由上皮细胞和原代免疫细胞组成的用于危害评估的多细胞人类肺泡模型

摘要

本文介绍了一种从人外周血中分离单核细胞，并将其分化为巨噬细胞和树突状细胞，进而与上皮细胞共同组装成多细胞人肺模型的实验方案。该研究比较了由新鲜分离或冻存后解冻的单核细胞分化而来的免疫细胞所构成的共培养体系，在受到促炎刺激后的生物学反应。

摘要

本文描述了一种用于模拟肺泡上皮组织屏障的人肺泡细胞共培养模型，该屏障由肺泡上皮II型细胞以及两种免疫细胞（即人单核细胞来源的巨噬细胞[MDMs]和树突状细胞[MDDCs]）组成。文中提供了一种构建多细胞模型的实验方案。肺泡上皮细胞（A549细胞系）首先在可渗透性培养小室的双室培养板中于浸没条件下生长并分化，随后与已分化的MDMs和MDDCs共同培养。最后，将细胞暴露于气液界面条件下数天。由于人原代免疫细胞需从人血沉棕黄层中分离获得，因此本文比较了由新鲜或冻存后解冻的单核细胞所分化成的免疫细胞，以便根据实验需求优化方法。由肺泡细胞与新鲜分离或冻存解冻后单核细胞来源的免疫细胞组成的三维模型，在受到促炎刺激物（脂多糖和肿瘤坏死因子α）刺激后，其细胞因子（白细胞介素6和8）的释放量相较于未处理组细胞均表现出统计学上显著升高。另一方面，不同共培养体系之间的细胞因子释放水平无统计学显著差异。这表明，本研究所建立的模型在存在由新鲜或冻存外周血单核细胞（PBMs）分化而来的MDMs和MDDCs时，能够对促炎刺激产生响应。因此，该模型是研究机体对不同物质（包括气溶胶化药物或纳米材料）急性生物学反应的有力工具。

引言

体外肺细胞培养为评估气溶胶危害提供了经济高效、稳健且高度可控的平台¹。作为人肺泡上皮细胞的模型细胞系统，常使用源自肺腺癌的上皮细胞系A549²。这些细胞代表肺泡区域的鳞状II型上皮细胞³，是广泛用于危害和毒性评估的肺细胞系^{1,4,5,6,7,8,9,10}。A549细胞系具有肺泡上皮II型细胞的相关特征，例如含有致密排列磷脂的特征性板层小体³。

研究表明，当细胞在气液界面（ALI）培养时，表面活性物质会释放到暴露于空气的上皮细胞的顶侧，从而降低表面张力^11,12,13。这一特性在纳米材料呼吸危害和毒性研究中尤为重要。吸入的纳米材料/毒物一旦沉积在肺泡区域，首先与肺表面活性物质相互作用，并在润湿力的作用下被置换至水性亚相层，在此与肺部细胞发生相互作用^14,15。尽管A549细胞可形成单层（在ALI条件下长期培养时可增殖为多层）并产生表面活性物质，但其不足之处在于紧密连接形成不充分，导致跨上皮电阻值较低，但仍具备 一定的功能屏障作用，可阻止细胞间（纳米）颗粒的转位^16,17,18。

在肺脏中存在多种免疫细胞群体，包括吞噬性细胞和专职抗原提呈细胞（即巨噬细胞和树突状细胞），这些细胞通过细胞间直接接触或细胞间信号传导相互交流，以调控并维持内环境稳态。巨噬细胞和树突状细胞是先天免疫的关键效应细胞，也是启动适应性免疫应答的重要始动者¹⁹。位于上皮层内或其下方的树突状细胞可形成穿过上皮层伸向管腔的突起，以捕获抗原。肺泡巨噬细胞位于上皮细胞的顶面，作为哨兵细胞，构成抵御外来物质以及细菌、病毒和真菌感染的第一道细胞防线。其表型可塑性使其能够迅速响应刺激，诱导促炎反应，同时也可转变为触发抗炎（即抑制性）反应的状态²⁰。

为了模拟人体肺泡上皮组织屏障，我们建立了一种三重共培养模型，在该模型中，A549细胞的顶侧和基底侧分别添加了人外周血单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）和树突状细胞（MDDCs）¹⁷。该模型在气液界面（ALI）条件下的培养已有先前报道¹⁶，甚至可在暴露后持续培养长达72小时²¹。与浸没式培养条件相比，在ALI条件下暴露于碳纳米管后，细胞培养物的急性免疫反应显著增强²²。该共培养模型在气液界面（ALI）中培养并暴露于不同材料，已被用于研究暴露于氧化锌²³、石墨烯相关材料²⁴、金纳米颗粒^25,26、碳纳米管²¹以及火山灰和柴油机尾气颗粒物²⁷时的细胞毒性、氧化应激和炎症反应。

此外，已证实巨噬细胞和树突状细胞作为免疫效应细胞在体外人肺模型中的重要作用。特别是与单层培养系统相比，仅在存在免疫细胞的情况下，该模型中才观察到增强的促炎反应⁷。使用原代单核细胞来源免疫细胞的潜在缺点包括外周血单个核细胞（PBMs）获取受限以及供体间变异。为解决这些潜在问题，本文提出了一种方案，即对 freshly isolated PBMs²⁸ 进行冷冻保存，用于细胞培养模型的构建。本研究旨在展示三维人肺泡上皮组织模型的构建过程，包括从人血沉棕黄层中分离 PBMs。同时比较该模型对促炎刺激的反应性，模型所用细胞包括由新鲜 PBMs 分化而来的 MDMs 和 MDDCs，或由冻存/解冻 PBMs 分化而来的 MDMs 和 MDDCs。

处理未经检测的人类血液样本时需采取特定防护措施，以防止潜在的传染性疾病传播，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎和丙型肝炎。因此，必须采取个人防护措施，如佩戴手套、防护服、口罩和眼部保护装置，并严格遵守良好实验室规范原则。这些防护措施可降低皮肤或黏膜接触潜在感染性液体的风险。此外，对于涉及处理血沉棕黄层和外周血单个核细胞（PBMs）的人员，必须接种乙型肝炎病毒疫苗，且抗乙型肝炎抗体的血清滴度水平须高于100 IU/L（需符合所在国家的具体法律法规要求）。同时，所有操作必须在生物安全二级实验室中进行（需符合所在国家的具体法律法规要求）。在实施整个实验方案过程中，应遵循实验室环境中操作哺乳动物细胞培养相关的标准健康与安全预防措施，包括废弃物的处理。

方案

涉及从人血中分离的原代单核细胞的研究工作已获得瑞士联邦公共卫生局委员会的批准（批准编号：611-1，申报号 A110635/2），适用于阿道夫·梅克尔研究所。

1. 从人血沉棕黄层中分离外周血单核细胞（PBMs）

注意：以下部分描述了从一袋50 mL的白细胞层中分离免疫细胞的过程，该白细胞层购自瑞士伯尔尼的瑞士输血中心。

1. 试剂准备
   1. 每份血沉棕黄层制备 100 mL 磁性分离缓冲液：0.5% [w/v] 牛血清白蛋白（BSA；溶于磷酸盐缓冲液 [PBS]）中加入 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），调节 pH 至 7.2，使用孔径 0.22 µm 滤器无菌过滤。整个操作过程中保持 4 °C。
   2. 制备细胞培养基（CCM）：RPMI 1640 培养基含 10% [v/v] 胎牛血清（FBS）、1% [v/v] L-谷氨酰胺（此处为 2 mM L-谷氨酰胺）和 1% [v/v] 青霉素-链霉素（此处为 100 单位/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。
      注意：所需各试剂的量取决于后续步骤中接种细胞的数量。
2. PBM 的分离
   注意：所有玻璃器皿和塑料器皿在使用前均需灭菌。出于安全考虑，在处理人血样本时建议使用塑料器皿，以降低玻璃器皿造成伤害的风险。
   1. 使用剪刀剪开含有血沉棕黄层的袋子末端软管部分。
   2. 将袋中内容物通过袋的导管直接倾倒至两个 50 mL 圆锥形离心管中（每管约 25 mL）。
   3. 轻柔地将 PBS 倒入或用移液器加入离心管中，使总体积达到 50 mL。通过轻轻翻转离心管 3 次混匀内容物。
   4. 用移液器将血沉棕黄层-PBS 混合液分装至四个新的 50 mL 圆锥形离心管中，每管 25 mL。
   5. 使用 10 mL 血清移液器将 13 mL 密度梯度介质缓慢铺在血沉棕黄层-PBS 混合液下方。将装有介质的移液器从移液器架上取下后，立即用拇指堵住移液器上端开口，防止密度梯度介质继续流入血沉棕黄层-PBS 混合液中。
      注意：用拇指堵住上端开口后，将装有介质的移液器置于圆锥形离心管底部，使密度梯度介质缓慢流至血沉棕黄层-PBS 混合液下方，移液器内保留约 1 mL 介质。
   6. 对另外三个含有血沉棕黄层-PBS 混合液的离心管重复步骤 1.2.5。
   7. 将四个装有混合液的离心管以 1,000 x g、25 °C、慢速刹车模式离心 20 分钟。离心时使用带保护盖的转子。
   8. 打开每根离心管盖子，用血清移液器移除上层血浆和血小板层，并弃入生物危害液体废物容器中。
   9. 使用血清移液器收集外周血单个核细胞层，该层位于血浆层与密度梯度介质层之间，呈白色浑浊状薄层（厚度约 2–3 mm）。管底沉淀为红细胞。避免转移最底层的红细胞。对所有四根离心管重复此操作。
      注意：外周血单个核细胞包括 PBM 和淋巴细胞。PBM 将在后续磁性 CD14+ 分离过程中与淋巴细胞分离。
   10. 将四根离心管中的外周血单个核细胞合并至两根 50 mL 离心管中。
   11. 向两根离心管中加 PBS 至 50 mL，并盖上盖子。
   12. 将原始四根离心管中剩余的红细胞和血浆弃入生物危害液体废物容器中。
   13. 将两根离心管以 500 x g、18–20 °C、常规离心速度离心 8 分钟。
   14. 离心后，用血清移液器移除上清液，并弃入生物危害液体废物容器中。
   15. 用血清移液器加入 5 mL PBS 重悬细胞沉淀。
   16. 将细胞悬液合并至一根 50 mL 圆锥形离心管中，并用 PBS 补充至 50 mL。
   17. 取 5 µL 细胞悬液，使用台盼蓝（45 µL）排除法配合细胞计数仪进行细胞计数。
   18. 将 10 µL 台盼蓝-PBM 溶液加入细胞计数板室，按照标准计数流程计数细胞数量。使用公式 1 计算总细胞数 C_T。
       
   19. 完成细胞计数后，按步骤 1.2.13 的条件对 50 mL 离心管进行离心。
3. CD14 阳性筛选
   1. 轻柔打开每根离心管盖子，用血清移液器移除上清液并弃去，注意不要扰动管底细胞沉淀。
   2. 加入计算所得体积的磁性分离缓冲液（公式 2；此处为每 1 × 10⁷ 个总细胞加 80 µL 缓冲液），通过反复吹打重悬细胞沉淀。
      
   3. 根据公式 3（此处为每 1 × 10⁷ 个总细胞加 10 µL）计算所需 CD14+ 磁珠体积，并用移液器加入相应体积。
      
   4. 通过反复吹打充分混匀，盖上盖子，在 4 °C 下孵育 15 分钟。
   5. 孵育结束后，用磁性分离缓冲液将离心管补至 50 mL。
   6. 按步骤 1.2.13 的条件进行离心。
   7. 用血清移液器吸除并弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
   8. 加入相应体积的磁性分离缓冲液（公式 4；此处为每 1 × 10⁸ 个细胞加 500 µL 缓冲液），通过反复吹打 3 次轻柔混匀。
      
   9. 用消毒剂喷洒并擦拭磁性分离装置以进行消毒，并将其与磁性分离柱一同放入超净工作台中。
   10. 将磁性分离柱置于磁场中，并在其正下方放置一个空的 50 mL 圆锥形离心管，用于收集洗涤液和未标记细胞（即废液）。
   11. 用移液器向磁性分离柱中加入 3 mL 磁性分离缓冲液，冲洗分离柱。整个操作过程中切勿让柱子干燥。
   12. 准备一个 15 mL 圆锥形离心管，并加入 1 mL 磁性分离缓冲液。
   13. 将步骤 1.3.8 制备的细胞悬液加入磁性分离柱中。在滤柱下方的 50 mL 圆锥形离心管中收集穿过的未标记细胞。
       注意：每根柱子处理的细胞数不得超过 2 × 10⁹ 个，以免堵塞柱子。
   14. 当柱子储液腔排空（即细胞已完全通过柱子）后，立即用血清移液器加入 3 mL 磁性分离缓冲液，使其通过柱子。重复此步骤 3 次。
   15. 用手轻轻将磁性分离柱从磁性分离器上取下，放入步骤 1.3.12 中预先加入 1 mL 磁性分离缓冲液的 15 mL 离心管中。
   16. 向柱子中加入 5 mL 磁性分离缓冲液，并用力推动柱芯，将磁性标记的细胞冲洗出来。
4. MDM 和 MDDC 分化的试剂准备
   1. 使用台盼蓝排除法配合细胞计数仪进行细胞计数，方法同步骤 1.2.17。
   2. 根据以下方法计算后续步骤所需的 CCM 或 FBS 体积：或计算对应细胞密度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的 CCM 体积（步骤 1.5.1），或计算对应细胞密度为每 0.9 mL FBS 中含 6 × 10⁶ 个细胞的 FBS 体积（步骤 1.6.3）。
      
   3. 盖上盖子，将离心管放入离心机，按步骤 1.2.13 的条件进行离心。移除并弃去上清液，不要扰动细胞沉淀。随后进行步骤 1.5（细胞接种）或步骤 1.6（细胞冻存）。
5. PBM 接种及向 MDM 和 MDDC 的分化
   1. 用移液器反复吹打 3 次，将细胞沉淀重悬于步骤 1.4.2 计算所得体积的 CCM 中（此处最终浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   2. 用血清移液器将拟用于分化为 MDM 和 MDDC 的细胞分别加入不同的圆锥形离心管中。
   3. 将分化因子加入含 PBM 的 CCM 中，并通过反复吹打充分混匀。分化因子的添加方式如下：
      1. 对于 MDDC：终浓度为 10 ng/mL 白细胞介素-4（IL-4）和 10 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
      2. 对于 MDM：终浓度为 10 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。
   4. 用移液器将加入分化因子的 CCM 细胞悬液加入 6 孔板中，每孔 3 mL（相当于每孔 3 × 10⁶ 个细胞，即 1 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   5. 将 6 孔板放入细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中，静置培养 6 天，期间不更换 CCM。
      注意：分化时间可在 5–8 天之间调整，具体取决于血沉棕黄层的本地可获得性和实验设计，前提是使用适当技术确定分化效率（参见讨论部分）。
6. PBM 冻存
   1. 用移液器加入预热的 FBS，将细胞沉淀重悬于冷冻保护液中（此处为 FBS 与二甲基亚砜 [DMSO；具细胞毒性] 按 9:1 [v/v] 比例混合）。考虑后续加入 10% DMSO（v/v），最终细胞浓度为 6 × 10⁶ 个细胞/mL。
   2. 在超净工作台中标记所需数量的冻存管（即记录日期、分离编号和细胞数量）。
   3. 向每支冻存管中加入 0.9 mL 纯 FBS 中的细胞悬液（此处为 0.9 mL FBS 中含 6 × 10⁶ 个细胞）。随后缓慢加入 0.1 mL DMSO，并通过翻转冻存管 3 次充分混匀悬液。
   4. 将冻存管转移至细胞冻存盒中，并立即置于 -80 °C 冰箱中保存 24 小时。
   5. 24 小时后，从 -80 °C 冰箱和冻存盒中取出冻存管，转移至适合细胞长期保存的液氮罐中。
7. PBM 复苏及向 MDM 和 MDDC 的分化
   1. 将所有所需试剂在水浴中加热至 37 °C（约 20–30 分钟）。
   2. 根据复苏细胞数量准备相应数量的 6 孔板（此处每 1.8 × 10⁷ 个细胞使用一块板，即 3 支冻存管）。在无菌条件下向每孔加入 2 mL CCM。将 6 孔板放入培养箱（5% CO₂，37 °C）中孵育 15 分钟，使 pH 值达到平衡。
   3. 从液氮罐中取出所需数量的冻存管，在 37 °C 水浴中轻轻摇动（1–2 分钟），确保细胞悬液均匀解冻。
   4. 将冻存管从水浴中取出，用消毒剂去污，注意避免消毒剂接触管盖和 O 型圈。
      
      注意：此后所有操作均需在无菌条件下进行。
   5. 根据待解冻冻存管数量准备相应数量的 15 mL 圆锥形离心管（此处为每管 6 × 10⁶ 个细胞）。向每管加入 9 mL 预热的 CCM。
   6. 缓慢地（逐滴）将冻存管内容物加入含 CCM 的离心管中。盖上盖子，对每管重复此操作，然后以 200 x g 离心 5 分钟（常规离心速度）。
   7. 弃去上清液，不要扰动沉淀。
   8. 用血清移液器反复吹打，将每管中的沉淀（含一支冻存管的细胞）重悬于 2 mL 预热的 CCM 中（细胞密度为 3 × 10⁶ 个细胞/mL）。
   9. 从每管中取重悬的细胞悬液，分别加入含 2 mL 预先配制 CCM 的 6 孔板的两个孔中（每孔 1 mL），使每孔细胞密度达到 3 × 10⁶ 个细胞/孔（相当于终浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL）。对所有其他离心管重复此操作。
   10. 按照第 1.5.3 节所述进行分化处理。
   11. 将 6 孔板放入细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中，静置培养 6 天，期间不更换 CCM。

2. 人肺泡上皮组织的三重细胞共培养模型

注意：本节提供与12孔板小室相对应的体积和细胞数量的操作说明。图1总结了模型构建的建议时间线。

1. 上皮细胞（A549细胞系）接种
   1. 根据供应商（ATTC）提供的建议培养上皮细胞。简言之，在细胞融合度达到约80%时，使用CCM培养基对细胞进行传代（每周约2至3次）。
      注意：在共培养模型构建前，需将 A549 细胞传代培养至少四次，使用第 5 至 25 代范围内的 A549 细胞。
   2. 将1.5 mL预热的CCM用移液器加入12孔板中（孔的数量对应所需模型的数量）。
   3. 使用无菌镊子将单个12孔细胞培养小室放入12孔板的孔中。
   4. 根据传代培养方案从培养瓶中消化细胞（即使用细胞消化剂，并参照步骤1.2.13通过离心去除消化剂）。用适量的CCM重悬细胞，使其终浓度对应A549细胞的所需浓度（此处为50 × 10⁶ cells/mL）⁴ 细胞/mL；每个插入物加入0.5 mL细胞悬液，即25 × 10⁴ 细胞/孔，对应接种密度为 27.8 x 10⁴ 细胞/厘米²²).
   5. 移取0.5 mL细胞悬液（即25 x 10⁴ 使用1 mL移液器将细胞/插入物加入插入式培养小室的顶端。
   6. 用培养皿盖盖好，放入细胞培养箱中（37 °C，5 % CO₂）₂4天。
      注意：定期在相差显微镜下检查A549细胞的融合度。
2. MDDC 接种
   1. 吸弃含有未贴壁细胞的6孔板中的完全培养基（CCM）。
   2. 向每个孔中加入 1 mL 新鲜预热的 CCM。
   3. 使用细胞刮刀将贴壁的MDDC从每个孔中刮下，用现有的1 mL CCM轻柔冲洗孔壁3次，并将洗液合并至一个锥形离心管中。
   4. 使用细胞计数器，通过台盼蓝排染法对细胞进行计数，取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝溶液混合后计数。
   5. 离心细胞悬液，操作同步骤 1.2.13。
   6. 计算重悬所需的CCM体积（公式5）：
      所需MDDC密度 = 42 x 10⁴ 细胞/mL；每个插入物需要 6.3 x 10⁴ 细胞，相当于接种细胞密度为 7 x 10⁴ 细胞/厘米² （此处，将150 µL加入0.9 cm）² 在步骤 2.2.10 中。
      用于细胞重悬的CCM体积（Vm；公式5）：
      
   7. 轻轻吸出并弃去12孔板上室中含A549细胞的培养小室内的CCM。
   8. 使用无菌镊子将含有A549细胞的插入式培养插件倒置放入无菌培养皿中。准备一支50 mL锥形离心管，加入PBS，并预先润湿细胞刮刀。
   9. 用刮棒从插入式培养小室的基底表面（即倒置时的上部）刮取已穿过小室孔隙生长的A549细胞。
      注意：在刮取各个样品之间，用预装在离心管中的 PBS 冲洗刮刀，并在整个操作过程中保持刮刀湿润。
   10. 离心后（步骤 2.2.5），吸除并弃去上清液，然后将 MDDC 沉淀重悬于计算量的 CCM 中（步骤 2.2.6），吹打混匀 3 次。
   11. 用移液器将150 µL细胞悬液加入每个小室的顶部，确保小室的整个基底表面均匀覆盖液体且无气泡。
   12. 用盖子盖好培养皿，放入细胞培养箱中孵育 70 分钟。吸除细胞培养板（插入式培养插件最初放置于此）中的 CCM，弃入生物危害液体废物容器中，并用移液器向每孔加入 1.5 mL 新鲜 CCM。盖上培养板盖子，放回细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养。₂).
       注意：请勿超过上述时间，以免细胞干燥。
   13. 孵育结束后，用灭菌镊子小心夹住每个插入物，将其正常放置于含有CCM的培养板中。盖上培养板盖子，并放回细胞培养箱（37°C，5% CO₂）中继续培养。₂).
3. 巨噬细胞（MDM）接种
   1. 取含有预分化MDMs的6孔板，从细胞培养箱转移至超净工作台。
   2. 吸弃6孔板中含未贴壁MDM的CCM，每孔加入1 mL新鲜预热的CCM。
   3. 使用细胞刮棒，轻轻将贴壁的MDM从各个孔中刮下（操作步骤同2.2.3中MDDC的处理方法）。
   4. 将10 µL台盼蓝加入孔板或离心管中，再加入10 µL MDM悬液，使最终稀释比例为1:1（v/v）。按照相应的计数方案对MDM数量进行计数。
   5. 按照步骤1.2.13的方法离心细胞悬液。
   6. 计算所需体积（公式 6）：
      所需 MDM 密度 = 2.5 x 10⁴ 个/mL，在CCM中（此处每个插入物需要1.25 × 10⁴ 0.5 mL CCM 中的细胞，相当于接种细胞密度为 1.4 × 10⁴ 细胞/厘米²).
       (6)
   7. 离心后，吸除并弃去上清液，将MDM沉淀重悬于计算量的CCM中（步骤2.3.6），上下吹打3次。
   8. 用1 mL移液器将0.5 mL MDM悬液（步骤2.3.7中制备）沿细胞培养小室壁缓慢加入，加入位置应避开A549细胞和MDDC的直接表面（不要直接加在上皮细胞上）。盖上培养板盖子，置于细胞培养箱中（37 °C，5 % CO₂）培养。₂24小时。
4. 共培养模型向气液界面（ALI）的转移
   1. 在细胞培养箱中完成组装模型24小时（±2小时）的孵育后，吸出并弃去细胞培养小室的顶侧和底侧以及孔板中的完全培养基。
   2. 使用无菌镊子将小室从孔板中取出，用1 mL移液器向每个孔中加入0.6 mL新鲜预热的CCM。切勿将CCM加入小室的顶端。
   3. 用盖子盖住培养板，置于细胞培养箱中（37 °C，5 % CO₂）₂) 置于24小时后继续使用。

3. 暴露于选定的阳性对照（已知可诱导促炎反应的刺激物）

注意：通过将共培养模型暴露于已知的促炎刺激物内毒素脂多糖（LPS）⁷ 和促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）⁷，以说明该模型的反应性。此外，通过暴露于去垢剂（Triton X-100）以确认乳酸脱氢酶（LDH）检测的敏感性。

1. 配制阳性对照溶液：LPS 储存液（1 mg/mL，溶于蒸馏水）、TNF-α 储存液（100 μg/mL，溶于蒸馏水）和 Triton-X 100（2% [v/v]，溶于 PBS）。
2. 在气液界面（ALI）条件下共培养模型孵育 24 小时后，吸除并弃去基底室中的上清液。使用灭菌镊子将每个插入式培养小室从孔中取出，并用移液器向每个孔中加入 0.6 mL 新鲜预热的完全培养基（CCM）。
3. 在锥形离心管中用完全培养基（CCM）稀释储存液，分别配制各阳性对照工作液：1 μg/mL LPS、1 μg/mL TNF-α 和 0.2% Triton-X 100。所需体积根据待测插入式培养小室的数量确定（此处为每小室 100 μL）。通过移液器上下吹打 3 次，充分混匀各溶液。
4. 将每种阳性对照溶液各 100 μL 缓慢沿细胞培养插入式小室的管壁加入。盖上培养板盖，置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育 24 小时。孵育结束后，用镊子夹住各个插入式小室，吸除并弃去其顶端侧的液体。
5. 收集基底室中的完全培养基（CCM），并分装保存：1）于 4 °C 保存，用于后续乳酸脱氢酶（LDH）分析，以评估细胞膜破裂介导的细胞毒性；和/或 2）于 -80 °C 保存，用于后续通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析蛋白释放情况。按照试剂盒供应商的说明进行检测操作。
6. 移除完全培养基（CCM）后，用 PBS 洗涤插入式培养小室 3 次，并在 4% [w/v] 多聚甲醛（溶于 PBS）中室温固定 15 分钟，确保插入式小室的两侧均被多聚甲醛（PFA）溶液充分覆盖。随后用 PBS 洗涤 3 次以去除残留的 PFA。将样品浸没于 PBS 中，4 °C 保存，用于后续免疫染色分析（该方法的示例此前已有报道¹⁷）。

结果

由肺泡上皮细胞和免疫细胞组成的人肺共培养模型，使用新鲜或冻存的MDDC和MDM前体细胞（此处指人外周血来源的单核细胞）构建。如图1所示，在单核细胞分离或解冻后的第3天接种A549细胞。经过6天的分化后，分化的MDM呈圆形，而MDDC则呈现更长的形态，并可见突起结构。这些细胞还倾向于形成聚集体，尤其是由新鲜单核细胞分化时更为明显（图2、图3）。上皮细胞在膜插件上生长3天后形成致密的细胞层（图4），此时进行共培养体系的组装。共培养体系组装24小时后，再在气液界面（ALI）条件下继续培养24小时，随后准备进行暴露处理。

采用伪气液界面（pseudo-ALI）方法，如先前所述²⁹，研究了三维细胞培养模型在已知促炎刺激物作用下的反应性。将促炎刺激物LPS和TNF-α以少量（100 μL）添加至暴露于空气的细胞模型的顶侧表面。同时，通过乳酸脱氢酶（LDH）检测评估膜破裂缺失情况，以衡量细胞毒性。在基底室的条件培养基（CCM）中，经膜破裂阳性对照物——去污剂Triton-X 100处理后，观察到LDH释放量显著增加（图5）。这些结果证明该模型对细胞毒性物质具有响应性，而在顶侧施加TNF-α或LPS刺激后，未观察到LDH释放增加。

使用新鲜或先前冷冻的PBMs制备的样本中乳酸脱氢酶（LDH）测定值存在差异，其可能原因与样本储存有关。来自新鲜PBMs的样本在-80 °C下储存时间较长，因此LDH酶的活性可能下降。值得注意的是，LDH在CCM中仅可稳定保存最多4天，因此建议在收集上清液后最迟2天内完成检测。或者，也可在收集后立即冷冻上清液。然而，需注意冷冻可能导致LDH酶活性降低。

通过ELISA定量检测基础侧CCM中促炎介质（此处为TNF-α以及白细胞介素6 [IL-6] 和8 [IL-8]）的分泌。与相应的未处理细胞相比，经LPS或TNF-α处理的样本中，IL-6和IL-8的释放量均显著升高，差异具有统计学意义（p < 0.05，单因素方差分析），且该结果在来源于PBMs的两种细胞共培养模型中均观察到（图6）。尽管在新鲜PBMs构建的共培养体系中，基础侧CCM内所有检测细胞因子的浓度（pg/mL）均较高，但两种共培养体系之间以及共培养与单层培养之间的差异均无统计学意义（p > 0.05）（图6）。为验证共培养模型相较于二维上皮细胞单层培养的优势，还对A549单层培养细胞进行了LPS或TNF-α刺激。结果显示，与两种共培养模型相比，A549单层培养细胞释放的所有被检测介质水平均较低；但两者之间的差异无统计学意义（p > 0.05，单因素方差分析）。

通过共聚焦激光扫描显微镜（LSM）评估了三维人肺泡上皮组织屏障的细胞形态。为了观察各模型的组成，共培养模型中的巨噬细胞（MDMs）使用成熟巨噬细胞标志物25F9进行染色，MDDCs则使用CD83染色，CD83是活化树突状细胞的重要标志物³⁰。在细胞形态方面，使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）来源的MDMs和MDDCs构建的共培养模型与使用冻存后解冻的PBMs来源细胞构建的模型之间未观察到差异。在经LPS和TNF-α暴露的共培养体系中（无论免疫细胞为新鲜或冻存），LSM图像显示上皮层出现破坏，而在未处理的细胞中则未见此现象（图7，图8）。

图1：实验方案的示意图时间线。展示三维共培养模型的制备、组装及应用（暴露于待测物质）。ALI = 气液界面，MDDCs = 单核细胞来源的树突状细胞，MDMs = 单核细胞来源的巨噬细胞，PBMs = 外周血单核细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：由新鲜外周血单个核细胞（PBMs）分化而来的MDMs和MDDCs。 由新鲜外周血单个核细胞分化6天后的相位差显微镜图像，分别为（A）巨噬细胞（MDMs）和（B）树突状细胞（MDDCs）。MDMs呈圆形，而MDDCs常以聚集体形式出现。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：由冻存的PBMs分化而来的MDMs和MDDCs。 解冻后6天，由PBMs分化得到的（A）MDMs和（B）MDDCs的相差显微镜图像。MDMs呈圆形，但也可观察到部分伸长的细胞。MDDCs亦呈圆形，并带有突起。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：膜插件上上皮细胞的生长。接种后第 4 天，在膜插件上融合生长的 A549 细胞的相差显微镜图像，形成致密的细胞层。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：通过基于细胞膜破裂的（LDH）检测法测定的细胞毒性结果。数据以未处理细胞的倍数增加表示（均值 ± 标准差，n = 3；星号表示与未处理细胞相比具有统计学显著性增加，**p < 0.01，****p < 0.0001）。绿色模型代表来自新鲜PBMs的MDMs和MDDCs，紫色模型代表来自解冻PBMs构建的细胞模型。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：共培养与单培养中的促炎反应。在 LPS 或 TNF-α 刺激 24 小时后，共培养体系中促炎介质（TNF-α、IL-6 和 IL-8）的释放情况。数据以未处理细胞为对照表示（均值 ± 标准差，n = 3，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。绿色模型代表使用新鲜 PBMs 分化得到的 MDMs 和 MDDCs，紫色模型代表使用冻存后 PBMs 组装的模型，灰色代表 A549 单培养。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：由新鲜免疫细胞组成的共培养体系的形态学特征。 使用新鲜外周血单个核细胞（PBMs）来源的单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）和单核细胞来源树突状细胞（MDDCs）构建的共培养模型顶面和底面的激光扫描显微镜（LSM）图像，以及模型顶面的xz投影图像。青色代表细胞核（DAPI染色），品红色代表细胞骨架（鬼笔环肽-罗丹明染色），白色代表MDMs（25F9标记），绿色代表MDDCs（CD83标记）。白色箭头指示MDM，绿色箭头指示MDDC。请点击此处查看该图的放大版本。

图 8：由冻存免疫细胞组成的共培养体系的形态学特征。 共培养模型顶面的激光扫描显微镜（LSM）图像及其对应的xz投影，以及使用解冻后外周血单个核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）和树突状细胞（MDDCs）构建模型的底面图像。青色代表细胞核（DAPI染色），品红色代表细胞骨架（鬼笔环肽-罗丹明标记），白色代表MDMs（25F9标记），绿色代表MDDCs（CD83标记）。白色箭头指示MDM，绿色箭头指示MDDC。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

新型材料（包括化学品和药物）的不断涌现，逐渐增加了对可预测的体外模型的需求。为了遵循动物实验的“替代、减少和优化”三项原则³²，体外细胞模型已成为在替代和减少动物使用方面阐明药物或材料作用机制的有力工具^8,9,10,11。本文介绍了一种利用新鲜分离或从先前冷冻的单核细胞解冻后获得的免疫细胞组装多细胞模型的详细方案。同时描述了该模型在气液界面（ALI）条件下的培养方法。最后，本方案展示了对促炎刺激物暴露的一个示例，并比较了包含新鲜单核细胞与冷冻单核细胞的两种模型的反应差异。

已有多种研究证实并论证了在气液界面（ALI）条件下培养和暴露的模型相较于传统的浸没式暴露模型所增加的复杂性具有更高的价值^7,22,31。与单一种类的上皮细胞培养相比，共培养体系中观察到更强的促炎反应，这一结果与先前的研究一致。该研究采用了本文所述的共培养模型（以LPS刺激），结果显示TNF和IL1B基因表达水平均高于相应的A549单层培养模型⁷。另一方面，两种共培养模型在促炎介质释放水平上的个体差异均大于A549单层培养。这一现象可通过生物学重复中使用了来自不同供体（血沉棕黄层）的免疫细胞来解释（即每次重复使用一位供体），这一点此前已有报道⁷。如有需要，可通过以下方式减少重复实验间的变异：1）使用来自同一供体的冻存外周血单个核细胞（PBMs），或 2）在冻存前将来自不同供体的PBMs混合成细胞池，随后在每次重复实验中使用同一细胞池。同时建议增加生物学重复次数。

细胞冻存技术可被视为一个关键步骤，但其同时也是实验室中用于保存细胞以进行表型和功能分析的常规操作。多项研究已表明，冻存外周血单个核细胞（PBMs）的质量对其存活至关重要，而合适的冻存技术是后续使用这些细胞进行实验成功的关键^28,32。通过冻存PBMs可对实验方案进行调整，从而在实验设计上提供更大的灵活性，因为血沉棕黄层（buffy coats）的可获得性通常有限。与新鲜分离的PBMs相比，使用冻存PBMs（分装于多个冻存管中）的另一优势在于，即使在冻存1年后仍可用于后续实验。如果实验中需要或要求控制供体间变异这一参数，则使用冻存样本可显著降低供体间差异带来的潜在问题。

一项在长达13个月后开展的实验室间比较结果显示，外周血单个核细胞（PBMs）在液氮罐中妥善保存后，可在较长时间内使用，且对细胞活力或细胞回收率无任何影响³³。若在实验前对细胞活力和细胞应答能力进行严格验证，则更长的保存时间（超过1年）也可能实现。此外，液氮罐内的温度必须始终保持稳定。研究发现，影响冻存PBMs活力的主要因素是二甲基亚砜（DMSO）浓度，其最佳浓度范围为10%–20%（v/v）²⁸。为最大限度减少冷冻可能带来的有害影响，通常会在冻存液中添加不同来源的蛋白质，如胎牛血清（FBS）或牛血清白蛋白（BSA），作为天然保护成分，以提高细胞存活率，其浓度范围较广，从40%到100%不等³⁴。

由于DMSO具有较高的细胞毒性，建议首先将外周血单个核细胞（PBMs）分散于胎牛血清（FBS）中，然后再将DMSO加入已分散在FBS中的PBMs。值得注意的是，尽管较高的FBS浓度（>40%）并未显示出对细胞活力的进一步改善，但同时也不会对细胞造成损害²⁸。尽管如此，冷冻保存单核细胞仍是一种可行的策略，可用于应对血沉棕黄层供应有限的问题。然而，若实验需要使用新鲜PBMs来源的单核细胞衍生树突状细胞（MDDCs）和单核细胞衍生巨噬细胞（MDMs），则可在分离后5–8天进行免疫细胞的分化与使用^{7,16,17,35,36,37}。如果实验设计允许，建议MDDCs和MDMs均至少进行6天的分化。然而，同一实验中不同重复之间的操作一致性，以及对其特异性表面标志物表达的常规检测至关重要。此外，应在分化完成后定期检测细胞对促炎刺激（如LPS）的反应能力。

已有多项研究在气液界面（ALI）条件下使用A549细胞系，既可作为单一代谢培养，也可与其他细胞类型（如巨噬细胞、树突状细胞或成纤维细胞）共同构建三维共培养模型。^22,24,29,38. 利用该三维共培养模型，可检测细胞毒性、氧化应激或促炎效应 （纳米）材料已进行了长达72小时的研究 h^{1,17,21,24,29}该模型与体内组织的相似性此前已通过模型的共聚焦激光扫描成像进行过研究¹⁶在构建模型时，需要同时考虑细胞增殖（可能影响本模型中的A549细胞）以及原代非增殖性免疫细胞（此处为MDDCs和MDMs）的功能表现。还需注意，并非所有CD14阳性单核细胞均能分化为MDDCs和MDMs，且这些细胞可能以贴壁和悬浮两种形式存在。鉴于共培养体系的特性（此处要求两种细胞均需贴附于已形成的上皮层），建议仅使用两种免疫细胞中的贴壁亚群。此外，常规对单核细胞、MDDC和MDM在LPS刺激下的单培养反应性以及特定表面标志物（CD14、CD163、CD86、CD93或CD206，数据未显示）表达的分析结果表明，6天和7天的分化时间是最佳时间点。

尽管人体肺部肺泡上皮细胞的实际数量约为 ~160,000 个细胞/cm²，但在插入式培养 9 天后，模型中计数的 A549 细胞数量约为 ~1,000,000 个细胞/cm^216,18。因此，需要考虑该体外模型的局限性。首先，上皮细胞的密度是根据其在生长膜上形成融合单层的能力确定的。还需要指出的是，A549 细胞代表一种立方形的 II 型肺泡上皮细胞，与扁平铺展的 I 型肺泡上皮细胞不同。另一方面，本实验方案中免疫细胞所需数量是基于文献报道确定的，并以细胞数/表面积的形式呈现^39,40,41。该模型中 MDDC 的细胞密度为 400 个细胞/mm²（4 个细胞/cm²）¹⁶，与体内研究报道的稳态密度 500–750 个细胞/mm²（5–7 个细胞/cm²）相当³⁹。该模型中 MDM 的密度也处于人体肺泡区域体内情况的相同范围内⁴⁰。

在顶端（MDMs 所在位置）和基底端（即树突状细胞所在位置）均观察到成熟巨噬细胞标志物（25F9）的染色。免疫细胞通过膜插件孔隙发生转位是可能的，使用该模型也已观察到这一现象¹⁶，这或许可以解释染色强度的差异。然而，另一种可能的解释是，成熟巨噬细胞标志物也可能在树突状细胞上表达，但其表达具有高度供体特异性⁴²。此外，25F9 在 MDMs 中的表达强度明显更高（图 7、图 8）。两种促炎刺激物（LPS 和 TNF-α）均影响了两种共培养体系中肺上皮屏障的完整性（图 7、图 8）。这与既往研究结果一致^43,44，表明促炎性细胞因子和细菌产物可破坏上皮屏障的完整性。

先前已建立并表征了人肺泡上皮的三维多细胞模型¹⁷，该模型已被证明是一种强大且有用的工具，可用于体外评估生物学反应（即急性促炎反应、氧化应激反应、颗粒物分布及细胞间通讯）^21,24,25,45。实验结果证实，共培养模型对促炎刺激物（此处为LPS和TNF-α）具有响应性。当使用来自新鲜外周血单核细胞（PBMs）的免疫细胞时，其反应略有增强；然而，使用新鲜与冻存解冻后PBMs的共培养模型之间并无统计学上的显著差异。此外，在相同气液界面（ALI）条件下培养时，两种共培养模型的促炎反应均高于单层上皮细胞培养。综上所述，本方案描述了一种利用新鲜或冻存解冻后的PBMs分化为MDMs和MDDCs，构建三维人肺泡上皮组织共培养模型的方法。研究表明，这两种模型均对促炎刺激物具有高度响应性，因此可作为潜在危害和毒性评估的有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基准微孔板读数仪	无需特定型号，例如 BioRad，Cressier，瑞士
细胞培养箱	无需特定型号
细胞冻存容器（例如 Mr. Frosty）	无需特定型号
离心机	无需特定型号
共聚焦激光扫描显微镜	无需特定型号，例如	Zeiss LSM 710 meta
血细胞计数板或自动细胞计数仪	无需特定型号
II 级层流生物安全柜	无需特定型号
MultiStand Macs（Macs 细胞分离器）	Miltenyi，德国	130-042-303
pH 计	无需特定型号
倒置相差光学显微镜	无需特定型号
移液器助吸器、移液枪（不同体积）	无需特定型号
剪刀	无需特定型号
真空泵	无需特定型号
水浴锅	无需特定型号
一次性小型设备/玻璃器皿		货号
15 mL 和 50 mL 锥形离心管	无需特定型号
6 孔和 12 孔细胞培养板，平底，低蒸发盖，无菌	Falcon，瑞士	353046 和 353043
细胞培养小室，透明 PET 膜，12 孔，3 μm 孔径	Falcon，瑞士	353181
细胞刮刀	无需特定型号，例如 VWR，瑞士	353085
冻存管	无需特定型号
经高压灭菌的玻璃培养皿	无需特定型号
LS 柱	Miltenyi，德国	130-042-401
用于真空过滤的无菌过滤杯，0.2 μm 孔径	无需特定型号，例如 VWR，瑞士	10040-446
与过滤杯兼容的无菌实验室瓶（最小 100 mL）	无需特定型号
无菌移液管	无需特定型号
化学试剂
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich，瑞士	A7030-100g
CD14+ MicroBeads 人源磁珠	Miltenyi，德国	130-097-052
解离试剂胰蛋白酶-EDTA，0.05%，含酚红	Gibco，瑞士	25300054
密度梯度介质 Lymphoprep	Alere Technologies AS，挪威	1114547
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma Aldrich，瑞士	D2438
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich，瑞士	E6758-100g
胎牛血清（热灭活）	Gibco，瑞士	10270-106
人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），优质级	Miltenyi，德国	130-093-864
人白细胞介素 4（IL-4），优质级	Miltenyi，德国	130-095-373
人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），优质级	Miltenyi，德国	130-096-485
L-谷氨酰胺	Gibco，瑞士	25030-024
来自大肠杆菌的脂多糖（LPS）	Sigma-Aldrich，瑞士	4524-5mg
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich，瑞士	158127
青霉素-链霉素	Gibco，瑞士	15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco，瑞士	10010-015
罗斯韦尔帕克纪念研究所-1640 培养基（RPMI）	Gibco，瑞士	42401-018
曲拉通 X-100	Sigma-Aldrich，瑞士	T8787
台盼蓝溶液（0.4%）	Sigma Aldrich，瑞士
肿瘤坏死因子 α（TNF-α）	Immunotools	11343015
用于细胞毒性及（前）炎症反应检测的检测试剂盒
细胞毒性检测试剂盒（LDH）	Roche，瑞士	11644793001
人 IL-6 DuoSet ELISA	R&D，Biotechne，瑞士	DY206
人 IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA	R&D，Biotechne，瑞士	DY208
免疫染色
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），浓度 2 μg/mL	Sigma-Aldrich，瑞士	10236276001
山羊抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 647 标记，浓度 20 μg/mL	Abcam，英国	ab150115
山羊抗兔 IgG 抗体（H+L）Dylight 488 标记，浓度 10 μg/mL	Agrisera，瑞典	AS09 633
成熟巨噬细胞标志物单克隆抗体，浓度 50 μg/mL	eBioScience，Thermo Fischer，瑞士	14-0115-82
罗丹明标记鬼笔环肽，浓度 0.264 µM	Molecular Probes，Life Technologies，瑞士	R415
重组抗 CD83 抗体，1:50 稀释	Abcam，英国	ab244204