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急性人海马脑片制备用于电生理记录

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DOI：

10.3791/61085

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2020年5月7日

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1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

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摘要

本方案描述了切除的人类海马组织的转运与制备过程，最终目的是利用活体脑片作为潜在抗癫痫药物的临床前评估工具。

摘要

癫痫影响全球约1%的人口，由于持续发作以及猝死风险较高，导致患者生活质量严重下降。尽管现有多种治疗手段，仍有约30%的患者对药物耐受。研究人员已利用动物模型开发出多种新型疗法，但耐药患者的比率仍未改变。其中一个可能的原因在于啮齿类动物模型与人类之间缺乏有效的转化，例如动物模型中未能充分反映人类的药物耐受性。切除的人脑组织作为一种临床前评估工具，有助于弥合这一转化鸿沟。本文描述了一种高质量制备人海马脑片并稳定诱导癫痫样活动的方法。该方案中，在应用8 mM KCl和4-氨基吡啶（4-aminopyridine）时可诱导出簇状放电活动。该活动对已知的抗癫痫药物拉科酰胺（lacosamide）或新型抗癫痫候选药物（如二甲基乙醇胺，dimethylethanolamine, DMEA）具有敏感性。此外，该方法还描述了通过降低细胞外Mg2+浓度并应用GABAA受体阻断剂荷包牡丹碱（bicuculline），在人海马脑片CA1区诱导类似癫痫发作事件的方法。该实验体系可用于筛选潜在抗癫痫物质对癫痫样活动的影响。此外，还可利用该方法在人脑组织中验证特定化合物所假定的作用机制（例如，通过膜片钳记录技术）。总之，对离体存活人脑组织（此处为颞叶癫痫患者切除的海马组织）的研究将增进当前对人脑生理与病理机制的理解。

引言

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，影响全球约1%的人口，并与较高的发病率和死亡率相关1,2。遗憾的是，尽管已有超过20种获批的抗癫痫药物（AEDs）等多种治疗选择，仍有三分之一的癫痫患者对药物治疗无效3。从临床前动物研究到临床试验的结果转化失败，是许多有前景的治疗策略在大量患者中无效的原因之一4。最近研究表明，在动物模型中神经肽Y（NPY）和甘丙肽（galanin）均具有抗癫痫作用；然而，在切除的人脑组织中进行测试时，只有NPY显示出疗效5。

目前关于神经系统基本机制和疾病治疗方法的大多数知识均来源于动物模型和细胞培养实验。尽管这些模型提供了重要信息，但它们仅能反映复杂人类疾病和成人人类大脑网络的某些单一层面。相比之下，人类脑组织有望弥合这一转化研究的鸿沟，却极少可用于功能研究。例如，死后脑组织一直是研究蛋白质表达、脑形态学或解剖连接的宝贵工具，但此类组织中的神经元活性通常已受损6,7,8,9,10,11。

相比之下，离体的人脑组织已被用于临床前药物评价、基本神经元功能和基因表达模式的研究12,13,14,15,16,17。与啮齿类动物脑片相比，人脑切片的一大优势在于切除和制备后神经组织具有较长的存活时间。啮齿类动物脑片通常在制备后最多可记录8小时，而人脑切片则可维持稳定的神经元活动长达72小时，从而能够对这些稀有且宝贵的样本进行深入研究12,18。

多项研究已探讨了切除的人类皮层和海马组织不同区域中癫痫样活动的特性，并采用了多种 方法来诱导癫痫样活动。在啮齿类动物脑片中，可通过多种方法诱导癫痫样活动：对齿状回门区细胞进行电刺激、提高细胞外K+浓度（8–12 mM KCl）、使用荷包牡丹碱（BIC）阻断GABAA受体、使用4-氨基吡啶（4-AP）阻断钾通道，以及在细胞外溶液中去除或降低Mg2+浓度19。然而，在人类脑组织中诱导癫痫样活动则至少需要联合上述两种方法20,21,22。

本文介绍一种制备人海马脑片的方法，所获脑片活性可维持长达20小时，并在施加高钾（8 mM K+）联合4-AP，或低镁（low Mg2+）联合BIC后，可诱导产生癫痫样活动。

方案

患者必须在手术前签署知情同意书，且实验前必须获得必要的伦理批准。关于代表性结果，所有涉及人类受试者的研究均经柏林夏里特大学医学中心（Charité-Universitätsmedizin, Berlin）审查并批准（批准号：EA2/111/14）。

1. 10倍浓缩液的制备

注意：由于获取人脑组织在规划上存在困难，建议按此处所述制备10倍浓度溶液。或者，也可通过将各组分以终浓度加入双蒸水（ddH2O）中，现配终浓度为1倍的溶液。

  1. 对于单个10倍浓度溶液，根据表1将各成分加入ddH2O中，并搅拌至完全溶解。
  2. 10倍浓度溶液在配制后1个月内使用（10倍胆碱aCSF冷冻保存可使用长达1年）。
  3. 对于10倍胆碱aCSF，将10倍1.1胆碱aCSF（表1）分装为50 mL等份，于-20 °C或-80 °C冷冻保存，以备后续使用。
    注意：不要向10倍1.1胆碱aCSF中添加葡萄糖和CaCl2，以防止细菌污染和碳酸钙沉淀。
  4. 10倍溶液2可用于所有1倍终浓度溶液，而10倍溶液1.1–1.4则为定制配方，命名亦相应不同（表1）。

2. 1倍终溶液的配制

注意：最终的 1x 溶液应现配现用，或最迟于使用前一天配制。 所有最终溶液均需使用玻璃气体分散器以 5% CO2 和 95% O2 进行碳氧饱和处理，以富集氧气，并将 pH 调整至 7.4（范围为 7.4 ± 0.2）。

  1. 用于转运和制备的胆碱aCSF
    1. 配制终体积为500 mL的溶液时，将一份50 mL的10倍浓缩液1.1（胆碱aCSF）在37 °C水浴中解冻。
    2. 将解冻后的50 mL 10倍浓缩液1.1和50 mL 10倍浓缩液2加入约300 mL的ddH2O中。
    3. 加入终浓度的葡萄糖和CaCl2, 搅拌至完全溶解（表1，溶液1.1）。
    4. 用ddH2O定容至终体积500 mL，并测定渗透压（300 mOsm ± 10 mOsm）。
    5. 可选：可根据需要使用滤器对溶液进行灭菌（参见关于无菌条件下延长脑片存活时间的讨论）。
    6. 另取一个瓶子装入约100 mL的1倍胆碱aCSF，用于从手术室转运至实验室。
    7. 可选：根据从手术室到实验室的转运时间长短，可考虑使用气密瓶盖，以确保在较长运输过程中aCSF的pH稳定。
    8. 将最终配制的溶液储存于4–8°C，待后续使用。
    9. 手术当天，将1倍胆碱aCSF置于冰上冷却，并通过连接碳合气（5% CO2, 95% O2）的玻璃气体分散器至少碳合10–15分钟。
      注意：若等待时间较长，建议在手术室附近配备气瓶，以便对转运用溶液重新碳合。然而，我们在未重新碳合的情况下运输海马组织（短时15分钟与长时60分钟），并未观察到癫痫样活动诱导效果的差异。
  2. 用于储存和记录的aCSF
    1. 配制终体积为2 L的溶液时，将200 mL 10倍浓缩液1.2（aCSF）、200 mL 10倍浓缩液2以及葡萄糖（表1）加入约1500 mL的ddH2O中。
      注意：最终溶液的体积取决于具体实验设计及用于储存和记录的灌流 chamber 类型。
    2. 用ddH2O定容至终体积2 L，并测定渗透压（300 mOsm ±10 mOsm）。
    3. 使用前将溶液预热至35 °C，并至少碳合10–15分钟。
  3. 用于诱导簇发放电的高K++4-AP aCSF
    1. 配制终体积为1 L的溶液时，将100 mL 10倍浓缩液1.3（高K++4-AP aCSF）和100 mL 10倍浓缩液2加入约700 mL的ddH2O中。
    2. 根据表1加入葡萄糖和4-AP（终浓度 = 100 µM）。
    3. 用ddH2O定容至终体积1 L，并测定渗透压（300 mOsm ±10 mOsm）。
    4. 使用前将溶液预热至35 °C，并至少碳合10–15分钟。
  4. 用于诱导类癫痫发作事件（SLEs）的低Mg2++BIC aCSF
    1. 配制终体积为1 L的溶液时，将100 mL 10倍浓缩液1.4（低Mg2++BIC aCSF）和100 mL 10倍浓缩液2加入约700 mL的ddH2O中。
    2. 根据表1加入葡萄糖和BIC（终浓度 = 10 µM）。
    3. 用ddH2O定容至终体积1 L，并测定渗透压（300 mOsm ± 10 mOsm）。
    4. 使用前将溶液预热至35 °C，并至少碳合10–15分钟。

3. 界面室的制备

  1. 在接口室中，将脑片置于三层滤纸上，以确保脑片下方有足够量的溶液。为此，每个脑片放置区域需准备两片大小约为 4 cm × 2 cm 的滤纸（所述 界面室 由两个腔室组成）并将它们上下叠放。
  2. 在隔室内将细棉线围绕4 cm x 2 cm的滤纸放置，以打破溶液的表面张力，确保液体均匀流动（此处使用剪裁的黑色尼龙袜） 长度约10 cm的细切丝线；放置方法见 图1).
  3. 在切片保存隔室内的大块滤纸上方放置小片滤纸。小片滤纸的大小应与单个脑切片相近（约1.5 cm × 约1.0 cm），以便于对单个切片进行后续操作。每个隔室内放置三至四片小滤纸。
  4. 使用蠕动泵确保 aCSF 的流速为 1.8 mL/min。
  5. 将界面式切片槽用碳合气饱和并预热至约 35 °C（切片的最终温度应约为 32 °C）。

4. 准备区域的设置

注意：可在无菌条件下进行制备，以避免污染并延长脑片存活时间。然而，并非所有振动切片机均可置于无菌罩内，因此在制备过程中需采取其他措施以减少污染。本节将介绍其中一些措施。

  1. 用70%乙醇擦拭制备区域，并在该区域上方铺上铝箔或无菌覆盖物。
  2. 准备好万能胶、两把尖头镊子、刮刀、带刀片的手术刀以及用于粗切脑组织的刀片。可在操作前对工具进行灭菌，以减少污染。
  3. 用70%乙醇擦拭振动切片机的缓冲槽和样本托盘。待缓冲槽完全干燥后，用铝箔覆盖，并将托盘放入冰浴中。在冰浴中加入碎冰，并保持在-20 °C直至开始制备。
  4. 用70%乙醇擦拭振动切片机和刀片，并校准振动切片机，以尽量减少切片过程中产生的垂直振动和组织损伤。

5. 组织切片与保存

  1. 切除后立即把组织放入冰冷的、通入碳合气的胆碱人工脑脊液（choline aCSF）中，并迅速转运至实验室。
    注意：制备过程中应始终佩戴手套和口罩，因为人脑组织可能含有潜在病原体。此外，在未使用无菌操作台时佩戴口罩，可显著减少溶液和脑组织的污染。
  2. 将组织从胆碱aCSF中取出，并切除任何烧灼过的部分。
  3. 修整组织块表面，使其平整以便粘附于样品台，同时考虑切片角度和组织层次。理想的海马切片应包含齿状回（DG）、CA1–CA4区，以及（如可能）下托（subiculum）。
  4. 将脑组织切成400 µm厚的切片，并在切割过程中调整振幅和速度。由于 可能残留软脑膜，人脑组织阻力较大，可能需要更慢的切割速度。
    注意：切片厚度显著影响可用的神经网络（较厚切片包含更多神经元）或切片的存活能力（溶液向切片内部的渗透）。我们曾使用500 µm 厚的切片以增加潜在可用的微网络结构，且未观察到癫痫样活动诱导方面的差异。300 µm切片常用于膜片钳实验，但本实验尚未测试此类切片中癫痫样活动的诱导情况。我们采用400 µm作为标准切片厚度，但300–500 µm范围内的切片也可能适用。
  5. 收集前，使用手术刀将脑切片裁剪至适合放入记录室的尺寸。若使用膜片室（见第6节），切片最大尺寸应不超过1.5 cm × 1 cm。裁剪时应考虑记录所需保持完整的特定层次和连接结构（例如，若需在CA1区和DG区进行记录，则可切除下托及周围白质组织）。
  6. 使用刮铲和小型镊子，小心地将切片放置于界面式记录室内的小型滤纸上，并在aCSF中静置约1小时，随后开始记录。
  7. 切片可记录长达20小时（在无菌条件下甚至可更久）。

6. 癫痫样活动的记录

  1. 在膜式记录室（浸没式记录室）中，将脑片置于透明的半透膜上，该半透膜已粘附于塑料环上24为此，使用超级胶水将塑料环粘附到细胞培养插入物的膜上。
  2. 使用手术刀去除塑料环外侧的任何膜。在将膜放入腔室之前，确保膜平整且完全附着在环上。
    注意：膜可在 ddH₂O 中保存2在4–8 °C条件下可保存并重复使用长达1个月。始终保持膜处于湿润状态。
  3. 膜室的进液口和出液口均连接供液管路。将管路置于蠕动泵中，使进液和出液方向相反。
  4. 将进液管和出液管置于充有碳酰气的预热aCSF中，直至所有管道及灌流室完全充满溶液。调节蠕动泵的流速，使灌流速度稳定在10–13 mL/min。
    注意：此处使用的膜片钳记录室为高流速浸入式记录室，可实现最高达 14 mL/min 的溶液灌流速度24若使用其他类型的浸没式记录室，则需要调整流速。然而，为诱导癫痫样活动，强烈建议使用膜式记录室。
  5. 在膜室附近将加热元件连接至流入管路，以确保温度稳定在 32 °C。
  6. 使用垂直拉制仪制备 1–2 MΩ 玻璃微电极。用 154 mM NaCl 溶液填充微电极，并将其置于电极夹持器中。
  7. 使用镊子和刮勺，用小片滤纸将海马脑片从界面式孵育 chamber 中取出，并将滤纸和脑片一同放入盛有通入碳合气 aCSF 的培养皿中。小心将滤纸从海马脑片上移除，必要时可用移液器施加轻微力量，使脑片与滤纸分离。注意切勿翻转脑片。
  8. 将脑片放入记录舱中，并使用脑片固定网将其固定。
    注意：由于伯努利原理，在所使用的浸没式膜片室中，通常无需额外使用切片网即可保持切片稳定。
  9. 将电极放置于目标区域和层次（此处为CA1），并开始记录。
  10. 以10–20 kHz的采样率在电流钳模式下记录场电位活动，并以2 kHz进行低通滤波。
  11. 在 aCSF 中记录基础活动，持续最多 5 分钟。
  12. 将灌流管路从 aCSF 切换至高钾溶液（highK）++4AP 或低Mg2++BIC aCSF 和流出管连接至废液容器，以防止溶液混合。2 分钟后，将流出管置于与流入管相同的溶液中，以节约溶液。
  13. 高钾诱导的簇状放电活动++4-AP 应在灌流后 2–5 分钟内可见。然而，低Mg诱导SLEs2++BIC 最多可能需要 30 分钟。如有必要，可小心调整电极位置以获得最佳结果。
  14. 到达最终位置后，至少记录20分钟的基础活动。如果记录的是SLEs，由于SLEs发生频率较低，建议延长基础记录时间。
  15.  如果基础活动稳定（事件频率达到平台期），则灌注所需药物。注意，由于流速较高，药物灌注仅需 2–5 分钟，可实现快速溶液交换。
  16. 记录活动期间  给药至少20分钟，随后洗脱。活动应稳定持续至少60–90分钟，以允许更长时间的记录。

7. 分析

  1. 频率和振幅的分析可使用任何可用的软件进行。迄今为止，我们尚未能建立对SLE或簇状放电活动的可靠自动分析方法，因此采用半自动分析并结合对识别出的活动进行视觉确认。
  2. 簇状放电活动的特征为双相、正负向偏转，持续时间≥100 ms。所有在视觉上被识别为簇状放电的事件（例如通过阈值分析半自动识别）均应手动标注，以便进一步分析事件频率（事件间间隔，IEI）、振幅以及在分析时间段内的事件总数。
    注意：由于簇状放电活动频率较高，通常分析每个给药阶段的最后5分钟20。
  3. SLE可按照Heuzeroth等人的描述进行分析。已识别的SLE可进一步分析其持续时间、振幅、峰电位频率，以及强直期（高频放电）与阵挛期（低频放电）的持续时间。持续时间<10 s的SLE应从分析中排除。
    注意：在抗癫痫药物的临床前评价中，由于高K++4AP可在切除的海马组织中稳定诱导簇状放电，因此主要研究其对簇状放电活动的影响。已有研究报道使用低Mg2++BIC诱导SLE的初步结果（图2），但本文未包含对该数据的分析。

结果

已成功记录到来自多达15名患者的切除人海马组织中的癫痫样活动。建立稳定的运输和制备流程对于在人脑组织中成功诱导癫痫样活动至关重要。近期发表的研究结果表明：1）在不同患者的切除组织中可稳定诱导癫痫样活动，以及2）切除的人脑组织可作为临床前工具，用于评估新型抗癫痫机制14,20。

应用高K++4-AP可在数分钟内诱导出表现为簇状放电的癫痫样活动（图2A、B、C、D）。由于人海马组织中神经元分布稀疏，或因颞叶癫痫（TLE）导致神经元大量丢失，可在记录开始时调整电极位置。若在10分钟后仍未在CA1区观察到脑片的簇状放电活动（与电极位置无关），则提示脑片活性可能已受损，需更换脑片。

持续时间较短的SLEs，其持续时间 >10 秒，可通过应用低 Mg²⁺ 诱导2++BIC（图2E,F). 图 2E 数分钟后即出现稳定的SLE诱导，且在记录过程中频率保持稳定。在此，4个来自该患者的脑片中有2个成功诱导出SLE活动。其中一个脑片在SLE活动15分钟后仅表现为簇状放电，而另一个脑片即使在40分钟后仍未出现SLE。

为了对物质效应进行临床前评价，研究了其对高K++4-AP诱导的簇状放电活动的潜在抗癫痫作用。测试了已知及潜在的抗癫痫物质（拉科酰胺、DMEA、强啡肽14），此处以传统抗癫痫药物拉科酰胺（一种钠通道阻滞剂）和新型潜在抗癫痫物质DMEA为例进行展示20。在施用拉科酰胺和DMEA期间，簇状放电事件的数量以及事件间间隔（IEI）均减少（图3C），但放电幅度大多未受影响（图3D）。在部分脑片中，尽管在最初几分钟内成功诱导出簇状放电事件，但在洗脱所施加的抗癫痫药物后，放电频率并未恢复（此处未显示数据，参见Kraus等20）。在此情况下，认为所用药物产生了效应；然而，簇状放电活动的减少可能受到长时间记录过程中活动逐渐衰减的影响。因此，结果需谨慎解读。

凝胶电泳装置及DNA分离过程与条带分析示意图
图1：界面式孵育室。 用于储存人海马脑片的界面式孵育室包含两个脑片存放区（A）；具体为Haas型界面式孵育室23。在此装置中，海马脑片置于（d）三层滤纸之上，（e）较小的滤纸碎片便于单个脑片的操作，（f）较大的滤纸碎片则确保脑片下方有充足的溶液层。（c）围绕脑片并位于滤纸上方的棉线，可确保来自（a）室顶部入口的溶液均匀流动。（b）盖板将来自孵育室下方的氧气引导至脑片表面。（B） 单个脑片存放区的俯视图。（C） 侧视图，用于展示滤纸的分层结构。（g） 孵育室底部。（h） 溶液流入管，连接至蠕动泵（蓝色箭头指示溶液流动方向）。请点击此处查看该图的放大版本。

电生理学图谱；不同 K⁺、4-AP、Mg²⁺、BIC 条件下的离子通道活性。
图2：由高钾诱导的人类海马脑片中的癫痫样活动++4-AP 和低 Mg2++BIC CA1 区域示例记录及高钾溶液应用片段+ (8 mM)+4-AP (100 µM) （A，B，C，D） 和低Mg2++BIC（10 µM) （E，F）. （A） 高钾溶液灌流应用++4-AP 在数分钟内诱导产生癫痫样活动，且该活动至少可稳定维持 60 min。（A）的细节可见于（B）。在人海马脑片的 CA1 区可诱导出两种不同类型的活动：类间歇性放电尖波 （C， [B] 的详细信息) 和爆发活动 （D， [B] 的详细信息)爆发性活动被证明对抗癫痫药物敏感，因此可用于分析潜在抗癫痫物质的作用效果图3). （E，F） 低镁应用2++BIC 在持续作用一段时间后可诱导 SLEs >10 s (F)内CA1区几分钟内即可诱导出SLEs，但在其他脑片中诱导SLEs可能需要长达30分钟。标尺 = 0.2 mV、2 min（A，E）、5 s（B）、500 ms（C，D）、5 min（E）和2 s（F）。本图改编自Kraus等人的研究。20. 请点击此处以查看此图的放大版本。

使用拉科酰胺和10mM DMEA进行电生理学分析，展示神经信号变化；图表。
图3：人脑片在应用拉科酰胺或DMEA期间癫痫样簇状放电活动的减少。在应用（A）拉科酰胺和（B）DMEA（一种潜在的新型抗癫痫分子）期间，簇状放电活动减少。（A）和（B）展示了CA1区的代表性记录，其中包含用于（C）和（D）分析的片段区域。在应用拉科酰胺（100 µM）和DMEA（10 mM）期间，簇状放电活动减少，如中间片段所示，并在洗脱期间再次增加。（C, D） 对每个应用阶段（基线、拉科酰胺/DMEA、洗脱）最后5分钟内的簇状放电次数和振幅进行了分析，并以所有患者结果的均值±标准差形式汇总展示（事件数量，C；振幅，D）。每个点代表一名患者。星号标记了显著性差异：拉科酰胺应用的分析采用Friedman检验及Dunnett多重比较事后检验（*p < 0.05，n = 4）；DMEA应用的分析采用重复测量方差分析及Tukey事后检验（**p < 0.01，n = 10）。标尺 = 0.2 mV，2 min（完整记录，A），5 s（片段，A），3 min（完整记录，B），1 s（片段，B）。本图改编自Kraus等20。请点击此处查看本图的放大版本。

溶液 1.1 胆碱 aCSF
物质10x 浓度 (mM)1x 浓度 (mM)备注
choline Cl1100110
(+)-Na L-抗坏血酸11611.6
MgCl2x6H2O707
丙酮酸钠313.1
KCl252.5
NaH2PO412.51.25
NaHCO326026
CaCl2-0.5加入终溶液中
葡萄糖-10加入终溶液中
溶液 1.2 aCSF
物质10x 浓度 (mM)1x 浓度 (mM)备注
NaCl1290129
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
KCl303
MgSO4181.8
葡萄糖-10加入终溶液中
溶液 1.3 高K++4-AP aCSF
物质10x 浓度 (mM)1x 浓度 (mM)备注
NaCl1240124
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
KCl808
MgSO4181.8
葡萄糖-10加入终溶液中
4-AP-0.1加入终溶液中
溶液 1.4 低Mg2++BIC aCSF
物质10x 浓度 (mM)1x 浓度 (mM)备注
NaCl1300130
NaH2PO412.51.25
CaCl2161.6
KCl303
葡萄糖-10加入终溶液中
BIC-0.01加入终溶液中
溶液 2
物质10x 浓度 (mM)1x 浓度 (mM)备注
NaHCO321021

表1：运输、制备和记录用10x及终浓度1x溶液的配制。

讨论

活体切除的人脑组织是抗癫痫药物（AED）临床前评价中极为宝贵的工具，因其能够真实反映完整的人脑微观神经网络。本方案介绍了一种组织运输与制备方法，可确保获得高质量的海马脑片，以及稳定诱导出对AED评价至关重要的癫痫样活动的方法。

其他研究团队此前已报道过癫痫样活动的研究，以及在人脑组织切片中通过化学或电刺激诱导该活动的方法17,20,21,22。本实验方案描述了通过应用高浓度K++4-AP在来自不同患者的脑片中诱导稳定的簇状放电活动，以及通过应用低Mg2++BIC在CA1区诱导短暂性癫痫样放电（SLEs）。研究发现，簇状放电的诱导成功率较高且更稳定（在15例患者中共80%的测试脑片可成功诱导），而SLEs的诱导成功率相对较低（在1例患者中仅50%的测试脑片可成功诱导）。然而，截至目前，SLEs的诱导仅在1例患者中进行了测试。尽管如此，仍推荐使用低Mg2++BIC方法诱导SLEs，因为目前尚无法通过高K++4-AP诱导出SLEs。

多项研究已提出了人脑组织运输与制备的方法，并通常强调影响神经元存活的三个关键因素：运输时间、所用运输溶液以及储存条件。

为了获得最佳的脑片存活率，一些研究团队建议切除的脑组织应尽可能缩短运输时间。然而，手术室与实验室通常相距较远，导致运输时间较长，可能影响脑片质量。一些团队通过在运输过程中持续向溶液中通入 O2 来克服这一障碍12。我们与其他团队类似18,25，在运输过程中未持续额外供 O2，已成功实现了短时间（最长为 15 分钟）和长时间（长达 1 小时）的脑组织运输。在这些情况下，癫痫样放电记录中未观察到组织质量的差异。在与本机构其他团队的交流中，膜片钳实验的脑片质量也未发生变化。相反，组织质量的差异可能源于手术过程中的损伤、过长的切除时间以及切片操作本身。

关于运输和切片溶液，所有已发表的方法均在溶液中省略了NaCl，以减少由于渗透压引起的细胞肿胀，这与啮齿类动物膜片钳实验的标准操作类似。然而，迄今为止已引入了多种替代方案（例如基于蔗糖的aCSF13,22、基于NMDG的aCSF12,26以及基于胆碱的aCSF27）。Ting及其同事于2014年首次提出使用基于NMDG的aCSF进行脑片制备26，并随后添加了一种恢复程序，通过该程序逐步将NaCl重新引入脑片中28。然而，正如Ting等人所述，用基于NMDG的aCSF制备的脑组织神经元表现出更高的膜电阻，从而影响膜片钳实验中的全细胞封接效果26。因此，我们已从基于NMDG的aCSF转为使用基于胆碱的aCSF20，后者可获得高质量的脑片，适用于场电位记录和膜片钳记录。

关于脑片的保存，通常认为界面式孵育条件可提供最佳的氧气供应，这对于脑片的长期存活至关重要18。然而，也有研究报道在浸没式条件下脑片可存活长达72小时12。与先前的假设相反，人脑脑片似乎比啮齿类动物脑片更耐受低氧或氧化应激。以往主要采用界面式孵育室保存人海马脑片，但在进行膜片钳实验时，推荐使用浸没式条件来维持人脑脑片的活性。

正如其他研究团队所述，延长脑片存活时间（界面式培养 <48 小时18，浸没式培养 <72 小时12）的另一个关键步骤是防止细菌污染。啮齿类动物脑片通常用于持续不超过 8 小时的电生理记录，在此期间细菌污染被认为不会影响脑片的存活能力。由于单次切除组织可制备大量脑片，且人脑组织来源稀少，因此迫切需要延长人脑片的存活时间。本方法成功描述了活体人海马脑片的制备过程，且可轻松适配无菌条件。然而，在本研究所进行的记录中，脑片存活超过 20 小时并非优先考虑的目标。

已证明，在界面式记录室中进行记录对于诱发如 SLEs22等类癫痫样活动至关重要。由于浸没式条件下的氧合水平较低，极少用于SLEs的记录；然而，该条件对于需要高光学分辨率的膜片钳实验是必需的。使用优化设计的浸没式记录室，可实现对人脑片中癫痫样活动（细胞外场电位或单个神经元）的记录，这得益于高效的氧合和快速的药物施加29。本文描述了场电位记录的方法与结果，但需要强调的是，利用这种改进的记录室，已在小鼠和人脑片中成功实施了膜片钳记录（数据未显示）。

与啮齿类动物模型相比，切除的人脑组织具有更高的转化价值。它代表了一种成年、病变的神经元网络，这种网络无法通过诱导多能干细胞（iPSCs）重现。然而，与任何体外（in vitro）系统一样，人脑切片并不能完全代表完整的人脑。此外，由于手术或制备过程中的损伤，切除脑组织中记录到的神经元网络可能会发生显著的分子和功能改变。已有研究表明，切片操作会影响GABA能功能，并可能影响癫痫样活动的诱导30。在提出假设时，应充分考虑这些局限性。在测试潜在抗癫痫药物时，应考虑使用不同脑区，因为药物靶点可能并非在所有人脑区域或所有患者中均有表达。特别是颞叶癫痫（TLE）患者的海马常表现出海马硬化，并伴随严重的神经元细胞丢失。建议获取患者有关病理变化和疾病史的信息，例如是否可能对药物耐药，并在数据分析解释时予以考虑。

综上所述，该方法成功描述了活体人海马脑片的制备以及记录两种不同类型癫痫样活动的诱导技术。由于活体人脑组织极为稀缺，应采用优化的运输和记录条件，以确保利用人脑片进行的实验获得最大产出。建议将切除的人脑组织作为临床前验证工具，与啮齿类动物模型和细胞培养实验相结合使用。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢柏林夏里特大学医学中心（Charite-Unversitätsmedizin, Berlin）的 Mandy Marbler-Pötter 提供出色的技术支持。P.F. 的研究由德国研究基金会（DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft）根据德国卓越战略计划资助（项目编号：EXC-2049-390688087）。本工作得到了柏林健康研究所（Berlin Institute of Health） QUEST 生物医学研究转型中心的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(+)-Na L-抗坏血酸Sigma AldrichA4034
4-APSigma Aldrich275875-5G
刀片eliteSERVE GmbHHW3用于振动切片机
CaCl2Merck102382
氯化胆碱Sigma AldrichC1879
滤纸TiffenEK1546027T
气密瓶盖Carl Roth GmbH+Co.KGE694.1
玻璃丝Science ProductsGB150F-8P用于记录电极
玻璃气体分散器DWK Life Sciences GmbH258573309
葡萄糖Sigma AldrichG7528
界面式记录室自制-参见 Haas 等，1979
KClAppliChem131494.1210
膜（细胞培养小室）MerckPICM030050
膜式记录室自制-参见 Hill 和 Greenfield，2011
MgCl2?6H2OCarl RothHNO3.2
MgSO4Sigma AldrichM7506
丙酮酸钠Sigma AldrichP8574
NaClCarl Roth3957.1
NaH2PO4Merck106346
NaHCO3Carl RothHNO1.2
蠕动泵GilsonMinipuls 3
脑片固定装置Warner instrumentsSHD-41/15
垂直拉制仪NarishigePC-10
振动切片机LeicaVT1200S

参考文献

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407(2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963(2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30(2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209(2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818(2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12(2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519(2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 7/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

标签

癫痫样活动急性脑切片制备振动切片胆碱型人工脑脊液溶液界面式记录室装置低镁加荷包牡丹碱高钾加4-氨基吡啶膜片钳记录
急性人海马脑片制备用于电生理记录
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