方法文章

基于通量的骨关节炎自噬调节剂筛选检测方法

DOI：

10.3791/61078

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2020年7月8日

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1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

本文内容

摘要

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本文详细介绍了通过基于细胞成像的筛选来监测自噬流，以鉴定新的分子。

摘要

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自噬是调节稳态的核心机制。自噬的异常与衰老相关疾病的发生发展密切相关。用于鉴定自噬调控因子的表型筛选方法可用于发现新的治疗手段。本文介绍了一种基于细胞成像的筛选流程，用于在人软骨细胞中以LC3作为自噬流报告分子（mCherry-EGFP-LC3B）来监测自噬流。数据采集采用自动化高内涵成像筛选系统显微镜完成。本研究开发并验证了一种基于算法的自动化图像分析方案，用于识别可激活自噬流的分子。文中报告了关键实验步骤、说明性注释以及相较于现有自噬监测方案的改进之处。针对衰老特征的生理相关性表型筛选策略，有助于为衰老相关肌肉骨骼疾病开发更有效的药物发现路径。

引言

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许多慢性疾病与衰老的特征相关，包括缺陷 自噬1骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病，对老年人群的日常活动能力有重大影响，但目前尚无有效的预防措施或可改变疾病进程的治疗方法。2.

关节老化和骨关节炎（OA）与软骨退变进展的标志性特征相关，包括自噬功能障碍和细胞衰老3,4。针对肌肉骨骼组织中的自噬过程，有助于发现风湿性疾病的新疗法5,6。在临床前疾病模型中，药理学调控自噬是一种具有前景且相关的干预机制7。在骨关节炎中，激活自噬已被用于预防关节功能障碍8。基于可靠且可重复的实验方案、能够实现定量分析的自噬监测方法，可用于发现新型药物，并推动针对衰老相关疾病特征的药理学干预。

自噬流反映自噬降解活性，是识别激活自噬新分子的相关检测指标9。本研究描述了一种通过使用人软骨细胞（TC28a2）中的自噬报告细胞系测量自噬降解活性来确定自噬流的方法。通过瞬时表达m....

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方案

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1. 永生化人软骨细胞自噬报告细胞系的构建

注意：通过建立流式细胞术定量读数，以稳定转染 pBABE-mCherry-GFP-LC3 构建自噬报告细胞系的方法此前已有描述11。逆转录病毒转染实验中使用了两种细胞系：在共转染过程中使用 HEK 293-T17，在感染步骤中使用 T/C28a2。

  1. 共转染过程
    1. 准备HEK 293-T17细胞的培养基：500 mL Eagle最小必需培养基（EMEM）、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。将培养基储存在4 °C，每次使用前预热至37 °C。
    2. 接种 1 × 106 每孔接种 HEK 293-T17 细胞至 100 mm 细胞培养皿中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2，并确保在开始共转染过程前细胞融合度达到约75%。
    3. 移除培养基，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）冲洗，然后加入8 mL含2% FBS和1% P/S的EMEM。
    4. 在锥形管中，分别加入 10 μg、3 μg 和 7 μg 的 pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B、VSV.G 和 pCL-Eco 质粒。然后加入 200 μL 1x 低血清培养基（材料表）。加入转染试剂（材料表<....

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结果

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可通过药物调节或细胞应激反应来监测细胞中的自噬流。本研究采用永生化人软骨细胞（T/C28a2）构建以LC3为荧光报告分子（mCherry-EGFP-LC3B）的自噬报告细胞系。图1展示了筛选实验的示意图，包括在人软骨细胞中构建自噬报告细胞系（mCherry-EGFP-LC3-T/C28a2）、通过药物调节诱导或抑制自噬流，以及随后使用高内涵成像显微镜进行数据分析。图2展示了基于细胞成像的检测方法示意图，通过监测自噬流来鉴定自噬调节剂。该系统的基础在于EGFP荧光对自噬溶酶体酸性环境的敏感性高于mCherry。图3展示了从基于细胞的图像中定量分析自噬流的步骤序列。图4展示了分别以氯喹和雷帕霉素处理后，低和高自噬流的代表性图像，其自噬水平由mCherry/GFP比值表示。

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讨论

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自噬功能障碍是衰老相关关节退变的重要特征，但目前尚无针对软骨退变、以自噬为靶点的预防性或疾病修饰性治疗手段2。鉴于其重要性及临床意义，自噬已成为药物发现与开发的关注靶点，然而直接监测这一关键稳态机制变化的方法仍面临挑战。

本文介绍了一种基于细胞的表型检测方法，用于测定活体人软骨细胞中的自噬流。该方法采用含自噬激活双报告系统 mCherry-EGFP-LC3 的质粒，利用 GFP 与 mCherry 在活细胞中对 pH 敏感性的差异，通过流式细胞术同时监测自噬溶酶体的形成与降解过程11。稳定高表达 mCherry-EGFP-LC3B 的人软骨细胞可用于精确监测自噬小体流的动力学变化。利用软骨细胞进行基于细胞成像的检测可识别自噬调节剂，因为自噬溶酶体形成所引起的动态 pH 变化可被实时观察。当自噬被激活时，吞噬泡和自噬小体形成并捕获待降解的底物。LC3 的脂化修饰、整合至自噬小体膜以及与底物受体的相互作用，形成 pH ≥ 6.0 的碱性环境，对应绿色荧光发射。若自噬流持续进行，自噬小体将与溶.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本研究由西班牙卡洛斯三世健康研究所—科学、创新与大学部，2013-2016年国家计划以及欧洲区域发展基金（FEDER）资助。 一种构建欧洲的方式，PI14/01324 和 PI17/02059, 感谢经济与竞争力部通过Innopharma药物基因组学平台在靶点验证及临床前阶段候选药物发现中的应用提供的支持。我们还感谢风湿病学研究基金会（FOREUM）给予的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mm 细胞培养板Corning430167细胞培养板
12 孔多孔板Corning353043细胞培养板
15 mL 离心锥形管Falcon-Corning352095离心锥形管
24 孔多孔板Corning351147细胞培养板
25 cm² 细胞培养瓶Falcon-Corning353014细胞培养瓶
384 孔多孔板细胞载体Perkin Elmer6007550细胞培养板
6 孔多孔板Corning351146细胞培养板
96 孔多孔板Corning353077细胞培养板
声波液体处理技术Labcyte−https://www.labcyte.com
氯喹Sigma-AldrichC6628自噬流抑制剂
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOD2650溶剂
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)Lonza, Basel, SwitzerlandBE-604FT/C28a2 细胞生长培养基
伊格尔最低必需培养基 (EMEM)ATCC30–2003HEK 293-T17 细胞生长培养基
FACScalibur 流式细胞仪Becton Dickinson, CA−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
胎牛血清 (FBS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MOF9665HEK 293-T17 细胞用血清
新生牛血清 (FCS)Gibco by Life Technologies, CA26010–074血清
FuGenePromegaE2691一种非脂质体脂质混合物，用于质粒递送以构建自噬报告细胞系
手持式电子 384 通道移液器Integra−https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)Sigma-AldrichH6648缓冲液
HEK 293-T17ATCCCRL-11268肾细胞系。用于辅助逆转录病毒包装
高内涵筛选系统Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249DNA 染色剂
图像分析软件Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
液体处理工作站Perkin Elmer−https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
微孔板洗板机器人Biotek−https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)Thermo Fisher Scientific11058转染培养基
多聚甲醛 (PFA)Sigma-Aldrich158127固定剂
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene, Cambridge, MA22418质粒
pCL-EcoAddgene, Cambridge, MA12371质粒
青霉素-链霉素 (P/S)Sigma-AldrichP0781抗生素
磷酸盐缓冲液 (PBS)MP Biomedicals2810305缓冲液
嘌呤霉素Sigma-Aldrich, St. Louis, MOP8833抗生素
雷帕霉素Calbiochem, Germany5053210自噬流激活剂
CellQuestPro 软件Becton Dickinson−https://www.bdbiosciences.com/en-eu
0.45 μm 注射器滤器CorningCLS431220无菌滤器
T/C28a2−−人软骨细胞系
胰蛋白酶Gibco by Life Technologies, CA15400054用于 T/C28a2 细胞的胰蛋白酶
胰蛋白酶Sigma-Aldrich, St. Louis, MOSM-2002-C用于 HEK 293-T17 细胞的胰蛋白酶
VSV.GAddgene, Cambridge, MA14888质粒

参考文献

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  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (201....

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LC3 mCherry EGFP LC3B
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