓冲液 (PBS)	MP Biomedicals	2810305	缓冲液
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P8833	抗生素
雷帕霉素	Calbiochem, Germany	5053210	自噬流激活剂
CellQuestPro 软件	Becton Dickinson	−	https://www.bdbiosciences.com/en-eu
0.45 μm 注射器滤器	Corning	CLS431220	无菌滤器
T/C28a2	−	−	人软骨细胞系
胰蛋白酶	Gibco by Life Technologies, CA	15400054	用于 T/C28a2 细胞的胰蛋白酶
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SM-2002-C	用于 HEK 293-T17 细胞的胰蛋白酶
VSV.G	Addgene, Cambridge, MA	14888	质粒