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Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

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DOI:

10.3791/61086

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9 de octubre de 2020

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1Development, Disease Models & Therapeutics Graduate Program, Department of Molecular and Cellular Biology, Department of Neuroscience, Center for Cell and Gene Therapy, Stem Cells and Regenerative Medicine Center, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Resumen

Los microARN (MIRNAs) son importantes para la compleja regulación de las decisiones sobre el destino celular y el momento del desarrollo. Los estudios in vivo de la contribución de los miRNAs durante el desarrollo temprano son técnicamente difíciles debido al número de células limitantes. Además, muchos enfoques requieren que se defina un miRNA de interés en ensayos como la hinchazón del norte, el microarray y el qPCR. Por lo tanto, la expresión de muchos miRNAs y sus isoformas no se han estudiado durante el desarrollo temprano. Aquí, demostramos un protocolo para la secuenciación de ARN pequeño de células ordenadas de embriones de ratón tempranos para permitir el perfil relativamente imparcial de miRNAs en las primeras poblaciones de células de cresta neural. Superamos los desafíos de la baja entrada de células y la selección de tamaño durante la preparación de la biblioteca utilizando amplificación y purificación a base de gel. Identificamos la edad embrionaria como una contabilidad variable de la variación entre réplicas y los embriones de ratón coincidentes con la etapa deben utilizarse para perfilar con precisión los miRNAs en réplicas biológicas. Nuestros resultados sugieren que este método se puede aplicar ampliamente para perfilar la expresión de miRNAs de otros linajes de celdas. En resumen, este protocolo se puede utilizar para estudiar cómo los miRNAs regulan los programas de desarrollo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Introducción

Una cuestión central de la biología del desarrollo es cómo una sola célula indiferenciada puede dar lugar a todo un organismo con numerosos tipos celulares complejos. Durante la embriogénesis, el potencial de desarrollo de las células se restringe progresivamente a medida que el organismo se desarrolla. Un ejemplo es el linaje de la cresta neural, que se diferencia progresivamente de una población celular multipotente en varios derivados terminales, como las neuronas periféricas, la glia, el hueso craneal y el cartílago. Las células de la cresta neural se especifican desde el ectodermo durante la gastrulación y luego se someten a una transición epitelial a la transición mesenquimal y migran a través del embrión a lugares discretos en todo el cuerpo donde se diferenciarán terminalmente1. Décadas de trabajo han descubierto una red reguladora de genes transcripcionales, pero mucho menos se sabe sobre los mecanismos de regulación post-transcripción que controlan el momento del desarrollo de la cresta neural.

El trabajo anterior sugiere que los microRNAs (miRNAs) reprimen la expresión génica para el tiempo adecuado del desarrollo y las decisiones de destino celular2,3,4,5,6. Los estudios de miRNAs en el desarrollo de la cresta neural se han centrado en gran medida en etapas posteriores del desarrollo craneofacial. Por ejemplo, miR-17-92 y miR-140 son críticos para la palatogénesis durante el desarrollo craneofacial en ratones y peces cebra, respectivamente7,8. La contribución de los miRNAs a las primeras decisiones de destino de la cresta neural del embrión no se ha investigado a fondo. Los estudios de los miRNas en las decisiones de destino temprano se han visto limitados por desafíos técnicos como el bajo número de células presentes en los primeros embriones.

Los MiRNas se han perfilado in vitro a partir de líneas celulares utilizando cuerpos embrionados en diferentes etapas de diferenciación para modelar el desarrollo temprano del ratón9. La investigación de los pequeños ARN in vivo durante el desarrollo temprano de los mamíferos ha sido relativamente limitada. Los métodos anteriores para perfilar los miRNAs han llevado al sesgo, ya que una secuencia conocida se utiliza para analizar la expresión de un miRNA específico en métodos como qPCR, microarrays y manchas septentrionales10. La secuenciación de próxima generación y la mejora de las herramientas moleculares ahora permiten un análisis relativamente imparcial de la expresión de miRNA para estudiar su contribución al desarrollo temprano de mamíferos y a las decisiones sobre el destino celular.

Aquí, informamos de una técnica para cosechar y secuenciar pequeños ARN expresados en células de cresta neural desde embriones de ratón temprano que abarcan la gastrulación (E7.5) hasta el comienzo de la organogénesis (E9.5). Esta técnica es sencilla y combina el trazado de linaje, la clasificación de celdas y la selección de tamaños basados en gel para preparar bibliotecas de secuenciación de ARN pequeñas a partir de un número mínimo de celdas para la secuenciación de próxima generación. Destacamos la importancia de la coincidencia estricta de la etapa de somita de embriones para resolver intervalos de tiempo de 6 horas para obtener una visión completa de los miRNAs durante los rápidos cambios de desarrollo temprano. Este método se puede aplicar ampliamente a los estudios genéticos y de desarrollo y evita la agrupación de embriones. Describimos una manera de superar los desafíos de los métodos actuales, como el enriquecimiento de miRNA mediante la purificación basada en gel, la cuantificación de bibliotecas y la minimización del sesgo introducido desde la PCR. Este método se ha utilizado para identificar patrones de expresión de miRNA a lo largo del tiempo para estudiar cómo los miRNAs controlan el tiempo de desarrollo en el linaje de cresta neural de los embriones de ratón.

Protocolo

Todos los procedimientos de investigación y cuidado de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Baylor College of Medicine y alojados en la Asociación para la Evaluación y Acreditación de las instalaciones de animales aprobadas por el Cuidado de Animales de Laboratorio en Baylor College of Medicine. Todas las cepas se mantuvieron en el fondo C57BL6.

1. Disección de embriones (E7.5-E9.5)

  1. Retire los cuernos uterinos de un ratón hembra embarazada, esterilizando el abdomen con 70% de etanol donde se debe hacer la incisión.
  2. Limpie el útero enjuagando con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Coloque el útero en un plato de plástico estéril de 10 cm.
  3. Usando tijeras de microdisección, separe cada región que contenga decidua una de la otra. Pelar el músculo uterino y exponer todas las deciduas. Uno por uno, retire la decidua de cada embrión.
  4. Retire el saco de yema de cada embrión y ahorre para el genotipado.
  5. Mueva todos los embriones a un nuevo plato de PBS fresco para la toma de imágenes.
  6. Tome una imagen de toda la camada. Imagen de cada embrión individualmente y contar el número de somitas de cada embrión. Mantenga el aumento y la exposición (para la fluorescencia) lo mismo entre los experimentos.
    NOTA: Encontramos que la exposición de 50-200 ms es adecuada para la fluorescencia y que 20 ms es adecuado para el ajuste de campo brillante.

2. Disociación de embriones y clasificación celular

  1. Para cada embrión que se va a ordenar, haga lo siguiente.
    1. Decapitar justo encima del placode otico para embriones mayores que E8.0 (si sólo se desean células etiquetadas de la región craneal). Para embriones E7.5, elimine las estructuras extramblarónicas (si solo se desea el embrión adecuado).
    2. Mueva la cabeza en un volumen mínimo de PBS a un pozo limpio de una placa de 48 pozos. Añadir 250 l de papaína (27 U/ml). Pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente usando un p200.
    3. Compruebe bajo el microscopio y busque grumos y células individuales.
    4. Repita el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo hasta que se logre una sola suspensión de celda (generalmente tres rondas de pipeteo hacia arriba y hacia abajo, lo que debe equivaler a entre 30 s y 1 min para E7.5-E9.5).
    5. Enfriamiento con 250 ml de suero bovino fetal (FBS).
    6. Repita los pasos 2.1.1-2.1.5 para cada embrión que se va a ordenar.
  2. Filtrar 500 l de la suspensión celular a través de un tubo de tapa de filtro de malla de nylon de 35 m para eliminar los grumos.
  3. Tome el filtrado y muévase al nuevo tubo de 1,5 ml y gire a 200 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante cuidadosamente y transfiera a un tubo nuevo (salvo hasta que se sepa que las células vivas están en el pellet).
  4. Resuspendid el gránulo de células en 300 l de PBS que contiene 0.5-1% albúmina sérica bovina y mantener en hielo hasta la clasificación (minimizar el tiempo entre ahora y el final de la clasificación).
    1. Si lo desea, tome 10 ml de suspensión celular y combínela con 10 l de color azul de Trippan (0,4%) y contar usando un hemocitometómetro para identificar la cuantificación celular aproximada y la viabilidad como Trypan azul sólo mancha las células muertas.
  5. Justo antes de ordenar, filtre cada muestra de nuevo a través de un tubo de tapa de filtro y agregue la mancha DAPI para las células vivas.
  6. Ordene cada muestra en 500 ml de solución de lysis de extracción de ARN (ver Tabla de materiales)en el clasificador de células con boquilla de 70 m.
  7. Mezclar y almacenar a -80 oC hasta que se recojan todas las muestras. Proceda desde este punto sólo cuando se cosechan todas las muestras necesarias para un experimento para reducir la variación técnica entre las rondas de preparación de la biblioteca.

3. Extracción de ARN

NOTA: El protocolo está adaptado del kit de aislamiento de ARN; ver Tabla de Materiales.

  1. Añadir 500 l de solución de lysis de extracción de ARN (ver Tabla de Materiales) a cada muestra para hacer el volumen total 1000 l.
  2. Descongelar cada muestra a temperatura ambiente.
  3. Vórtice cada muestra durante 1,5 min, asegurándose de que la tapa esté segura en cada tubo antes de iniciar la homogeneización. Incubar el homogeneato a temperatura ambiente (15–25oC) durante 5 min.
  4. Añadir 140 l de cloroformo, tapar firmemente y agitar vigorosamente durante 15 s. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min.
  5. Centrífuga durante 15 min a 12.000 x g a 4oC. Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de recogida sobre hielo. No transfiera ninguna fase o ninguna fase orgánica. Al acercarse a la fase orgánica rosa, incline el tubo hacia un lado y retire pequeñas alícuotas hasta que no se pueda recoger una fase acuosa clara.
  6. Mida el volumen de ARN que contiene la fase acuosa recogida de cada muestra para el cálculo correcto en el siguiente paso.
  7. Añadir 1,5 volúmenes (normalmente 525 l, pero puede ser ligeramente más o menos) de etanol al 100% y mezclar a fondo por pipeteo.
  8. Pipetear hasta 700 l de muestra, incluyendo cualquier precipitado, en columna en un tubo de recolección de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a ≥8.000 x g durante 15 s a temperatura ambiente. Deseche el flujo a través.
  9. Repita el paso 3.8 utilizando el resto de la muestra.
  10. Lave la columna según las instrucciones del fabricante. Seque la columna girando a toda velocidad durante 1 min. Transfiera la columna a un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml.
  11. Pipetear 11 l de agua libre de nucleasas sobre el centro de la membrana. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min. Gire la velocidad máxima durante 1 min para eluir de la columna.
  12. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro y un instrumento de electroforesis capilar paralela (Tabla de materiales).

4. Preparación de la biblioteca

NOTA: El protocolo está adaptado del pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN; ver Tabla de Materiales.

  1. Complete la desnaturalización y la ligadura del adaptador de 3' como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN utilizando la dilución de 1/4 del adaptador de 3'.
  2. Continúe con el exceso de extracción del adaptador de 3'.
  3. Complete el agotamiento del adaptador como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN. Asegúrese de utilizar etanol 80% recién preparado para la limpieza del cordón y que todo el exceso de etanol se elimina por completo justo antes de la resuspensión en agua libre de nucleasas sin secar en exceso las perlas (el agrietamiento del pellet de cuentas se observa en el exceso de secado).
  4. Proceda directamente a la inactivación excesiva del adaptador.
  5. Complete el exceso de inactivación del adaptador como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN que ensambla todos los reactivos sobre hielo.
  6. Continúe con la ligadura del adaptador 5' 4N.
  7. Completa la ligadura del adaptador de 5' como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN, asegurándose de utilizar una dilución de 1/4 del adaptador de 5' y ensamblando todos los reactivos sobre hielo.
  8. Proceda a invertir la transcripción.
  9. Complete la síntesis de la primera hebra de transcripción inversa como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN y teniendo cuidado de ensamblar todos los reactivos en hielo y no mantener la enzima fuera del congelador durante largos períodos de tiempo.
    NOTA: En este punto, el protocolo puede ser detenido, con muestras almacenadas durante la noche a 4 oC. Alternativamente, continúe con la amplificación de PCR.
  10. Amplificación completa de PCR mediante el montaje de los reactivos como se indica en el pequeño manual del kit de preparación de la biblioteca de ARN y minimizando el número de ciclos de PCR. El número de ciclos de ITP debe determinarse experimentalmente para cada aplicación y debe utilizarse el número mínimo de ciclos. Aquí utilizamos 16 ciclos para amplificar con éxito nuestras pequeñas bibliotecas de ARN.
  11. Proceda directamente a la selección de tamaño.

5. Selección de tamaño

  1. A cada muestra, agregue 5 l de tinte de carga de gel 6x y pipeta para mezclar.
  2. Cargue 10 l de escalera en el primer pocólito del gel, dejando el pozo inmediatamente a la derecha vacío. Cargue todo el producto del paso 5.1 en un 6% de Tris/borate/ácido etilendiaminetetraacético – gel de poliacrilamida (TBE-PAGE) y deje 1 carril entre cada muestra.
    NOTA: Mantenga el recipiente en el que entró el gel para los pasos posteriores.
  3. Ejecute el gel a 150 V durante aproximadamente 30-40 minutos en un tampón de funcionamiento TBE de 0,5x (hasta que la banda de tinte inferior esté cerca de la parte inferior del gel, 0,5-1 cm).
  4. Haga 1 L de solución de tinción mientras el gel está en funcionamiento: SYBR Gold diluido 1:10,000 en 0.5x TBE.
  5. Cuando el gel haya terminado de funcionar (es decir, la banda de tinte inferior está cerca de la parte inferior del gel), retire cuidadosamente el gel de las placas de vidrio, observando la orientación del gel.
  6. Coloque el gel en la bandeja de su embalaje original. Retire el TBE 0.5x y sustitúyalo por la solución de tinción del paso 5.5. Gel de mancha durante 15 min. Es posible que sea necesario aumentar el tiempo de tinción.
  7. Coloque el gel sobre un transilluminador UV, teniendo cuidado de no rasgar el gel y manteniendo la orientación mencionada anteriormente (re-tin durante un tiempo adicional si las bandas de la escalera no se pueden ver claramente).
  8. Imagen del gel una vez que se complete la tinción en el transilluminador UV con una cámara.
    1. Si se requiere una imagen mejor, utilice primero un aparato de imagen que no sea el transiluminador UV para capturar una imagen del gel antes de cortar las bandas en un transilluminador UV, ya que la imagen directamente en el transilluminador UV provoca la coloración variable del fondo como se muestra en la Figura 3A-B. No mueva el gel demasiadas veces, ya que es delicado y puede romperse.
  9. Identifique y retire la banda de 150 bp con una cuchilla de afeitar limpia y colóquela en un tubo limpio de 1,5 ml. No corte la banda de 130 bp (producto de dimer adaptador).
    1. Vuelva a hacer una imagen del gel después de retirar los sectores que contienen el producto de la biblioteca para fines de documentación.
  10. Gire los tubos de microcentrífuga que contienen la rodaja de gel a una velocidad máxima durante 30 s para recoger las rodajas en la parte inferior de cada tubo.
  11. Utilice una punta p200 para cada muestra para triturar la rebanada de gel en los trozos más pequeños posibles. Expulse cada punta en cada tubo.
  12. A cada tubo, agregue 300 ml de tampón de elución, teniendo cuidado de lavar las brocas de gel del lado del tubo y vuelva a colocar la punta del p200 y lave la punta para cada muestra.
  13. Colocar las muestras eluyentes en una incubadora de agitación establecida en 25 oC. Incubar durante la noche con agitación de 1000 rpm. Retire los tubos de la incubadora y gire a máxima velocidad durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  14. Transfiera el sobrenadante que contiene el producto de la biblioteca a una placa de 2 ml libre de 96 pozos. Tenga cuidado de no transferir ningún gel.
  15. Agregue 50 cuentas de limpieza de L a cada muestra y mezcle por pipeteo. Inmediatamente, agregue 350 l de isopropanol y mezcle por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos con balanceo.
  16. Pulse la placa de centrifugado a las cuentas de pellet y luego magnetice durante 2 minutos. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  17. Añadir 950 l de etanol al 80%. Incubar durante 30 s. Retire todo el sobrenadante. Repita el procedimiento para un total de dos lavados de etanol.
  18. Secar la muestra durante 3 min. En este paso tenga cuidado de eliminar cualquier etanol residual que se acumula en la parte inferior de cada pozo (no más de una vez) y no secar demasiado las cuentas (el secado excesivo resultará en el agrietamiento del pellet de cordón).
  19. Retire todo el líquido residual en la parte inferior del pozo. Retire la placa del soporte magnético.
  20. Resuspender el pellet en 13 l de tampón de resuspensión. Mezclar con pipeta hasta que quede homogéneo. Incubar durante 2 min y luego magnetizar durante 3 min.
  21. Transfiera 12 l de sobrenadante a un tubo limpio o a un pozo de placa limpia para su posterior almacenamiento. Almacene todas las muestras a 4 oC durante la noche o a -20 oC a largo plazo.
  22. Compruebe el tamaño y la concentración de los fragmentos presentes en cada biblioteca utilizando el ensayo de ADN de alta sensibilidad de electroforesis capilar. Confirme la concentración con más de un método.
    NOTA: Ocasionalmente hemos utilizado el kit de sensibilidad estándar para evitar sobrecargar la electroforesis capilar.

Resultados

Usando el procedimiento demostrado aquí, hemos cosechado embriones en E7.5, E8.5 y E9.5. Las estructuras extraenmónicas se eliminaron de todos los embriones y luego los embriones se escenificaron para resolver intervalos de tiempo de 6 horas(Figura 1A-1B). Utilizando el análisis de componentes de principio para agrupar muestras basadas en la similitud, encontramos que las muestras se agrupan por edad, destacando la variación como resultado de la edad embrionaria y la necesidad de una cuidadosa coincidencia de somita para réplicas biológicas (Figura 1C). Perfilamos el epiblast pluripotente en E7.5, el linaje rastreó las células de la cresta neural premigratorias y migratorias usando Wnt1-Cre en E8.5 y las células de cresta neural migratoria usando Sox10-Cre en E9.5 (Figura 1D). Aquí cosechamos específicamente la cresta neural craneal decapitando el embrión justo por encima del placode otico. Una comparación de los dos controladores Cre (Wnt1 y Sox10) que se utilizan con frecuencia para etiquetar las células de cresta neural confirma que marcan diferentes poblaciones en embriones de ratón tempranos (Figura 1E). Las estrategias de gating se utilizaron para obtener células positivas RFP únicas vivas que se clasificaron directamente en la solución de lysis de extracción de ARN (ver Tabla de materiales)y se almacenaron a -80 oC(Figura 1F). Es importante realizar un seguimiento de cuántas células se cosecharon de cada muestra.

El aislamiento de ARN se realizó utilizando una versión modificada del protocolo del kit de ARN. Específicamente, utilizamos las columnas de mini ARN que se almacenarán a 4 oC. Estas columnas son útiles para elución en un pequeño volumen (11 l) para obtener la mayor concentración posible de ARN de muestras donde la entrada de células es limitante. Por esta misma razón, es importante obtener toda la fase acuosa después de la extracción de cloroformo fenol. El pipeteo lento y la inclinación del tubo hacia un lado mientras se recoge son críticos para maximizar el rendimiento. En este procedimiento, cuantificamos el ARN utilizando tanto un espectrofotómetro, para obtener información sobre la contaminación sal/proteína, como una electroforesis capilar para medir la concentración (Figura 2). El rastro del espectrofotómetro revela que el ARN se aisló sin proteínas contaminantes pero tiene un alto contenido de sal(Figura 2A-2B). Lo ideal es que la relación 260/280 sea de 1,8 y la relación 260/230 debería ser >2,0. El rendimiento total de ARN medido por el espectrofotómetro no aumentó con la edad entre E8.5-E9.5. Esto se debe a que la resolución del espectrofotómetro no es lo suficientemente sensible como para detectar cambios en la concentración de ARN a partir del número de células que estamos cosechando, y recomendamos utilizar la información de concentración obtenida de la electroforesis capilar (Figura 2C). El rastro de electroforesis capilar se puede utilizar para estimar la concentración y el tamaño de los fragmentos de ARN. Los picos <1000 nucleótidos son indicativos de degradación. La traza representativa es consistente con el ARN que no se degrada. Los picos a 2000 nucleótidos y 5100 nucleótidos son 18s y 28s rRNA, respectivamente. La pequeña región de ARN se encuentra en 150 nucleótidos(Figura 2D).

Las pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN se prepararon utilizando el pequeño kit de preparación de la biblioteca de ARN descrito en la Tabla de materiales. Aquí utilizamos sólo menos de la mitad del ARN obtenido de cada muestra (4 l de la elución de 11 l, 80-120 ng) que permite sintetizar las bibliotecas de secuenciación de ARN a partir del ARN restante de cada muestra. Aquí diluimos los adaptadores de ARN pequeños de 3' y 5' 1/4 para reducir la cantidad de dimers de adaptador presentes y sugerimos que los pasos de ligadura del adaptador, limpieza y transcripción inversa se completen tanto como sea posible de manera continua. Hemos utilizado 16 ciclos de PCR para amplificar las bibliotecas y sugerir que el número mínimo de ciclos de PCR para cualquier experimento se determine empíricamente. Al completar el exceso de ciclos de PCR, se podría inflar artificialmente el recuento de lectura de un miRNA poco expresado.

La selección de tamaño es imprescindible para enriquecer para las bibliotecas de miRNAs y no para los dimers de adaptador, que suelen estar presentes. El tamaño del producto de la biblioteca (150 bp) y los dimers del adaptador (130 bp) son muy similares en tamaño. La extracción de gel se utiliza para aislar las pequeñas bibliotecas de secuenciación de ARN lejos de los dimers del adaptador (Figura 3). Una imagen de un gel PAGE antes de la escisión muestra que una multitud de tamaños de producto están presentes en cada muestra (Figura 3A). Es importante dejar un carril abierto entre dos muestras o una escalera que se carga en el gel. El frente de migración en la parte inferior del gel es ligeramente curvado, lo que indica que correr a una velocidad más lenta puede ser necesario si la banda de 150 bp es difícil de distinguir para todas las muestras. Esta imagen representativa también muestra una abundancia de 150 bp producto de la mayor concentración de ARN de control positivo (ARN total del cerebro de una rata) que entró en la preparación de la biblioteca en comparación con el que entró en cada muestra embrionaria. El control negativo revela que los reactivos estaban libres de contaminar especies de ácido nucleico (Figura 3A). La escisión de la banda de 150 bp debe hacerse con una cuchilla de afeitar limpia y el área recogida se muestra en la Figura 3B. Los rastros de electroforesis capilar antes y después de la selección de tamaño muestran la mejora dramática de la pureza del producto de la biblioteca de 150 bp con purificación de gel(Figura 3C-3D). Es importante tener en cuenta que las trazas de la Figura 3C-3D tienen picos de muestra más altos que los marcadores, indicativos de sobrecarga. En estos casos, el tamaño de los fragmentos puede ser preciso, sin embargo, la concentración puede no. La cuantificación se puede obtener diluyendo las bibliotecas en el rango de los marcadores o utilizando métodos alternativos. Encontramos alguna variación entre los métodos alternativos de cuantificación de bibliotecas y recomendamos que se prueben empíricamente varios métodos de cuantificación. La cuantificación precisa de la concentración es esencial cuando se maximiza el número de muestras a secuenciar a la vez. Las bibliotecas se diluirán hasta 1,3 pM para la secuenciación y, en general, en cualquier lugar de 15 a 25 muestras se pueden secuenciar a la vez en un kit de secuenciación de 150 ciclos que proporciona 140 millones de lecturas. Esto da como resultado alrededor de 5 millones de lecturas por muestra. Generalmente las tasas de mapeo están entre 60-80%.

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Figura 1: Cosecha de células de embriones de ratón para la secuenciación de ARN pequeño. (A) E8.5 embrión de ratón para resaltar la eliminación del saco de yema y los somitas utilizados para determinar la etapa del embrión (B) Somite estadado de embriones de ratón para capturar las etapas del desarrollo de la cresta neural (C) Análisis de componentes principales de bibliotecas preparadas a partir de células de cresta neural de tipo silvestre ordenado que muestran que las muestras se agrupan por edad (D) Esquemática que muestra cómo se cosecharon las muestras utilizando Wnt1-Cre en E8.5 para etiquetar células de cresta neural premigratorias y migratorias y Sox10-Cre en E9.5 para etiquetar sólo las células de cresta neural migratorias (E) Análisis de componentes principales de bibliotecas preparadas a partir de células de cresta neural tipo salvaje ordenadas que muestran muestras agrupadas por Cre-driver independientemente de la edad (F) Estrategia de gating utilizado para aislar las células de cresta neural RFP + de los embriones E8.5 y E9.5 utilizando la clasificación FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Aislamiento de ARN de embriones de ratón E7.5-E9.5. (A) Traza representativa del espectrofotómetro de un aislamiento de ARN de la etapa más joven del embrión que hemos aplicado este protocolo. (B) Tabla que muestra los valores representativos de la calidad del ARN obtenidos del espectrofotómetro. (C) Ejemplo del ARN cosechado a partir de células de cresta neural ordenadas de embriones de cada edad (D) Traza de electroforesis capilar que muestra ARN de buena calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Bibliotecas de MIRNA antes y después de la selección de tamaño. (A) Gel TBE-PAGE que muestra pequeñas bibliotecas representativas de ARN para cuatro muestras y controles antes y (B) después de la escisión de banda de 150 bp. Las flechas representan la banda de 150 bp que se extirpará (C) Traza de electroforesis capilar de la pequeña biblioteca de ARN antes y (D) después de la selección del tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los procesos de desarrollo pueden proceder rápidamente, y las células están siendo sometidas a muchas especificaciones secuenciales, de tal manera que para capturar una visión completa de los miRNAs que contribuyen a las decisiones de destino temprano, se necesita una puesta en escena más específica que el incremento de medio día ampliamente utilizado. Un estudio reciente ha realizado la secuenciación de ARN de Theiler etapa 12 embriones que van desde tener 3 a 6 somites11. Encontramos que durante este período de tiempo, se especifican las células de la cresta neural (3 somites de edad), delaminar (4 somites de edad) y migrar (5-6 somitas de edad). También encontramos que además del controlador Cre utilizado para linaje rastrear las poblaciones celulares, la edad es la mayor fuente de variación entre muestras biológicas, y sólo los embriones emparejados con somita deben considerarse como réplicas. Esto también debe tenerse en cuenta al comparar embriones transgénicos con controles de tipo salvaje.

Los métodos anteriores para perfilar los miRNAs durante el desarrollo temprano han utilizado entre 10-100 ng de entrada de ARN para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN pequeño y han agrupado varios embriones en una muestra13,,14. Demostramos aislamiento de ARN y preparación de bibliotecas a partir de un solo embrión E7.5 o de células de cresta neural ordenadas en E8.5 y E9.5 utilizando aproximadamente 100 ng de ARN total como entrada. Al disociar embriones para la clasificación, uno debe tener cuidado de observar la disociación bajo un microscopio y apagar la reacción para observar cuando se obtienen células individuales. Encontramos que la disociación de la región craneal de los embriones E8.5-E9.5 es casi instantánea con pipeteo manual suave como se describe en el protocolo. Para los tejidos más grandes y los embriones cada vez más antiguos, el tiempo de disociación puede ser más largo dependiendo de la porción del embrión que se está disociando. Para los embriones E7.5-E9.5, los grupos de células son fácilmente visibles bajo el microscopio y la disociación debe continuar hasta que no se vean más grumos. Las celdas individuales son visibles en la solución si ajusta el enfoque a través de la solución en su pozo en cualquier lugar de 5-10x. Los métodos anteriores ordenan las células directamente en el búfer de leis para la secuenciación de ARN para preparar el ARN a granel de un número bajo de células14. Aquí nos clasificamos directamente en la solución de lisis de extracción de ARN para que el ARN pueda aislarse antes del inicio de la preparación de la biblioteca. El uso de mini columnas con un volumen de elución de 11 l permitió una concentración de ARN lo suficientemente alta como para que una sola preparación de ARN pudiera dividirse entre la secuenciación de ARN pequeño y ARN a granel.

Una limitación de corriente de la mayoría de los métodos de secuenciación de ARN pequeños es la amplificación PCR del ADNc convertido. Nuestro método no supera esta limitación, pero pudimos minimizar el número de ciclos de PCR desde el máximo de 25 hasta 16 ciclos. Esta reducción en la amplificación disminuye el sesgo de amplificación artificial introducido por pcR. Otra fuente de sesgo es la ligadura de adaptadores, donde se sabe que las secuencias específicas ubicadas en los extremos de los adaptadores y los miRNAs pueden ligar junto con una mayor eficiencia que otras secuencias. Para evitar esto, los adaptadores utilizados en este protocolo tienen 4 bases aleatorias incorporadas al final de cada adaptador para evitar el sesgo en las reacciones de ligadura. Además, otro problema común es la cantidad de dimers de adaptador que se forman cuando la entrada de ARN es baja. El kit de preparación de la biblioteca incluye pasos para reducir la formación de dimer del adaptador, como la inactivación del adaptador y las limpiezas de cuentas para eliminar el exceso de adaptadores después de cada ligadura. También diluimos los adaptadores 3' y 5' 4N en 1/4 para reducir la cantidad de dimer adaptador que se puede formar. Encontramos que cuando no se diluye, la intensidad de la banda de 130 bp aumenta haciendo difícil distinguir de la banda de 150 bp que contiene las pequeñas bibliotecas de ARN deseadas en un gel.

Otro desafío actual de la preparación de bibliotecas de secuenciación es la cuantificación precisa del producto antes de la secuenciación. Hemos encontrado que diferentes métodos dan resultados variables en la misma biblioteca. Sugerimos que los investigadores utilizan múltiples métodos de cuantificación para obtener una estimación precisa de la concentración.

Este protocolo se puede aplicar ampliamente a estudios genéticos, de desarrollo u otras aplicaciones donde el ARN se está cosechando de un número bajo de células. Este enfoque simplifica los estudios temporales evitando la agrupación de embriones y se puede aplicar fácilmente tanto a células no ordenadas como ordenadas.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este proyecto fue apoyado por la Fundación Andrew McDonough B+ y el NIH (R01-HD099252, R01-HD098131.   R.J.P. es becaria cprit en investigación del cáncer (RR150106) y V scholar in Cancer Research (V Foundation). Los autores también desean reconocer el núcleo de citometría y clasificación celular en BCM por proporcionar el equipo necesario para este proyecto.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#5 Pinzas Fine Science ToolsFisher ScientificNC9277114
0.4% Azul TrypanThermoFisher15250061
10 cm Placas de PetriFisher Scientific07-202-011
2-PropanolMiilapore SigmaI9516-500ML
5 % Criterion TBE Gel de poliacrilamida, 12+2 pocillos, 45 y micro; LBio-Rad3450047
5200 Analizador de fragmentosAgilentM5310AA
placas de PCR de 96 pocillos de perfil alto semi faldón claro/claroBio-RadHSS9601
BD FACSAria IIbdbiosciences
, fracción VFisher ScientificBP1600100
Dulbecco's Phosphate-Buffered Solución salina (DPBS)GendepotCA008-300
Tubos EppendorfFisher Scientific05-408-129
Etanol puro, 200 pruebasanhidro Sigma AldrichE7023-500ml
FC-404-2001IlluminaFC-404-2001
HS NGS Kit de fragmentosAgilentDNF-474-0500
HS Kit de ARNAgilentDNF-472-0500
miRNeasy Mini Kit (50)Qiagen217004
NEXTflex Small RNA-Seq Kit v3 (48 códigos de barras)Fisher ScientificNC1289113
NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 ciclos)IlluminaFC-404-2001
NGS Fragment kitAgilentDNF-473-1000
PapainWorthingtonLK003176resuspender en 5 mL de PBS libre de Ca/Mg para una concentración final de 27 U/mL
Tinción de gel de ácido nucleico SYBR GoldThermoFisherS11494
Trizol LSThermoFisher10296028
UVP Transiluminadores UV de sobremesa: UV simpleTijeras Fisher ScientificUVP95044701
Vannas Straight Fine Science Tools #91500-09Fisher ScientificNC9609583
Albúmina sérica bovina

Referencias

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