小鼠心脏移植袖套法的技术优化

摘要

我们介绍一种内管辅助的套管技术，用于小鼠颈部异位心脏移植，以帮助将血管外翻覆盖在套管上。我们发现，两名经验丰富的外科医生相互配合可显著缩短手术时间。

摘要

小鼠心脏移植手术已有40多年的历史。随着显微外科技术的进步，一些新技术已被用于提高手术效率。在我们的实验室中，我们对套管技术进行了两项主要优化。首先，我们采用内管技术，将一根临时内管插入颈外静脉和颈总动脉血管中，以方便将血管外翻覆盖在套管上。其次，我们通过两名经验丰富的外科医生协作，完成完全异位心脏移植。这些改进措施将手术时间有效缩短至25分钟，成功率高达95%。在本报告中，我们详细描述了这些操作步骤，并提供了补充视频。我们认为，本篇关于改进型套管技术的报告将为小鼠异位心脏移植提供实用的操作指导，并提升该小鼠模型在基础研究中的应用价值。

引言

1973年，通过在腹部进行端对端吻合的小鼠异位心脏移植模型的建立，是基础移植免疫学研究中的一个重要里程碑¹。该模型为分析缺血再灌注损伤²、免疫排斥反应以及免疫耐受的机制提供了重要且有效的工具^3,4。然而，该手术操作复杂且耗时较长，加之存在感染风险，可能导致严重的围手术期腹腔粘连和炎症反应，从而导致异位心脏移植模型的建模效率较低。

颈动脉异位心脏移植技术最初由Chen于1991年描述⁵。在此模型中，受体的颈外静脉与移植物的肺动脉吻合，颈总动脉与移植物的升主动脉吻合。该方法的主要优点在于便于监测，并可减少对受体的创伤。同年，Matsuura描述了一种改进的技术，即将受体颈外静脉和颈总动脉的断端外翻至聚四氟乙烯（Teflon）套管上，并用环形丝线结扎固定⁶。一些研究人员在将套管插入受体颈外静脉之前，还会先将其固定于供体心脏的右肺动脉上⁷。迄今为止，套管技术已广泛应用于多种带血管蒂的器官移植模型中，包括肺⁸、肝⁹和肾¹⁰移植。

迄今为止，套管技术存在若干困难。例如，由于颈动脉具有额外的弹性，难以将其翻转至套管上，容易导致组织向后翻折。因此，完成此步骤可能需要额外的练习以及显微外科扩张器。此外，颈部血管的准备工作可能耗时长达25分钟。

为解决这些问题，我们引入了内管技术，该技术基于套管法，通过使用内管将套管固定于颈外静脉和颈动脉上，以辅助血管壁的外翻。此外，经过简单培训后，受体准备时间可缩短至15.5分钟。该技术降低了手术复杂性，无需额外练习或使用血管扩张器。该方法可广泛应用于所有移植免疫学研究，尤其适用于验证第三方免疫耐受的研究，即受体动物接受两个心脏异体移植物，一个位于腹腔，另一个位于颈部¹¹。我们还建议由两位熟练的外科医生协作建立该模型，其中一位负责受体动物的准备，另一位负责供体心脏的获取与移植。这种合作模式可将手术总时间缩短至25分钟。通过这一优化的操作流程，我们已成功建立了同系、同种异体^{12,13,14,15,16,17,18,19}以及异种小鼠心脏移植模型²⁰。

建立内管技术的原理在于缩短小鼠心脏移植模型的手术时间，同时保持较高的成功率。与传统的缝合和套管技术相比，颈段心脏移植模型的优化有助于在较短的手术时间内获得较高的成功率²¹。此外，双人协作手术模式相较于单人操作，可进一步缩短供体心脏的热缺血时间。

方案

动物（BALB/c、C57BL/6，雄性，8–12周龄）饲养于厦门大学实验动物中心的特定病原体-free设施中。C57BL/6用作受体，BALB/c用作供体。所有操作均依照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行。

注意：手术需要一套显微外科器械，包括显微剪刀、显微直镊、显微弯镊和显微持针器（表格与材料，图1B, C, D, E）。需要一对一次性使用的小型鳄嘴钳（图1F）。在显微镜下使用10号手术刀片切割定制的聚酰胺管，制备用于颈外静脉和颈总动脉的两个套管。静脉和动脉套管的直径分别为0.9 mm和0.55 mm。此外，相应静脉套管内管的直径为0.6 mm，相应动脉套管内管的直径为0.28 mm（图1G）。

1. 受体准备

1. 使用戊巴比妥（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉受体小鼠。使用无创机械剪毛器去除右侧颈外侧区域的毛发。
2. 用无菌棉签蘸取碘伏对手术区域进行消毒，随后用70%乙醇擦拭。
3. 将小鼠仰卧位固定于手术平台，用无菌纱布覆盖小鼠身体。
4. 使用眼科剪从颈部下三分之一中线处横向剪开，切口延伸至右侧肩锁关节。
5. 用显微弯镊分离右侧颈外静脉，充分暴露其长度，通过电凝切断分支，并在远端用6-0丝线结扎血管。
6. proximally）用蚊式钳夹闭颈外静脉，随后用显微剪在结扎线近端横断静脉。
7. 用100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水冲洗血管腔，以清除残留血液。
8. 用显微直镊将颈外静脉通过静脉套管引出，将静脉内管插入血管腔作为支架，并用显微直镊将血管壁外翻覆盖在套管上（图2A）。
9. 用环形8-0丝线在套管近端固定外翻的血管内皮（图2B）。
10. 用显微直镊将静脉内管从血管中抽出。
11. 用显微弯镊钝性分离，暴露位于胸锁乳突肌内侧缘附近的右侧颈总动脉。
12. 用蚊式钳近端夹闭右侧颈总动脉，远端用6-0丝线结扎，并用显微剪在结扎线近端横断颈总动脉。
13. 用100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水冲洗颈总动脉，以清除残留血液。
14. 用显微直镊将颈总动脉穿过动脉套管，并将动脉内管插入动脉血管内（图2C）。
15. 用显微直镊将血管外翻覆盖在套管上，并用环形8-0丝线固定外翻的血管内皮（图2D）。
16. 用显微直镊将动脉内管从动脉血管中抽出。
    注意：保留受体小鼠的下颌下腺。

2. 供体准备

1. 用戊巴比妥（60 mg/kg，腹腔注射）麻醉供体小鼠。使用无创机械剪毛器去除腹部区域的毛发。
2. 将小鼠仰卧位固定于手术台上，并用无菌纱布覆盖小鼠。
3. 用无菌棉签蘸取碘伏消毒剂擦拭手术区域，随后用70%乙醇脱碘。
4. 使用眼科剪在腹部正中线做切口，暴露腹腔。
5. 用显微弯镊暴露下腔静脉，然后经下腔静脉静脉注射每20 g体重200 μL、100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水。
6. 使用眼科剪行胸廓切开术，经双侧腋中线切口剪断肋骨，将前胸壁向外翻转以暴露胸腔。
7. 用显微弯镊切除胸腺。
8. 暴露主动脉，经主动脉弓向冠状动脉灌注200 µL、100 U/mL、0–4 °C的肝素化生理盐水。
   注意：避免将任何气泡灌注入供体心脏。
9. 使用显微剪在主动脉弓起始处横断升主动脉。
10. 使用显微剪在左右肺动脉主干起始处分叉处横断肺动脉。
11. 使用6-0丝线近端结扎上腔静脉和下腔静脉，并用显微剪在结扎线远端剪断静脉。
12. 使用单根6-0丝线环形结扎所有肺静脉，然后用显微剪在结扎线远端剪断肺静脉分支。
13. 将心脏移植物从周围软组织中游离取出，并保存于0–4 °C的肝素化生理盐水中。

3. 心脏移植

1. 将供体心脏倒置于受体的右侧颈部区域。
2. 使用微型直镊将供体心脏的肺动脉穿入6-0丝线环中。
3. 将血管腔包裹在静脉套管上，然后收紧6-0丝线缝合环，固定套管以结扎血管吻合口。
4. 按照步骤3.2所述方法，完成移植物主动脉与动脉套管的吻合。
5. 依次松开夹闭的颈静脉和颈动脉。保持血管吻合口无扭曲，并确保血流通畅。
   注：若窦性心律在1分钟内恢复至200次以上，视为正常。
6. 用预热（37 °C）的生理盐水湿润供体心脏，检查移植物是否出血。将搏动的心脏移植物置入皮下腔隙，随后缝合切口。

4. 术后护理与移植物评估

1. 记录复灌后恢复窦性心律的时间，以及夹闭解除后至少维持5分钟正常窦性心律的情况，以监测术后移植物功能。
2. 将受体单独置于保温毯上，直至其从麻醉中苏醒。手术结束时皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.05 mg/kg），术后每12小时给药一次，持续72小时。
3. 每日记录受体体重及术后恢复状况。若体重较手术当日下降>15%，或出现偏瘫、感染等情况，应通过终末期异氟烷吸入实施安乐死²¹。
4. 每日通过触诊监测移植物存活情况。若小鼠同种异体移植物存活超过>72小时，则视为手术成功。移植物功能评分参照既往报道²²：3级——搏动有力且频率正常；2级——搏动减弱；1级——颤动并即将发生排斥；0级——心脏停搏且完全排斥。

结果

手术操作时间

经过训练后，熟练的外科医生使用内管技术可在35分钟内成功完成手术，其中受体准备约需15.5分钟，供体准备需10.9分钟，供体心脏吻合需4.4分钟。与使用套管技术但未使用内管技术及缝合技术的手术相比，冷缺血和热缺血时间（从供体准备到心脏植入）缩短至15.3分钟（表1）²¹。

我们设计了一种协作模式，以进一步提高操作效率。如示意图所示（图3），一名外科医生首先开始进行受体准备，4-5分钟后，另一名外科医生开始供体准备工作。约15-16分钟后，第一位外科医生应已完成受体准备，此时第二位外科医生也已完成供体心脏的获取，随即开始将供体心脏在受体体内进行吻合。该协作模式要求每位外科医生仅需接受套管技术中单一环节的培训，从而进一步将总手术时间缩短至约25分钟。一项分析显示 >过去两年间，厦门大学器官移植研究所的两位外科医生合作完成了600例异位小鼠...

讨论

小鼠心脏移植模型是移植免疫学研究的重要工具，可用于评估该模型的免疫机制，并且有大量基因修饰小鼠可供使用。然而，由于显微外科技术上的挑战，例如血管缝合与外翻操作，限制了该模型的广泛应用。在本研究中，我们探讨了小鼠心脏移植中某些核心技术难题，并取得了良好的结果。该方案中的一个关键步骤是将内管插入管腔作为支架，使血管壁能够翻转至套管外。这一优化步骤解决了因需要大幅拉伸而导致动脉血管外翻困难的技术问题。即使没有显微外科经验的人员，在经过两个月的培训后也可开始实施该技术，这将有助于推动该模型的广泛使用。

根据我们的经验，合适的内管可提高移植效果。内管的外径应略小于受体血管的内径。此外，应使用表面光滑的钝头聚丙烯管或圆筒作为临时内核，以避免损伤血管内皮。在我们的操作中，即使吻合口血栓形成是使用缝合技术后失败的主要因素，但在失败的5%模型中并未发生血栓。利用这些成熟的小鼠模型，我们的实验室已发表多篇基础研究论文，并得到了同行评审专家的认可^14,15,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动脉套管	自制		聚酰胺管，直径：0.55 mm，长度：1.0 mm
动脉内管	自制		聚酰胺管，直径：0.28 mm
显微弯镊	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	WA3050	1/8 弧形，尖端宽度：0.3 mm，无钩
显微持针器	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	WA2050	尖端宽度：0.2 mm
显微剪刀	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	WA1050	直型，刀刃长度：10 mm
显微直镊	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	WA3060	尖端宽度：0.15 mm，无钩
Scanlan Vascu-Statt 血管夹	Scanlan International Inc	1001-531	夹闭压力：20–25 克
静脉套管	自制		聚酰胺管，直径：0.9 mm，长度：1.2 mm
静脉内管	自制		聚酰胺管，直径：0.6 mm