Vi beskriver en teknik för profilering microRNAs i tidiga mus embryon. Detta protokoll övervinner utmaningen med låg cellinmatning och små RNA-anrikning. Denna analys kan användas för att analysera förändringar i miRNA uttryck över tiden i olika cell härstamningar av den tidiga musen embryot.
MicroRNAs (miRNAs) är viktiga för den komplexa regleringen av cell öde beslut och utvecklingsmässiga timing. In vivo studier av bidraget av miRNAs under tidig utveckling är tekniskt utmanande på grund av det begränsande celltalet. Dessutom kräver många tillvägagångssätt att ett miRNA av intresse definieras i analyser som nordlig blotting, microarray och qPCR. Därför har uttrycket av många miRNAs och deras isoformer inte studerats under tidig utveckling. Här visar vi ett protokoll för små RNA sekvensering av sorterade celler från tidiga mus embryon för att möjliggöra relativt opartisk profilering av miRNAs i tidiga populationer av neurala crest celler. Vi övervinner utmaningarna med låg cellinmatning och storleksval under biblioteksberedningen med hjälp av förstärkning och gelbaserad rening. Vi identifierar embryonala ålder som en variabel redovisning av variation mellan replikat och steg-matchade mus embryon måste användas för att noggrant profil miRNAs i biologiska replikat. Våra resultat tyder på att denna metod i stort sett kan tillämpas på profil uttryck av miRNAs från andra härstamningar av celler. Sammanfattningsvis kan detta protokoll användas för att studera hur miRNAs reglerar utvecklingsprogram i olika cell härstamningar av den tidiga musen embryot.
En central fråga i utvecklingsbiologin är hur en enda odifferentierad cell kan ge upphov till en hel organism med talrika komplexa celltyper. Under embryogenesen blir cellernas utvecklingspotential successivt begränsad när organismen utvecklas. Ett exempel är den neurala crest härstamning, som successivt skiljer från en multipotent cell befolkningen i olika terminal derivat, såsom perifera nervceller, glia, kraniala ben, och brosk. Neurala crest celler specificeras från ektodermen under gastrulation och sedan genomgå en epitelial till mesenchymal övergång och migrera genom embryot till diskreta platser i hela kroppen där de kommer att terminalt differentiera1. Årtionden av arbete har avslöjat en transkriptional gen reglerande nätverk, men mycket mindre är känt om mekanismerna för post-transkriptional reglering som styr tidpunkten för neurala crest utveckling.
Tidigare arbete tyder på att microRNAs (miRNAs) förtränga genuttryck för korrekt utvecklingsmässiga timing och cell beslut öde2,3,4,5,6. Studier av miRNAs i neurala crest utveckling har till stor del fokuserat på senare stadier av kraniofacial utveckling. Till exempel, miR-17 ~ 92 och miR-140 är kritiska för palatogenes under kraniofacial utveckling i mus och zebrafisk, respektive7,8. Bidraget av miRNAs till de tidigaste neurala crest öde beslut av embryot har inte undersökts grundligt. Studier av miRNAs i tidiga öde beslut har begränsats av tekniska utmaningar såsom det låga cellnummer som finns i tidiga embryon.
MiRNAs har profilerat in vitro från cellinjer med hjälp av embryoid organ i olika stadier av differentiering för att modellera tidig mus utveckling9. Undersökningen av små RNA in vivo under tidig däggdjursutveckling har varit relativt begränsad. Tidigare metoder för att profilera miRNAs har lett till partiskhet som en känd sekvens används för att analysera uttryck för en specifik miRNA i metoder som qPCR, microarrays och norra blots10. Nästa generations sekvensering och ständigt förbättrade molekylära verktyg möjliggör nu en relativt opartisk analys av miRNA-uttryck för att studera deras bidrag till tidig däggdjursutveckling och beslut om cellöde.
Här rapporterar vi en teknik för att skörda och sekvens små RNAs uttryckt i neurala crest celler från tidiga mus embryon som spänner gastrulation (E7.5) till början av organogenes (E9.5). Denna teknik är okomplicerad och kombinerar växling av härstamning, cellsortering och val av gelbaserad storlek för att förbereda små RNA-sekvenseringsbibliotek från ett minimalt antal celler för nästa generations sekvensering. Vi lyfter fram vikten för strikt somite skede matchning av embryon att lösa 6-timmars tidsintervall för att få en omfattande bild av miRNAs under de snabba förändringarna av tidig utveckling. Denna metod kan tillämpas i stor utsträckning på genetiska studier och utvecklingsstudier och undviker att samla embryon. Vi beskriver ett sätt att övervinna utmaningar av nuvarande metoder såsom miRNA anrikning med hjälp av gel-baserad rening, bibliotek kvantifiering, och minimera partiskhet som införts från PCR. Denna metod har använts för att identifiera miRNA uttryck mönster över tiden för att studera hur miRNAs kontroll utvecklingsmässiga timing i neurala krönet härstamning av mus embryon.
Utvecklingsprocesser kan gå snabbt, och celler genomgår många sekventiella specifikationer så att fånga en omfattande bild av miRNAs bidrar till tidiga öde beslut, mer specifik iscensättning behövs än den allmänt använda halvdag steg. En nyligen genomförd studie har utfört RNA sekvensering från Theiler steg 12 embryon som sträcker sig från att ha 3 till 6 somites11. Vi finner att under denna tidsperiod, de neurala crest cellerna anges (3 somites av ålder), delaminate (4 somites av ålder), och migrera (5-6 somites av ålder). Vi finner också att förutom Cre-föraren som används för att härstamning spårcell populationer, ålder är den största källan till variation mellan biologiska prover, och endast somite matchade embryon bör betraktas som replikat. Detta bör också beaktas vid jämförelse av transgena embryon med kontroller av vildtyp.
Tidigare metoder för att profilera miRNAs under tidig utveckling har använt mellan 10-100 ng av RNA-ingång för små RNA-sekvensering bibliotek beredning och har poolat flera embryon i ett prov13,14. Vi visar RNA isolering och bibliotek beredning från en enda E7.5 embryo eller från sorterade neurala crest celler vid E8.5 och E9.5 med hjälp av cirka 100 ng av totala RNA som ingång. Vid dissociating embryon för sortering, bör man noga med att titta på dissociation under ett mikroskop och släcka reaktionen att observera när enstaka celler erhålls. Vi finner att dissociation av hjärnskålen regionen E8.5-E9.5 embryon är nästan omedelbar med skonsam manuell pipettering som beskrivs i protokollet. För större vävnader och allt äldre embryon kan dissociationstiden vara längre beroende på vilken del embryots del som dissocieras. För E7.5-E9.5 embryon, klumpar av celler är väl synliga under mikroskopet och dissociationen bör fortsätta tills inga fler klumpar syns. Enstaka celler syns i lösning om du justerar fokus genom lösningen i din brunn var som helst från 5-10x. Tidigare metoder sortera celler direkt i lysbuffert för RNA-sekvensering för att prep bulk-RNA från ett lågt antal celler14. Här sorterar vi direkt in i RNA extraktionslyslösning så att RNA kan isoleras innan biblioteksberedningen påbörjas. Användning av minikolonner med 11 μL elueringsvolym tillåten för en tillräckligt hög RNA-koncentration så att en enda RNA-prep kunde delas mellan små RNA och bulk-RNA-sekvensering.
En nuvarande begränsning av de flesta små RNA-sekvenseringsmetoder är PCR-förstärkningen av konverterad cDNA. Vår metod inte övervinna denna begränsning, men vi kunde minimera antalet PCR cykler från 25-maximalt rekommenderas ner till 16 cykler. Denna minskning av förstärkning minskar artificiell förstärkning bias infördes av PCR. En annan källa till bias är ligering av adaptrar, där det är känt att specifika sekvenser som ligger i ändarna av adaptrar och miRNAs kan ligate tillsammans med större effektivitet än andra sekvenser. För att undvika detta, de adaptrar som används i detta protokoll har 4 slumpmässiga baser införlivas i slutet av varje adapter för att förhindra partiskhet i ligation reaktioner. Dessutom är ett annat vanligt problem mängden adapter-dimers som bildas när RNA-indata är låg. Biblioteket förberedelse kit innehåller åtgärder för att minska adapter dimer formation såsom adapter inaktivering och pärla rensningar för att ta bort överskottsadaptrar efter varje ligering. Vi spädde också 3′ och 5 ‘ 4N adaptrar med 1 / 4 för att minska mängden adapter dimer som kan bildas. Vi fann att när den inte späds, 130 bp bandet intensitet ökar gör det svårt att skilja från 150 bp bandet som innehåller de önskade små RNA-bibliotek på en gel.
En annan aktuell utmaning att förbereda sekvensering bibliotek är korrekt kvantifiering av produkten före sekvensering. Vi har funnit att olika metoder ger varierande resultat på samma bibliotek. Vi föreslår att forskarna använder flera metoder för kvantifiering för att få en korrekt uppskattning av koncentrationen.
Detta protokoll kan tillämpas allmänt på genetiska, utvecklingsmässiga studier, eller andra tillämpningar där RNA skördas från ett lågt antal celler. Detta tillvägagångssätt förenklar tidsstudier genom att undvika sammanslagning av embryon och kan enkelt tillämpas på både icke-sorterade och sorterade celler.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt stöddes av Andrew McDonough B + Foundation och NIH (R01-HD099252, R01-HD098131. R.J.P. är CPRIT Scholar i cancerforskning (RR150106) och V Scholar in Cancer Research (V Foundation). Författarna vill också erkänna Cytometry och cellsortering Core på BCM för att tillhandahålla utrustning som behövs för detta projekt.
#5 Forceps Fine Science Tools | Fisher Scientific | NC9277114 | |
0.4% Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | |
10 cm Petri dishes | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
2-Propanol | Miilapore Sigma | I9516-500ML | |
5 % Criterion TBE Polyacrylamide Gel, 12+2 well, 45 µL | Bio-Rad | 3450047 | |
5200 Fragment Analyzer | Agilent | M5310AA | |
96 well PCR plates high profile semi skirted clear/clear | Bio-Rad | HSS9601 | |
BD FACSAria II | bdbiosciences | ||
Bovine Serum Albumin, fraction V | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gendepot | CA008-300 | |
Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Ethanol Pure, 200 proof anhydrous | Sigma Aldrich | E7023-500ml | |
FC-404-2001 | Illumina | FC-404-2001 | |
HS NGS Fragment kit | Agilent | DNF-474-0500 | |
HS RNA Kit | Agilent | DNF-472-0500 | |
miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 barcodes) | Fisher Scientific | NC1289113 | |
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles) | Illumina | FC-404-2001 | |
NGS Fragment kit | Agilent | DNF-473-1000 | |
Papain | Worthington | LK003176 | resuspend in 5 mL of Ca/Mg free PBS for a final concentration of 27 U/mL |
SYBR Gold nucleic acid gel stain | ThermoFisher | S11494 | |
Trizol LS | ThermoFisher | 10296028 | |
UVP Benchtop UV Transilluminators: Single UV | Fisher Scientific | UVP95044701 | |
Vannas Scissors Straight Fine Science Tools #91500-09 | Fisher Scientific | NC9609583 |