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使用 iDISCO+ 和光片荧光显微镜对椎体淋巴管系统及其引流进行三维成像

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DOI：

10.3791/61099

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2020年5月22日

 ,  , 
1Université Pierre et Marie Curie Paris, Sorbonne Université, Institut du Cerveau et de la Moelle Epinière, 2Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Department of Neurology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种将组织透明化技术与光片荧光显微镜（LSFM）相结合的实验方案，用于获取脑脊液及脊髓硬膜外液引流相关的淋巴管和淋巴结（LNs）的三维、细胞分辨率图像。

摘要

与中枢神经系统（CNS）相关的淋巴系统包括围绕大脑、脊髓及其相关淋巴结（LNs）的淋巴管网络。CNS相关淋巴系统参与将脑脊液（CSF）中的大分子物质和脑膜免疫细胞引流至CNS引流淋巴结，从而调控CNS组织内的废物清除和免疫监视功能。本文介绍一种新颖的方法，可在保持淋巴回路在周围组织中完整性的前提下，获得CNS相关淋巴管的三维（3D）和细胞分辨率图像。该方法采用iDISCO+技术，对脱钙并透明化处理的整装脊柱标本进行淋巴管免疫标记，随后利用光片荧光显微镜（LSFM）成像。该技术揭示了连接脊髓周围脑膜腔与硬膜外腔至椎体外淋巴管的淋巴网络三维结构。文中提供了分子示踪剂经小脑延髓池注入脑脊液或注入胸腰段脊髓实质后，其引流通路的三维图像。iDISCO+/LSFM方法为研究神经血管生物学、神经免疫学、脑与脊柱肿瘤以及椎骨和关节生物学中CNS相关淋巴系统的结构与功能带来了前所未有的机遇。

引言

中枢神经系统（CNS）被脑脊液（CSF）以及覆盖其上的脑膜、硬膜外组织和骨骼所包围。总体而言，脑脊液为柔软的脑和脊髓提供物理保护。脑脊液主要由脉络丛和脑膜（即软脑膜、蛛网膜和硬脑膜）分泌。脑脊液-脑膜复合体还在中枢神经系统组织与机体其他部分之间建立起功能性界面，从而参与维持中枢神经系统的稳态。首先，脑脊液通过中枢神经系统的动脉周围间隙渗入实质，并通过类淋巴系统（胶质-淋巴系统）与组织间液（ISF）1进行动态交换，该系统由血管周围间隙以及围绕中枢神经系统血管的星形胶质细胞终足膜构成2,3,4。根据类淋巴模型，代谢废物和多余液体最终通过血管壁内血管周围引流直接从脑实质排向体循环3，同时也经由静脉周围间隙排入脑脊液，并通过脑引流淋巴管排出2,4。脑脊液的主要流出途径是淋巴系统，即通过筛板及相关的颅外淋巴管5,6,7，以及汇集至脑引流淋巴结的脑膜淋巴管8,9,10,11,12（图1）。颅内蛛网膜绒毛在脑脊液引流中也发挥着重要但次要的作用，其穿透脑膜静脉窦的隐窝13。

通过向中枢神经系统（CNS）或脑脊液（CSF）注射有色/荧光示踪剂，随后在注射后不同时间点对示踪剂在中枢神经系统内及全身器官和组织中的分布模式进行成像，研究人员已广泛采用此类实验方法对脑脊液引流通路进行了深入研究13。长期以来，人们认为脑脊液的流出完全且直接通过投射入硬脑膜静脉窦的蛛网膜绒毛进入血液循环系统13。然而，近期利用近红外（NIR）动态成像技术对小鼠脑脊液内注射示踪剂的运输过程进行研究后发现，脑脊液的引流主要由淋巴管系统完成9,10。引流脑脊液的淋巴管最终通过右锁骨下静脉将淋巴液回输至血液。其他补充性研究方法已检测到脑脊液内注射示踪剂存在颅外6,7,13和颅内9,10,11,12两种淋巴引流出口，提示脑脊液通过两条淋巴通路被吸收：一条位于颅骨和脊柱外部，另一条位于其内部。大部分脑脊液的引流快速通过位于颅外鼻黏膜的头侧淋巴管进行，示踪剂经筛骨筛板通道排出3,6,13；尾侧引流则通过尚未完全明确的背外侧通路，经腰骶椎骨外排出7,14。此外，在颅骨脑膜中，硬脑膜的淋巴毛细血管可直接吸收脑脊液及脑膜免疫细胞，并将其输送至穿过颅骨并与中枢神经系统引流淋巴结（LNs）相连的硬脑膜淋巴集合管12,14。这些脑膜淋巴管在中枢神经系统的病理生理过程中发挥重要作用，因为脑膜淋巴系统会随衰老发生改变，并影响包括神经退行性疾病、神经炎症和脑肿瘤在内的多种神经系统疾病的病程进展15,16,17。因此，与中枢神经系统相关的淋巴管系统（即引流脑脊液的硬脑膜及外周淋巴管）可能成为治疗人类中枢神经系统疾病的一个有前景的新靶点。

采用免疫组织化学与高分辨率磁共振成像的多项研究一致表明，脑膜淋巴管系统同样存在于灵长类动物中，包括普通狨猴和人类7,11,13。此外，脑膜淋巴管不仅局限于颅骨内，还沿椎管延伸至脊神经节和脊膜支表面13,18。最近已实现对椎管淋巴管进行三维（3D）成像，完整保留了标记的椎体和脊髓样本的整体解剖结构，包括覆盖的骨骼、肌肉、韧带以及邻近的内脏组织14。研究采用iDISCO+技术流程19,20，对整段脱钙并透明化处理的椎柱样本进行免疫标记，所用抗体特异性靶向淋巴管的膜受体LYVE121或转录因子PROX122。随后利用光片荧光显微镜（LSFM）和Imaris软件进行图像采集与分析。LSFM通过轴向限制照明实现对大样本的快速、微创三维成像，从而显著降低光漂白和光毒性23。

iDISCO+/LSFM 方法能够表征硬脑膜和硬膜外淋巴管的不同层次，并揭示该血管系统与椎外淋巴回路及脊柱邻近淋巴结的连接关系。本研究将该方案应用于先前注射了荧光示踪剂的组织，以展示椎管内的引流情况。本文详细介绍了利用 iDISCO+/LSFM 技术成像椎体淋巴血管系统的方法，并阐述了其在脑脊液和硬膜外液体引流研究中的重要意义。

方案

本研究中使用的所有体内实验程序均符合欧洲实验动物使用指南（L358-86/609EEC）中关于动物试验与研究的相关伦理规定。该研究已获得法国国家健康与医学研究院（INSERM）伦理委员会的伦理批准（编号°2016110111126651）以及ICM（脑与脊髓研究所）机构动物护理与使用委员会

1. 准备

  1. 准备以下手术解剖工具：手术刀（1）、显微镊（2）、镊子（1）、解剖剪和Michel缝合夹。准备26 G针头（0.45 mm × 13 mm）、1 mL注射器和10 µL微量注射器。
  2. 使用玻璃微电极拉制仪，以67.5 °C单步程序拉制微毛细管。每次注射准备两根微毛细管。
  3. 准备用于成像淋巴引流的试剂（表1）：卵白蛋白Alexa Fluor 555偶联物（OVA-A555，2 mg/mL溶于1×磷酸盐缓冲液[PBS]）和抗LYVE1抗体（1 mg/mL溶于1× PBS）。
  4. 准备用于iDISCO+的抗体（表1）。一抗使用抗LYVE1兔多克隆抗体（1:1,600）和抗PROX1山羊多克隆IgG抗体（1:2,000）；二抗使用Alexa Fluor驴抗兔-568、驴抗兔-647和驴抗山羊-647（均为1:2,000）。

2. 经小脑延髓池（ICM）和胸腰段（ThLb）注射的手术操作

  1. 手术前动物准备
    1. 使用8–12周龄的成年雄性和雌性C57BL6/J小鼠。
    2. 在手术前15分钟，按0.1 mg/kg剂量通过腹腔注射（IP）给予用0.9%氯化钠溶液稀释的0.015 mg/mL丁丙诺啡溶液。
    3. 在诱导箱中使用2–3%异氟烷气体对小鼠进行麻醉。
  2. 麻醉后动物的示踪剂注射准备
    1. 将麻醉后的小鼠及其加热垫放置于立体定位仪上。使用耳杆固定小鼠头部，并使身体与头部呈约135°角，或使用脊髓适配器在胸腰段椎体水平（Th12-L1）固定脊髓。用镊子夹住尾巴或足爪以检查麻醉效果。
    2. 腹腔注射200 µL 0.9%氯化钠溶液以维持小鼠水合状态。
    3. 使用手术刀片在枕部向颈部区域做皮肤切口，用于脑池内注射（ICM）；或在胸腰段椎体水平（Th10-L3）做切口，用于胸腰段脊髓实质内注射。
  3. 示踪剂注射
    1. 清除覆盖颈部和脊柱的颈旁肌和椎旁肌，以暴露硬脑膜表面，即脑膜的最外层。
    2. 使用26 G针头小心穿刺硬脑膜中央区域及其下方的蛛网膜。
    3. 微毛细管植入
      1. 剪取2 mm玻璃毛细管尖端（见步骤1.2），然后使用连接至套管并连于10 µL注射器的微毛细管吸取2−8 µL OVA-A555或LYVE1抗体。
      2. 将微毛细管以30°角插入硬脑膜中线区域进行脑池内注射，或以10°角插入进行胸腰段脊髓注射，并推进至硬脑膜下方1.5 mm处。
        注：仅穿刺韧带，不进行椎板切除术。
      3. 加入10 µL外科胶水封闭毛细管周围的切口，并等待其干燥。
    4. 以1 µL/min速度缓慢注射荧光示踪剂。注射完成后，保持毛细管原位1分钟。随后撤出微毛细管，并使用外科胶水封闭注射孔。
  4. 注射后，使用缝合夹闭合皮肤切口。将小鼠从立体定位仪上移除，并置于37 °C的术后保温舱内，直至其恢复意识。

3. 灌注与组织解剖

  1. 在脑脊液示踪剂注射后15分钟或45分钟，腹腔注射致死剂量（100 µL）的戊巴比妥钠。通过夹捏尾巴或足掌来确认无反射反应。
  2. 使用解剖剪从腹部下部向胸腔方向剪开皮肤并切开腹膜层。用剪刀打开胸腔以暴露心脏。
  3. 将26 G针头插入心脏左心室，并以2 mL/min的速度开始灌注20 mL冰冻的含4%多聚甲醛（PFA）的1x PBS溶液。用剪刀迅速剪开右心房，以释放灌注液流。
  4. 用镊子完全去除皮肤，并用剪刀剪除四肢。移除所有内脏器官，但需小心保持淋巴结（LN）完整。
    注意：下颌淋巴结位于浅表，因此在剪除皮肤时应注意避免将其一并移除。深颈部淋巴结（dcLN）位于气管两侧，紧邻颈内静脉的侧面，并靠近胸锁乳突肌。
  5. 剪断肋骨，将包含脊髓的椎体从颈椎段至腰椎段整体取出。
  6. 将解剖所得组织置于含有冰冻的4%多聚甲醛（PFA）1x PBS溶液的50 mL离心管中，于4 °C下固定过夜（约18小时）。随后用50 mL 1x PBS溶液清洗固定组织3次，每次5分钟。

4. 脊柱节段的荧光大体显微成像

  1. 将样本置于配备相机的荧光体视变倍显微镜下（材料表），对样本进行整体观察或对特定区域进行放大观察。

5. 全组织免疫染色的样品制备

  1. 使用切片刀，在枕骨和颈椎水平横向切割头颅与脊柱。
    注意：此解剖步骤可将头颅和颈椎区域从脊柱其余部分分离出来。
  2. 使用切片刀，将脊柱的颈椎、胸腰段和骶段横向切割为每段包含 2−4 节椎骨的节段，每段长约 0.5 cm。
  3. 按照从脊柱轴分离的顺序，沿颈椎和胸段全长逐一分离各节段。将每个样本保存于含有 2 mL 1×PBS 的离心管中。

6. 脊柱节段的iDISCO+整体免疫染色

注意：iDISCO+ 方案的详细描述请见 http://www.idisco.info。

  1. 第1天：组织脱水
    1. 将椎体组织样本（例如，一个椎体节段）依次浸入含20%、40%、60%、80%和100%甲醇的1x PBS溶液中，每步振荡处理1小时进行脱水。
    2. 在室温（RT）下，将样本置于33%甲醇/66%二氯甲烷（DCM）溶液中振荡孵育过夜。
  2. 第2天：组织漂白
    1. 在室温下，用100%甲醇洗涤样本两次，每次1小时。随后将样本在5% H2O2甲醇溶液（30% H2O2与甲醇按体积比1:5混合）中于4 °C孵育过夜。
  3. 第3天：脱钙与通透步骤
    1. 在室温下，依次用80%、60%、40%、20%甲醇及1x PBS溶液逐步重水化样本，每步振荡处理1小时。
    2. 将椎骨样本在Morse溶液（10%柠檬酸三钠与45%甲酸按体积比1:1混合）中孵育30分钟，于室温进行脱钙以保留骨结构。
    3. 用1x PBS洗涤样本两次，随后在PTx2溶液（含0.2% Triton X-100的1x PBS）中振荡孵育两次，每次1小时（第二次更换新溶液）。然后将预处理后的样本在通透溶液（PTx2中含20%二甲基亚砜[DMSO]和2.3% w/v甘氨酸）中于37 °C孵育24小时。
  4. 第4天：封闭步骤
    1. 将样本在封闭液（PTx2中含6%驴血清和10% DMSO）中于37 °C孵育24小时。
  5. 第5–16天：整体免疫标记
    1. 将样本在含有5% DMSO和3%驴血清的PTwH溶液（含0.2% Tween-20和10 mg/mL肝素的1x PBS）中，加入一抗稀释液，于37 °C孵育6天。随后在PTwH溶液中振荡洗涤4–5次，每次室温处理，过夜。
    2. 将样本在含有3%驴血清的PTwH溶液中加入二抗稀释液，于37 °C孵育4天。在透明化前，于室温下在PTwH溶液中振荡洗涤4–5次，每次过夜。
  6. 第17–18天：iDISCO+组织透明化
    1. 将样本依次浸入1x PBS、20%、40%、60%、80%及两次100%甲醇中逐步脱水（每步1小时）。每份样本随后在33%甲醇/66% DCM溶液中孵育过夜。
    2. 用100% DCM洗涤两次 ，每次15 分钟，以去除甲醇。转移至二苄基醚（DBE）中，不摇动，直至组织透明（约4小时），然后在室温下保存于DBE中待成像。

7. 光片荧光显微镜成像

  1. 使用配备 4x/0.3 物镜的光片荧光显微镜（LSFM），在横断面成像透明化样本。
    1. 采用单侧三光片照明配置，固定 x 位置（无动态聚焦）。使用波长调至 561 nm、功率 100 mW 以及波长 639 nm、功率 70 mW 的 LED 激光器。将光片数值孔径设置为 30%。
    2. 使用不同的发射滤光片：Alexa Fluor-568 或 -555 选用 595/40 滤光片，Alexa Fluor-647 选用 680/30 滤光片。
  2. 用二苯醚（DBE）填充显微镜样品室。
  3. 使用相机（材料表）以 2.5 μm 的 z 轴步长和每步 30 ms 的曝光时间采集图像堆栈。使用 x2 光学变焦，实现有效放大倍数（x8），分辨率为 0.8 µm/像素，并以全画幅 10% 的重叠率进行马赛克图像采集。
  4. 使用采集软件以 .tif 格式获取图像，并使用文件转换软件将其转换为 3D 格式。
  5. 使用拼接软件（材料表）重建马赛克图像采集结果。打开图像后，手动移动并依据图像间 10% 的重叠区域作为参考，重建完整的马赛克图像。
  6. 使用 3D 软件（材料表）生成数据的正交投影图，如 图 1、图 2、图 3 和 图 4 所示，并为显示的淋巴管及其他解剖结构添加颜色编码属性。根据制造商说明，对从 LSFM 获得的原始数据设置 1.47 的伽马校正值。

结果

椎体淋巴管系统的三维成像
图1展示了iDISCO+/LSFM实验流程的各个步骤，以及经iDISCO+处理的ThLb椎骨中椎管内淋巴回路的LSFM图像。iDISCO+与LSFM相结合的方法保留了椎体的解剖结构，并在周围骨骼、韧带、肌肉和神经节内完整呈现了淋巴血管网络的形态（即椎体内血管与从椎体背侧和外侧穿出的椎外血管相连接的结构）。

脑膜淋巴系统中dcLN引流的荧光大体成像
为了对中枢神经系统相关淋巴系统中的大分子引流进行成像，可通过注射将大分子示踪剂体内导入脑脊液或脊髓实质。大分子示踪剂可经小脑延髓池注射便捷地递送至脑脊液。小脑延髓池位于小脑与延髓背侧表面之间，枕骨大孔上方。此外，也可通过立体定位手术沿脊柱不同节段将大分子示踪剂注射至脊髓实质。

所使用的示踪大分子或直接用荧光染料标记，或在死后通过免疫组织化学法用特异性抗体进行检测。 图2A 展示了追踪OVA-A的实验方案555，一种红色荧光的小分子量示踪剂（约45 kDa），被注入脑脊液（CSF）中（图2B) 或脊髓的 ThLb 区域（图2C).

在注射大分子示踪剂45分钟后，处死小鼠，用4%多聚甲醛灌注，并处理以分离头部脑干区域及脊柱的解剖节段，随后进行脱钙和透明化处理。通过荧光宏观成像观察收集脑脊液和硬膜外液的淋巴结，可轻松评估大分子的引流情况。如图2所示，将OVA-A555注射至脑脊液（图2B）或脊髓的ThLb（图2C）区域后，注射45分钟即可观察到OVA-A555在dcLNs中的积聚。该结果表明淋巴系统摄取并引流了荧光示踪剂，这是进一步开展iDISCO+/LSFM成像以观察脊柱淋巴引流的前提条件。

脊柱淋巴系统中大分子引流的三维成像
根据在深部颈部淋巴结（dcLNs）中检测到的OVA-A555标记信号，可将iDISCO+/LSFM技术应用于经脱钙和预清除处理的脊柱组织样本，这些样本取自注射了OVA-A555的小鼠。该方法能够在示踪剂注射后的特定时间点，构建脑脊液和脊髓硬膜外液淋巴引流路径的三维图谱。通过从注射位点开始，对脊柱各节段逐级成像，即可完成对中枢神经系统连续节段的三维图谱绘制。

图3A展示了将OVA-A555注射至ThLb脊髓实质的实验设计，以及OVA-A555在颈椎和胸椎节段中分布的三维模式，同时结合了淋巴管系统的显示。在OVA-A555注射后45分钟，可在脊髓组织和深部颈部淋巴结（dcLNs）中检测到OVA-A555的聚集（图3B中的白色箭头），这与图2所示的显微镜观察结果一致。然而，在用抗LYVE1抗体标记的颈椎和胸椎淋巴管系统中并未检测到该信号。脑脊液注射的示踪剂在椎体淋巴管中缺失，可能是由于示踪剂在淋巴管内的存留时间较短，或淋巴管对示踪剂缺乏摄取所致（图3C）。

为了验证第一个假设，使用兔抗LYVE1抗体作为淋巴管内皮细胞的标记物，以结合中枢神经系统相关的淋巴管。随后通过免疫组织化学方法，用抗兔二抗检测注射的兔抗LYVE1抗体，同时使用抗PROX1抗体对淋巴管内皮细胞进行免疫标记。图4展示了将抗LYVE1抗体注入ThLb脊髓实质的实验设计（图4A），以及在注射部位附近的ThLb节段中，LYVE1抗体相对于PROX1+淋巴管的三维分布模式（图4B）。注射的抗LYVE1抗体标记了椎体淋巴管及其椎体外淋巴管连接结构，证实了椎体淋巴管对示踪剂的摄取以及向椎体外淋巴系统的引流功能。ThLb区域缺乏淋巴结，因此在成像节段中无法观察到淋巴结。此外，沿淋巴管观察到的LYVE1标记物的不连续分布模式可能反映了淋巴管系统中LYVE1表达的不连续性，这与先前研究的报道一致14,21。综上所述，本研究结果表明，在示踪剂注射后45分钟，LYVE1抗体能够检测局部椎体淋巴管的摄取，而OVA-A555则不能；因此，LYVE1抗体作为局部椎体淋巴引流的持续性标记物优于OVA-A555。

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图1：椎体淋巴管系统的三维视图。 (A) 实验方案示意图。(B) 从背前方向观察胸腰段（ThLb）椎体淋巴管系统的三维视图的平面投影。采用iDISCO+方法，通过抗PROX1抗体（绿色）对淋巴管进行免疫标记，随后使用光片显微镜（LSFM）成像。注意在连续三个椎体的椎管内，淋巴管呈现类似体节的分布模式（白色箭头）。除了半圆形的背侧血管（白色箭头）外，每个椎体淋巴网络还包括腹侧分支（黄色箭头）、沿脊神经分支和神经节走行的双侧外侧输出通路（白色箭头），以及中线处的背侧输出通路（白色双箭头）。各椎体淋巴网络之间由一条纵行血管相连（紫色箭头）。详细描述请参见Jacob L. 等人18 SC = 脊髓；星号 = 腹侧椎体；D = 背侧；L = 外侧；V = 腹侧；比例尺 = 300 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：dcLNs 收集了 OVA-A555 标记的脑脊液。 (A) 实验设计示意图。将 OVA-A555 注射至 ICM 或 ThLb 脊髓实质中，注射后 45 分钟处死小鼠。样本经透明化处理后，通过荧光宏观成像系统观察（B、C）。来自 ICM（B）和 ThLb（C）注射小鼠的颈椎荧光宏观成像图像。注意 OVA-A555 在 dcLNs（B、C，白色箭头）以及颈椎脊髓的软脑膜和血管周围间隙（B、C）中积聚，且在 ICM 注射后，沿颈神经分布的腹外侧排出通路中亦可见荧光信号（B，白色箭头）。SC = 脊髓；星号 = 腹侧椎体；D = 背侧；L = 外侧；V = 腹侧；B 和 C 中的比例尺 = 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：在脊柱淋巴系统中检测OVA-A555标记的脑脊液。 (A) 实验设计示意图。将OVA-A555注射至胸段脊髓实质中，注射后45分钟处死小鼠。样本经iDISCO+方案处理后，使用光片显微镜（LSFM）成像。(B,C) 光片显微镜获取的颈椎(B)和胸椎(C)节段前部三维图像的平面投影。如图2所示，OVA-A555的聚集信号（红色）出现在脊髓组织和dcLNs中（B，白色箭头），但在使用抗LYVE1抗体（绿色）免疫标记的颈段和胸段淋巴管中未检测到该信号。SC = 脊髓；星号 = 椎体腹侧；D = 背侧；L = 外侧；V = 腹侧；比例尺 = 1 mm (B)，300 µm (C)。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：脊髓内注射抗LYVE1抗体后椎体淋巴引流的检测。 (A) 实验设计示意图。将抗LYVE1抗体注射至ThLb脊髓实质内，注射后45分钟处死小鼠。样本经iDISCO处理+ 方案并使用LSFM成像。B). ThLb 的额面 3D 视图的平面投影（B) 脊柱节段，通过LSFM成像。使用抗兔抗体（紫色）检测抗LYVE1抗体，并使用抗PROX1抗体（绿色）标记淋巴管系统。白色血管为PROX1+ 淋巴管与抗LYVE1抗体共标记（B）；其中包括椎体（黄色箭头）和椎体外（双黄色箭头）淋巴管。SC = 脊髓；星号 = 腹侧椎体；D = 背侧；L = 侧方；V = 腹侧；比例尺 = 300 µm (B). 请点击此处以查看此图的放大版本。

试剂靶标图示实验步骤备注
OVA-A555脑脊液示踪剂图2和图32. 脑室内注射或丘脑腹外侧注射
7. 光片层显微成像（LSFM）。		水溶性好，易于注射，荧光信号强
Anti-Lyve1 抗体淋巴管内皮细胞膜标记物图36. iDISCO+ 全组织免疫染色
7. 光片层显微成像（LSFM）。		适用于全组织免疫染色的高效抗体
硬脑膜及硬膜外淋巴管的示踪剂引流图42. 脑室内注射或丘脑腹外侧注射
6. iDISCO+ 全组织免疫染色
7. 光片层显微成像（LSFM）
Anti-Prox1 抗体淋巴管内皮细胞核标记物图1和图46. iDISCO+ 全组织免疫染色
7. 光片层显微成像（LSFM）		适用于全组织免疫染色的高效抗体

表1：本研究中使用的抗体和示踪剂。

问题可能原因解决方案
示踪剂注射手术非预期的中枢神经系统组织损伤1. 玻璃毛细管插入时缺乏控制
2. 玻璃毛细管插入深度不正确		1. 在插入玻璃毛细管前，使用26 G针头小心但彻底地刺破硬脑膜。
2. 减少玻璃毛细管的插入深度（距硬脑膜 <1.5 mm）。
3. 减小玻璃毛细管的直径。
示踪剂意外污染至硬膜外或椎体外空间示踪剂注射操作不当1. 检查玻璃微毛细管是否已正确插入并穿透硬脑膜。
2. 在注射示踪剂前，在玻璃微毛细管与周围组织之间添加外科胶水。
注射示踪剂体积过大减少注射示踪剂的体积（<2 µL）。
iDISCO+ 免疫染色组织中标记信号缺失、分布不均或背景过高1. 一抗浓度存在问题
2. 通透不充分
3. 洗涤不充分
4. 透明化不充分		增加孵育步骤的次数和/或时间：通透、洗涤、一抗孵育和透明化。详见 http://www.idisco.info（常见问题与故障排除）。
脱钙不充分对样本采用更严格的脱钙处理，特别是头部组织，可使用EDTA21或Morse溶液。
iDISCO+ 透明化样本呈不透明或褐色漂白不充分使用新鲜的H2O2溶液，并增加体积和/或孵育时间。
存在氧化现象将管子完全装满，避免空气残留。
透明化不充分增加体积和/或孵育时间。详见 http://www.idisco.info（常见问题与故障排除）。
示踪剂检测无法检测到示踪剂所选示踪剂组合不正确Alexa 555、594 和 647 荧光染料可耐受 iDISCO+ 方案5,6,7,8,9,10，但 FITC、GFP 和 RFP 荧光染料则不能。
注射后处死时间点选择不当对于短期（15 分钟）局部椎体淋巴管引流分析，建议使用 OVA-A555；对于淋巴结引流分析，可使用 OVA-A555 和 Lyve1 抗体进行较长时间（>45 分钟）的分析。
成像：采集与分析淋巴管回路的成像结果不理想解剖问题（遗漏淋巴结）根据拟成像的淋巴管回路，仔细保留椎体/颅骨邻近组织于解剖样本中。
成像问题1. 调整光片显微镜（LSFM）的采集参数：激光强度、光片数值孔径、光片厚度、曝光时间。
2. 调整样本在支架中的位置，以缩短光线穿过组织到达物镜的路径。
3. 确保采集过程中组织样本内部无气泡存在。

表2：实验方案各步骤的故障排除建议，包括可能的问题及解决方案。

讨论

iDISCO+/LSFM 方案能够在细胞分辨率水平上，以前所未有的三维视角展示中枢神经系统（CNS）相关淋巴网络及其周围组织的结构。该方案适用于体积不超过 1.5 cm3 的中等大小样本，这是由于 LSFM 光学系统的限制、工作距离较短，以及高分辨率显微镜所用商用物镜尺寸较大所致23。这一限制使得无法完整捕获与大脑相关的整个淋巴系统。需要注意的是，必须谨慎界定研究区域，并仔细解剖 CNS 周围的组织，以包含参与完整淋巴回路的颅外淋巴管和淋巴结（表 2）。

除了尺寸和解剖结构因素外，颅骨和脊柱周围间充质组织的复杂性也存在差异，因此需要调整脱钙和预透明处理条件，以获得均匀的样本透明效果，并使光束能够在柔软的各向同性生物组织中有效传播。在无骨组织的情况下，对脑或脊髓组织进行LFSM成像无需脱钙步骤，所获取图像的最终分辨率可达最优19。上述包含使用Morse溶液进行温和脱钙步骤的方案，适用于脊柱的LSFM成像，如图1和图4所示。相比之下，颈部区域不仅骨性结构特别复杂，还包含多层肌肉、脂肪和腺体组织，这些因素会降低所获取LSFM图像的质量，如图3B所示。因此，可通过更严格的组织处理方法来改善颈部及颈椎区域的LSFM成像效果；例如，使用EDTA处理，如先前报道所述24。因此，脱钙步骤至关重要，在启动完整的iDISCO+方案之前，必须针对每种抗体预先测试脱钙条件（表2）。

尽管iDISCO+/LSFM方案能够生成硬脑膜与硬膜外腔之间连接通路及其相关淋巴结（LNs）的三维图像，但基于LSFM采集的图像对淋巴管系统进行直接定量分析仍不可行，原因如下：1）由于淋巴管标志物表达呈不连续模式，难以可靠地勾画淋巴管通路，例如膜表面LYVE1呈异质性分布21，而PROX1为核表达模式22；2）抗体渗透的异质性，以及因脱钙和预透明处理不完全或不均一所导致的生物组织中可能残留的各向异性。因此，需要结合虚拟现实工具（如www.syglass.io）对LSFM成像进行扩展，以实现交互式可视化，从而促进对淋巴管系统的定量分析。此外值得注意的是，对中枢神经系统相关通路的精确描述，还需借助传统免疫标记技术在薄层（5–10 µm）冷冻或石蜡包埋组织切片上获得的高分辨率共聚焦图像来验证LSFM结果，特别是用于精确定位淋巴管相对于硬脑膜和脑脊液（CSF）的空间位置，这一点已在先前研究中被报道11,14,18。

iDISCO+/LSFM 协议可实现中枢神经系统相关淋巴系统中大分子引流的三维可视化，如图所示 图3 和 图4然而，对淋巴引流功能的评估除了iDISCO的建议外，还需要+/上述LSFM方案需遵循严格的实验流程，因为最终结果取决于注射手术的质量、给药位点的选择、所用大分子标记物的类型及注射体积，以及示踪剂给药后的处死时间（表2). 由于不同注射动物之间示踪剂分布模式存在差异，淋巴引流通路的表征需要较大的实验样本量>10 注射条件）。在本方案中，1）注射前必须刺穿硬脑膜，以防止对中枢神经系统组织造成意外损伤和穿透；2）注射体积必须小于 2 µL，以限制示踪物通过注射孔、沿注射毛细管扩散至硬膜外腔或椎管外组织；3）注射毛细管插入深度应限制在硬脑膜下方 2 mm 以内，以避免在脑脊液注射（ICM）和脊髓内注射中造成中枢神经系统损伤或靶向错误。此外，如上所述，还需对邻近的椎体节段进行互补性的高分辨率共聚焦分析，以评估示踪物是否存在于淋巴管内。该分析需在标记的淋巴管横截面上，建立示踪物与淋巴管标志物的强度分布图。该方法此前已被用于证明 OVA555 注射后15分钟ThLb淋巴管的摄取情况（见Jacob等人的补充图5F）14）。然而，本研究尚未展示抗LYVE1示踪剂的相关结果（图4).

在可能的脑脊液示踪剂中，OVA-A555 是极佳的选择，因其对iDISCO具有抗性+ 实验方案处理可保持LSFM成像中的高荧光强度。但需注意，示踪剂的类型必须根据分析的时间点进行选择（表1 和 表2). 如上所述，OVA-A555 注射后15分钟可观察到局部椎体淋巴管的标记14。然而，OVA-A555 注射后45分钟，在这些局部淋巴回路中已无法检测到图3）与抗LYVE1抗体相比图4).

总之，iDISCO+/LSFM 方案非常适用于研究中枢神经系统相关淋巴系统在生理和病理条件下的三维结构与引流情况，例如中枢神经系统和脊柱肿瘤，或脊椎骨与关节疾病。尽管整个实验流程较长且需要严格的方法学操作，但结合虚拟现实工具和高分辨率共聚焦成像进行互补分析时，可提供宝贵而独特的信息。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国国家健康与医学研究院（Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale）、法国国家科研署（Agence Nationale Recherche，项目号 ANR-17-CE14-0005-03）、脑科学研究联合会（Federation pour la Recherche sur le Cerveau，FRC 2017）、Carnot 成熟项目（资助 L.J.）、巴西里约热内卢联邦大学（Universidade Federal de Rio de Janiero，UFRJ，资助 J.B.）、美国国立卫生研究院（NIH，项目号 R01EB016629-01）以及耶鲁医学院资助。我们感谢ICM平台：ICM-QUANT 提供的细胞成像技术支持，以及 ICM-histomics 提供的免疫组织化学技术支持。所有动物实验均在 PHENO-ICMice 设施中进行。该核心设施得到了两项“未来投资计划”（“Investissements d’avenir”，项目号 ANR-10-IAIHU-06 和 ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS）以及“法国医学研究基金会”（Fondation pour la Recherche Médicale）的支持。我们感谢 Nicolas Renier 在方法学方面的建议以及对稿件的审阅。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
耗材
离心管：0.2 mlEppendorf30124359
离心管：2 mlEppendorf30120094
锥形离心管：15 mlFalcon352096
锥形离心管：50 mlFalcon352070
切片机刀片 80 mmMicrom Microtech FranceF/MM35P
针头 26G (0.45×13 mm)TerumoAN*2613R1
1 ml 注射器TerumoSS+01H1
显微镜与成像软件
AxioZoom.V16 荧光体视变倍显微镜，配备 ORCA-Flash 4.0 数字 sCMOS 相机（Hamamatsu Photonics）或 OptiMOS sCMOS 相机Zeiss
Imspector 显微镜控制软件，版本 v144（采集软件）Abberior instruments
Imaris File Converter x64 9.2.0（文件转换软件）、Imaris Stitcher 软件 9.2.0（拼接软件）、Imaris x64 9.2.0（三维重建软件）OXFORD instruments
LED 激光器（OBIS）LVBT 激光模块第二代COHERENT
Ultramicroscope II，配备 sCMOS 相机（Andor Neo）和 4 × /0.3 物镜（LVMI-Fluor WD6）LaVision Biotec
试剂
Alexa Fluor 568 驴抗兔抗体Thermo FisherA10042
Alexa Fluor 647 驴抗山羊抗体Jackson ImmunoResearch705-605-147
Alexa Fluor 647 驴抗兔抗体Jackson ImmunoResearch711-605-152
抗 LYVE1 多克隆抗体Angiobio#11-034
抗 PROX1 山羊多克隆 IgG 抗体R&D systems#AF2727
布托啡诺注射液安瓿（Buprecare 溶液，0.3 mg/ml）AnimalcareAmpule 1ml
二苄醚 100%（DBE）Sigma Aldrich108014
二氯甲烷 100%（DCM）Sigma Aldrich270997
甲酸 99%CARLO ERBA405793
甘氨酸Sigma AldrichG.7126
猪源肝素钠盐Sigma AldrichH4784
过氧化氢溶液（H2O2 30%）Sigma AldrichH1009
异氟烷（Iso-Vet 100%）PiramalNDC 66794-013-10
甲醇 100%Sigma Aldrich322415
卵白蛋白 Alexa Fluor 555 偶联物Invitrogen11549176
磷酸盐缓冲液 PBS（10X 储存液）EuromedexET330-A
戊巴比妥钠（Euthasol 400 mg/mL）Dechra08718469445110
三钠柠檬酸盐VWR6132-04-3
手术器械与设备
麻醉系统UniventorUniventor 410 麻醉装置
玻璃毛细管拉制仪NarishigePC-10
加热垫CMA Microdialysis ABCMA 450 温度控制器
微量毛细管（玻璃毛细管）Harvard ApparatusGC120-15
显微镊、镊子、解剖剪及 Michel 缝合夹（7.5 × 1.75 mm）Fine Science Tool12040-01
手术刀（无菌一次性手术刀 23）Swann-Norton0510
立体定位仪KOPFModel 940
Hamilton 注射器 10µl 701NHamilton28618-U
暖风系统Vet-Tech LTDHE011

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