量化秀丽隐杆线虫中组织特异性蛋白静剂下降

摘要

蛋白质静力学下降是衰老的标志，促进神经退行性疾病的发作。我们概述了一种方案，通过融合到荧光报告基因的多谷氨酰胺重复序列的异源表达来量化两种不同 秀丽隐杆线虫 组织中的蛋白质稳态。该模型允许对蛋白质稳态进行快速体内遗传分析。

摘要

在正常衰老过程中，维持蛋白质组（蛋白质稳态）的正常功能和折叠的能力下降，促进了越来越多的年龄相关疾病的发作。例如，具有聚谷氨酰胺扩增的蛋白质容易聚集，例如亨廷顿蛋白和伴随亨廷顿舞蹈症的发作。通过使用转基因 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 与年龄相关的蛋白质组恶化已被广泛研究，这些秀丽隐杆线虫表达polyQ重复序列融合到黄色荧光蛋白（YFP）中。该 polyQ::YFP 转基因动物模型通过成像荧光病灶（即蛋白质聚集体）的进行性形成以及随后由于蛋白质组塌陷而产生的运动缺陷的发作，促进了蛋白质组年龄相关衰退的直接定量。此外 ，polyQ::YFP 转基因的表达可以由组织特异性启动子驱动，从而可以在完整的多细胞生物体的背景下评估组织内的蛋白质平衡。该模型非常适合遗传分析，因此提供了一种量化衰老的方法，与寿命测定相辅相成。我们描述了如何在衰老过程中准确测量神经元或体壁肌肉内的 polyQ::YFP 病灶形成，以及随后行为缺陷的发作。接下来，我们将重点介绍如何使这些方法适应更高的通量，以及使用其他新兴策略进行 秀丽隐杆线虫 遗传分析的潜在未来应用。

引言

蛋白质稳态（蛋白质稳态）被定义为维持蛋白质组正常功能和折叠的细胞能力。蛋白质稳态的固有挑战是确保所有蛋白质都正确折叠并保持在天然构象中，其通过蛋白质大小，氨基酸组成，结构构象，稳定性，周转，表达，亚细胞区室化和修饰的不同性质进一步放大^1。蛋白质平衡是通过由大约2000种独特蛋白质组成的大型蛋白质的协调作用来维持的，这些蛋白质调节蛋白质组内的适当合成，折叠，运输和降解^2，3。蛋白质静膜网络的主力成分是分子伴侣的九个主要家族^4。每种组织和细胞类型都优先利用分子伴侣的特定亚群，可能符合不同蛋白质组^{的不同需求5。}

正常有机体衰老的一个标志是细胞蛋白质平衡的进行性下降和崩溃，这被认为是越来越多的年龄相关疾病发作和进展的根本基础。例如，阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症（ALS）都有一个共同的特征:在每种情况下，神经变性的表现都是由遗传改变驱动的，这些改变使突变蛋白易聚集（淀粉样蛋白β/Tau，α突触核蛋白，分别是HTT，FUS / TBD - 43 / SOD-1） 6，7，8，9，10.在衰老过程中，蛋白质静剂网络的完整性和诱导性下降，这导致蛋白质毒性聚集体的积累，导致细胞功能障碍和神经变性。值得注意的是，蛋白质构象疾病不是神经元独有的，并且发生在多个组织中，如II型糖尿病，多发性骨髓瘤和囊性纤维化^{11，12，13，14}所示。因此，阐明能够保持蛋白质平衡的机制将有助于开发有针对性的干预措施来治疗疾病并促进健康老龄化。

小土壤线虫秀丽隐杆线虫（C. elegans）在发现改变蛋白质稳态的基因和阐明途径方面发挥了重要作用。蛋白质静力学网络的许多组成部分和调节蛋白质稳态的信号转导途径在进化上是保守的。此外，秀丽隐杆线虫降低了相对于脊椎动物系统的复杂性和冗余性，使其更适合遗传分析和基因发现。秀丽隐杆线虫的其他优点导致它被广泛用作研究蛋白质稳态的模型系统，包括:强大的遗传和功能基因组学，较短的生命周期（3天）和寿命（3周），紧凑且注释良好的基因组，各种遗传突变体的可用性，以及使用荧光报告程序可视化细胞生物学中组织特异性变化的容易程度。

衰老过程中蛋白质稳态的进行性衰变可以很容易地在秀丽隐杆线虫中量化。森本实验室首先证明，融合到黄色荧光蛋白（polyQ::YFP）的聚谷氨酰胺扩增可用于量化秀丽隐杆线虫在衰老过程中的蛋白质静力下降15，16，17，18。YFP 融合至 35 个谷氨酰胺重复序列或更多次可导致与年龄相关的荧光病灶形成以及细胞病理学体征。值得注意的是，这种谷氨酰胺扩增的范围反映了亨廷顿蛋白的聚谷氨酰胺束的长度，亨廷顿舞蹈症的病理学开始在人类中观察到（通常>35 CAG重复^）19。在肌肉、肠或神经元细胞中表达polyQ::YFP的菌株已被用于证实与年龄相关的蛋白质稳态下降发生在不同的细胞和组织类型中。肌肉特异性polyQ::YFP表达（即unc-54p::Q35::YFP）一直是使用最广泛的组织特异性报告基因，因为在成年期的头几天，使用简单的荧光解剖显微镜很容易量化累积的荧光病灶（图1A-1B）。此外，动物在中年时会瘫痪，因为肌肉内的蛋白质组由于报告者的蛋白质毒性作用而塌陷（图1C）。类似地，神经元蛋白平衡的年龄相关下降可以通过直接量化将动物放入液体后协调体弯曲的病灶/聚集体形成和年龄相关下降来跟踪（rgef-1p::Q40::YFP）（图2）。

在这里，我们提出了一个详细的方案，说明如何测量蛋白质聚集体积累的年龄依赖性进展以及秀 丽隐杆线虫中神经元和肌肉组织中多谷氨酰胺重复表达诱导的相关蛋白质毒性。我们提供了使用这些菌株和方法产生的典型结果的示例。此外，我们展示了我们如何利用这些方法来研究蛋白质静力学网络的转录调控。我们讨论了这些报告器可以与其他现有试剂轻松集成或适应更大屏幕的其他方法。

方案

1. 试剂的制备

1. 选择要通过基于喂养的RNAi灭活的目标基因。购买含有感兴趣的RNAi克隆的HT115 大肠杆菌 库存^20。或者，将目的基因的cDNA亚克隆到L4440质粒的多克隆位点中。
   注意:为了防止细菌内dsRNA的降解，请使用HT115菌株。这是一种RNase III缺陷 大肠杆菌 菌株，具有IPTG诱导的T7聚合酶活性。对于不使用基于喂养的RNAi的蛋白质稳态研究，可以使用标准NGM板上的HT115或OP50 大肠杆菌 。
2. 根据测试条件准备5 x 6厘米的板。对于使用RNAi的实验，在转化的HT115大肠杆菌中诱导dsRNA的产生。对于没有RNAi的研究，可以使用标准NGM板上的OP50大肠杆菌（参见标准NGM和RNAi板配方的补充文件1）。
   注意:RNAi板可以在4°C下储存数月，然后再与细菌一起播种。
3. 在37°C下以220rpm的振荡培养箱中培养 大肠杆菌 过夜（16-20小时）。用氨苄西林（50μg/ mL）在Luria Broth（LB）中培养HT115 大肠杆菌 。
   注:标准OP50 大肠杆菌 不耐抗生素，但也有链霉素耐药变体。
   1. 通过在台式离心机中以2，400×g离心15-20分钟浓缩细菌，吸出上清液，并将沉淀重新悬浮在起始体积（即10x浓度）的1/10^中，氨苄西林用于HT115，或LB不含氨苄西林用于标准OP50。
   2. 将200μL浓缩的10倍细菌等分到每个板中（每个测试条件3-4次重复，带有2个额外的备用板，用于污染）。
   3. 允许打开的板在清洁的环境中干燥，例如层流工作台，直到所有液体都被吸收，或者让覆盖的板在实验室工作台上干燥过夜。
4. 对于在罩中干燥的种子RNAi板，在室温下将干燥的板储存在蠕虫盒内过夜（最多24小时）。在室温下1天后，板可以在密封袋中在4°C下储存长达2周（以防止板变干）。使用前，让储存在4°C的板在拉链袋内恢复到室温，以防止冷凝引入空气中的真菌污染。
   1. 当使用基于喂养的RNAi时，在室温下将接种的HT115细菌留在RNAi板上至少12小时，然后再添加 秀丽隐杆线虫。 RNAi板含有IPTG，可诱导dsRNA的产生。或者，可以在接种前2小时的步骤1.3.1结束时将IPTG加入液体培养物中。
   2. 避免在室温下（大于几天）长期储存播种的HT115平板，以避免琼脂开裂，这将导致 秀丽隐杆线虫 钻入琼脂中。

2.秀丽隐杆线虫的同步

注意:选择是否通过对妊娠成人进行碱性次氯酸盐处理或产卵来同步 秀丽隐杆线虫 。

1. 通过对受妊娠的成年动物进行次氯酸盐处理来同步动物，以促进胚胎²²的释放。
   1. 对于次氯酸盐处理，用M9缓冲液洗涤妊娠雌雄同体2次，然后重悬于5mL次氯酸盐溶液（3.25mL次氯酸盐溶液，1mLM9缓冲液和0.75mL 5M NaOH）中5分钟，每分钟摇动重悬的动物。5分钟后，将动物旋转下来，用M9缓冲液洗涤3次。
      注意:次氯酸盐处理已被假定为影响蛋白质平衡²¹。
   2. 次氯酸盐处理后，让胚胎在3mL M9溶液中孵化过夜，并在20°C下旋转。
   3. 通过将10μL的L1溶液3x滴到6厘米的板上并计算L1动物的数量以计算每μLL的L1动物的平均数量来计算每μL的L1动物（或胚胎）的密度。因此，定期混合L1溶液以避免沉降。
   4. 每盘播种50只L1动物，计数并记录播种的数量，并将板移动到20°C培养箱中。在测定开始时，了解每个板上的实际动物数量非常重要。
      注意:通常使用通过在M9中过夜孵化来同步L1动物，因为它将动物放入食物后可最大限度地减少发育异质性。然而，同步是通过对饥饿线索的反应而发生的发育停滞，对于一些研究，应避免这种情况（参见²³ 进行进一步讨论）。作为替代方案，可以通过产卵获得大致同步的动物，见2.2。
   5. 将剩余的L1动物冷冻并储存在液氮或-80°C冰箱中。通过这种方式，在实验设置时保留了每种菌株的样品，为未来的研究创造了宝贵的资源，并提高了可重复性。
      注:有关次氯酸盐和M9溶液配方，请参见补充文件1。
2. 为了通过产卵同步动物，将20只年轻的怀孕成年动物（成年期的第1天）放在每个盘子上4-6小时，并让它们产卵，直到每个盘子大约有50个卵。取出所有妊娠的成虫，并将装有卵的板移动到20°C培养箱中。
   注意:受孕的成年动物应在成年的第一天同步。年长的动物可能会产下保留在子宫中的卵，导致处于更高级发育阶段的卵的释放。

3. 后代生产

注:必须采取措施防止后代产生或将同步起始种群与其后代分离。通过向板中添加5-氟-2'-脱氧尿苷（FUdR）可以通过化学方式防止后代产生，这里对此进行了描述。一些研究报道，FUdR可以改变蛋白质稳态^24，25。下文将讨论防止后代产生的替代方法。

1. 通过将1gFUdR溶解到10mL超纯H₂O中来制作1000x FUdR的储备溶液。用0.2μm过滤器和10mL注射器过滤灭菌库存FUdR。将 1 mL 原液等分到无菌的 1.5 mL 管中。冷冻并储存在-20°C。
2. 在20°C下培养动物直到L4阶段。从次氯酸盐处理的同步L1s中饲养的N2动物需要在20°C下生长约40小时才能达到L4。在实验之前，应根据经验测试其他菌株的生长速率。有关如何准确分期 秀丽隐杆线虫的详细信息， 请参见²⁶。
   1. 向L4动物的每个6厘米板中加入100μL80x FUdR。在 L4 阶段添加 FUdR 至关重要。
3. 将盘子放回蠕虫盒，然后将盒子放入拉链袋中。返回适当的培养箱。

4. 使用表达聚谷氨酰胺的动物测量肌肉组织中蛋白质平衡的下降

注意:有两种方法可用于识别肌肉细胞中的蛋白质稳态下降:对衰老过程中蛋白质聚集体的形成进行成像（4.1）和测量这些聚集体通过麻痹发作引起的蛋白毒性（4.2）。

1. 在衰老过程中对肌肉中的聚谷氨酰胺聚集体形成进行成像
   注意:肌肉细胞中蛋白质聚集的年龄依赖性进展使用融合到黄色荧光蛋白（YFP）的聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列进行成像。该协议概述了菌株AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP]的使用，但也可以使用其他聚谷氨酰胺变体菌株。 polyQ::YFP 转基因使用 unc-54 肌肉特异性启动子在肌肉中表达。同步 的unc-54p::p olyQ::YFP 表达动物在成年期的第1天，第2天，第3天和第4天可视化。要可视化 unc-54p::p olyQ::YFP 聚集体，请使用配备荧光的复合显微镜或荧光解剖显微镜。AM140可从Caenorhabditis遗传学中心（CGC）获得，网址为:https://cgc.umn.edu/strain/AM140。
   1. 在成像日（成年期的第1天，第2天，第3天和第4天），选择20只动物并安装到显微镜载玻片上，装有3%琼脂糖垫和5μL滴10mM叠氮化钠（在M9缓冲液中稀释）。
   2. 在所有动物被叠氮化钠固定（〜5分钟）后，使用10倍放大镜对动物的整个身体进行成像（图1A）。对于成像，请使用FITC滤光片，并对每只动物进行相同的曝光。成像后丢弃载玻片。
      注意:或者，也可以直接在板上定量YFP病灶，但必须在评分时将二氧化碳流施加到板上来抑制运动。在筛选大量疾病时，这种替代方法最合适（有关详细信息，请参阅讨论）。
   3. 获取图像后，计算整个动物体壁肌肉中的病灶数量。焦点是较亮的标点信号，可以与背景中较暗的可溶性信号区分开来。
   4. 绘制YFP病灶从第1天、第2天、第3天和第4天开始的积累进展。绘制一个XY图，其中X表示成年期的天数，Y表示 unc-54p::p olyQ::YFP 病灶的数量（图1B）。将实验条件下的病灶数量（例如，基因下调或过表达）与对照动物进行比较。在每次试验观察到的每个时间点的组之间执行统计分析。
      1. 当仅比较两个条件的病灶计数时，在每个时间点执行独立的样本t检验。
      2. 比较两个以上条件的焦点计数时，请对每个时间点执行综合单因素方差分析，包括该时间点所有条件的数据。如果综合方差分析产生显著的 p 值（即 p < 0.005），则使用成对的独立样本 t 检验执行 事后 分析，以确定检测到病灶显著差异的特定条件（例如，对于 A、B 和 C 组，比较 A 和 B、C 和 B 和 C）。
2. 测量动物麻痹率作为肌肉细胞中聚谷氨酰胺毒性的替代物
   注意:肌肉中polyQ聚集体的年龄依赖性增加导致驱动运动的肌肉功能下降。这种运动缺陷可以通过测量表达polyQ的动物的进行性麻痹率来确定。对于麻痹测定，在成年期的第3天，第5天，第7天和第9天对同步 的unc-54p::p olyQ::YFP 表达动物进行评分。根据需要添加额外的时间点以扩展评分范围，以便您可以评估遗传扰动的影响。
   1. 在评分日（成年期的第3天，第5天，第7天和第9天），查看包含50只动物的6厘米板，并记录瘫痪动物的数量。从盘子里取出瘫痪的动物。如果动物从盘子里爬下来，或者已经死亡，它们应该被审查;记录事件，以便在分析中对其进行说明。
      注意:当动物暴露在轻度或轻柔的触摸刺激下后没有观察到任何运动时，动物被认为是瘫痪的。咽部泵送活动用于确定不动的动物是活着还是死了。
   2. 在实验完成后，计算每种情况的瘫痪率。在每个时间点，通过将瘫痪动物的比例除以当时观察到的该病症的动物总数来执行此操作。如果观察每个时间点（即复制板）的每个条件的多个板，请分别计算每个重复的比率。
   3. 在 XY 图（散点图）中绘制瘫痪率的进展。X 代表成年期天数，Y 代表瘫痪率。将 unc-54p::p olyQ::YFP 动物的麻痹率与对照动物进行比较（图1C）。在组之间进行统计分析;对于多项试验，独立处理试验。使用 Cox 比例风险回归和瓦尔德检验。大多数支持生存分析的数据分析工具也支持 Cox 建模。
      1. 转换数据:每个条件应有两列，一列用于时间，另一列表示"事件"。在观察到的每个时间点，为每个瘫痪的动物添加一行"0"，为每个被审查的动物添加一行"1"。总行数应等于该条件的盘子上的起始动物数。
      2. 根据统计软件的说明执行 Cox 比例风险建模，然后执行 Wald 检验。单变量模型适用于典型的实验设计。对于两个以上的条件，如果包含所有条件的检验表明有显著结果（即 p < 0.005），则可以在条件之间执行成对检验以确定条件的特定显著对。
         注意:Cox 模型依赖于一个假设，即测试条件随时间按比例调节事件的概率。这意味着，例如，Cox模型不适合将大多数动物在第1天瘫痪的条件与大多数动物在第9天瘫痪的条件进行比较。Cox模型的扩展，以及用于比较每个时间点瘫痪比例的其他方法，可用于比例风险假设不成立的情况，请参阅27，28，29，30。

5.使用表达聚谷氨酰胺的动物测量神经元组织中蛋白质平衡的下降。

注意:使用两种互补的方法测定神经元中的蛋白质稳态下降（1）通过量化衰老过程中蛋白质聚集体（荧光病灶）的形成，以及（2）通过基于运动的测定测量神经元蛋白质组的年龄相关下降。

1. 成像衰老过程中神经元中的聚谷氨酰胺聚集体形成
   注意:与已经在肌肉组织中讨论的测定类似，神经元中蛋白质聚集的年龄依赖性进展是通过表达由rgef-1的泛神经元组织特异性启动子驱动的polyQ::YFP融合蛋白来成像的。具体来说，我们使用AM101:rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP]，四十个谷氨酰胺融合到YFP^16。要可视化rgef-1p::p olyQ::YFP，请使用配备40倍放大镜的荧光复合显微镜。AM101 可从 CGC 获得，网址为:https://cgc.umn.edu/strain/AM101。
   1. 在成像日（成年期的第4，6，8和10天），选择20只动物并安装在含有3%琼脂糖垫的显微镜载玻片上，其中5μL滴10mM叠氮化钠（在M9缓冲液中稀释）。
   2. 在所有动物被叠氮化钠固定（〜5分钟）后，使用40倍放大镜拍摄动物头部的z堆叠图像（图2A）。成像后丢弃载玻片。
   3. 采集图像后，处理z-stack以获得最大投影，并用于量化位于神经环区域的神经元中的病灶数量。焦点是较亮的标点信号，可以与背景中较暗的可溶性信号区分开来。
      注意:我们专门选择了神经环区域来量化 rgef-1p::p olyQ::YFP 聚集体，因为这是大多数神经元收敛以进行突触连接的区域。然而，为了测量运动神经元中聚集体形成的水平，可以量化位于背侧或腹侧神经索上的 rgef-1p::p olyQ::YFP 聚集体。
   4. 绘制YFP病灶从D4，D6，D8和D10积累的进展。在XY图上执行此操作，其中X表示成年期的天数，Y表示 rgef-1p::p olyQ::YFP 病灶的数量（图2B）。将实验条件下的病灶数量（例如，基因下调或过表达）与对照动物进行比较。神经元病灶计数的统计分析与肌肉polyQ病灶相同;请参阅步骤 4.1.4 和相关说明。
2. 测量身体弯曲作为神经元中聚谷氨酰胺蛋白毒性的替代测量。
   注意:神经元polyQ的渐进聚集积累诱导的蛋白质毒性应激是通过通过冲击测定观察运动神经元缺陷来确定的。量化在M9生理缓冲液中悬浮30秒内身体弯曲的次数（补充文件1）。
   1. 在成年期的第2天，从板中挑选10个同步的动物，并将10μLM9缓冲液滴在显微镜载玻片上。重复此步骤至少四次，以获得40个或更多动物的样本。
   2. 用10μL M9缓冲液在具有视频功能的相机的立体显微镜上记录放置在显微镜载玻片上的10只动物的运动30秒。重复此步骤 4 次，样本总数为 40。应调整缩放和位置，使所有动物在画面中可见整整30秒。
   3. 录制所有要分析的动物的视频后，播放视频并对每只动物的身体弯曲进行评分。一个身体弯曲被定义为当动物的外阴从一侧到另一侧并一直回到起始位置时。
      注意:我们发现野生型动物通常在30秒内有49±0.79次身体弯曲。
   4. 在柱形图中绘制每只动物的身体弯曲次数，其中每个点表示在X轴上测试的不同条件下在30秒（Y轴）内的身体弯曲次数。将 unc-54p::p olyQ::YFP 动物的身体弯曲次数与对照动物进行比较（图2C）。对每个试验在各组之间独立进行统计分析;如果在多个时间点重复测定，请独立分析每个时间点的数据。
      1. 当仅考虑两个条件时，执行独立样本 t 检验。
      2. 当同时考虑两个以上的条件时，首先执行综合单因素方差分析，包括该时间试验/时间点的所有条件的数据。如果综合方差分析产生显著的 p 值（即 p < 0.005），则使用成对的独立样本 t 检验执行 事后 分析，以确定检测到体弯曲计数显著差异的特定条件。

结果

在秀丽隐杆线虫中，聚谷氨酰胺重复模型在鉴定调节蛋白质静膜网络的基因方面起到了重要作用。例如，我们之前表明，同源域相互作用蛋白激酶（hpk-1）是一种转录辅因子，通过调节自噬和分子伴侣的表达来影响衰老过程中的蛋白质稳态^31。我们发现，hpk-1的损失，无论是通过RNAi沉默还是在hpk-1（pk1393）空突变动物中，都会增加衰老过程中积累的Q35::YFP聚集体的数量。第2天成年对照动物显示18.0±2.7个聚集体，而hpk-1（pk1393）空突变体和hpk-1 RNAi处理的Q35::YFP动物平均为28±5.3和26.0±5.1个聚集体（图3A-D）。同样，到成年期第8天，77-78%的hpk-1（RNAi）和hpk-1（pk1393）动物瘫痪，而50%的对照Q35::YFP动物...

讨论

衰老的特征是蛋白质稳态逐渐下降。蛋白质稳态由一个复杂的系统（蛋白质静力学网络）维持，用于蛋白质折叠、降解和翻译的协调、动态、应激响应控制。为什么蛋白质稳态在衰老过程中会失败尚不清楚，但表观基因组的衰变，应激反应的可诱导性下降以及代偿性串扰的丧失都与这种崩溃相吻合。在秀丽隐杆线虫中，由于在应激位点^2，34，35处形成抑制性染色质标记，因此在繁殖开始后几个小时内，多种形式的应激反应的转录诱导性迅速下降。蛋白质稳态塌陷是一个巨大的临床问题，因为它是蛋白质错误折叠疾病发展的基础。因此，拥有一种适合遗传分析的方法来量化体内细胞蛋白质平衡对于更深入地了解生物体如何保持蛋白质组的适当折叠和功能至关重要。

具有多谷氨酰胺荧光报告基因组织特异性表达的转基因秀丽隐杆线虫是研究蛋白稳态年龄依赖性下降的有效而稳健的方法。聚谷鲁他明模型的两个最突出的好处是:（1）组织特异性表达与强大的遗...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔培养板	Greiner Bio-One	#662102
2 mL 96 孔板	Greiner Bio-One	#780286
600 µL 96 孔板	Greiner Bio-One	#786261
96 针板复制器	Nunc	250520
透气板密封	VWR	60941-086
细菌琼脂	Affymetrix/USB	10906
细菌蛋白胨	VWR	90000-368
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Ahringer	来源 生物科学	秀丽隐杆线虫 RNAi 集合 （Ahringer）	另见 Kamath 等人，Nature 2003。
HT115 细菌中的秀丽隐杆线虫 RNAi 克隆文库 - Vidal	Source Bioscience	秀丽隐杆线虫 ORF-RNAi 资源 （Vidal）	另见 Rual 等人，基因组研究 2004 年。这个库也可以从 Dharmacon 获得。
FuDR（5-氟-2'-脱氧尿嘧啶）	Alfa Aesar	L16497
玻璃显微镜盖玻片	VWR	48404-455
玻璃显微镜载玻片	VWR	160004-422
IPTG（异丙基 β-D-1-噻半乳糖吡喃糖苷）	Gold Bio	12481C100
Retangular 未处理单孔板，128x86mm	Thermo-Fisher
叠氮化钠，CAS #26628-22-8	Sigma-Aldrich	S2002
蔡司 Axio 成像仪 M2m 显微镜，带 AxioVision v4.8.2.0 软件	蔡司	未知
司 StemiSV11 M2 生物四边形显微镜	蔡司	未知