利用原子力显微镜-扫描电化学显微镜联用技术（AFM-SECM）探究纳米材料表面电化学活性

摘要

原子力显微镜（AFM）与扫描电化学显微镜（SECM）联用技术，即AFM-SECM，可用于在纳米尺度上同时获取材料表面的高分辨率形貌和电化学信息。此类信息对于理解纳米材料、电极和生物材料局部表面的异质性特性（如反应性、缺陷和反应位点）至关重要。

摘要

扫描电化学显微镜（SECM）用于测量液/固、液/气和液/液界面的局部电化学行为。原子力显微镜（AFM）是一种多功能工具，可用于表征微米和纳米结构的形貌及力学性能。然而，传统的SECM或AFM在纳米尺度上对电学或电化学性质的横向分辨信息有限。例如，传统电化学方法难以分辨纳米材料表面在晶面水平上的活性。本文报道了AFM与SECM联用技术（即AFM-SECM）的应用，可在获取高分辨率形貌数据的同时探测纳米尺度表面的电化学活性。此类测量对于理解纳米结构与反应活性之间的关系至关重要，该关系涉及材料科学、生命科学和化学过程中的广泛应用。通过分别对具有晶面结构的纳米颗粒（NPs）和纳米气泡（NBs）的形貌和电化学性质进行成像，展示了AFM-SECM联用技术的多功能性。与此前报道的纳米结构SECM成像相比，该AFM-SECM技术能够以更高的表面成像分辨率实现对局部表面活性或反应性的定量评估。

引言

对电化学（EC）行为的表征能够为生物学^1,2、能源^3,4、材料合成^5,6,7以及化学过程^8,9等多个领域中界面反应的动力学和机理提供关键见解。传统的电化学测量方法，包括电化学阻抗谱¹⁰、电化学噪声法¹¹、恒电流间歇滴定技术¹²和循环伏安法¹³，通常在宏观尺度上进行，提供的是表面平均响应。因此，难以获取电化学活性在表面分布的具体信息，而纳米尺度下的局部表面特性在纳米材料广泛应用的背景下尤为重要。因此，亟需发展能够同时捕捉纳米尺度多维信息与电化学信号的新技术。

扫描电化学显微镜（SECM）是一种广泛用于在微米和纳米尺度上测量材料局部电化学活性的技术¹⁴。通常，SECM使用超微电极作为探针，在扫描样品表面时检测电活性化学物质，从而在空间上解析局部电化学特性¹⁵。探针上测得的电流由媒介体物种的还原（或氧化）产生，该电流是样品表面电化学反应活性的指标。自1989年首次提出以来^16,17，SECM已取得显著发展，但仍面临两个主要局限性。由于电化学信号通常对探针-基底相互作用特性敏感，SECM的一个局限性在于，将探针保持在恒定高度会因形貌与所采集的电化学信息相互卷积，而难以将电化学活性与表面形貌直接关联¹⁸。其次，商用SECM系统难以获得亚微米（µm）级的图像分辨率，因为其空间分辨率部分取决于探针尺寸，而探针尺寸通常在微米量级¹⁹。因此，纳米电极（即直径处于纳米量级的电极）在SECM中正被越来越多地使用，以实现亚微米以下的分辨率^20,21,22,23。

为了实现恒定的探针-基底距离控制并获得更高的空间电化学分辨率，已采用多种扫描电化学显微镜（SECM）的混合技术，例如离子导电定位²⁴、剪切力定位²⁵、交流SECM²⁶以及原子力显微镜（AFM）定位。在这些仪器技术中，集成AFM定位的SECM（AFM-SECM）已成为一种极具前景的方法。由于AFM能够提供固定的探针-基底距离，集成化的AFM-SECM技术可通过尖锐的AFM探针进行表面扫描或样品扫描，同步获取纳米尺度的表面结构信息和电化学信息。自MacPherson和Unwin于1996年首次成功实现AFM-SECM操作以来²⁷，在探针设计与制备方面已取得显著进展，并广泛应用于化学和生物过程中的电化学研究等多个领域。例如，AFM-SECM已被用于成像复合材料表面，如贵金属纳米颗粒²⁸、功能化或尺寸稳定的电极^29,30以及电子器件³¹。AFM-SECM可通过探针电流图像绘制出电化学活性位点的分布图。

其他技术（如导电原子力显微镜）也可实现表面形貌与电化学测量的同步进行^32,33,34,35，电化学原子力显微镜（EC-AFM）^36,37,38,39扫描离子电导显微镜-扫描电化学显微镜（SICM-SECM）^24,40，以及扫描电化学池显微镜（SECCM）^41,42 这些技术之间的比较已在一篇综述论文中进行了讨论¹本研究旨在利用扫描电化学显微镜-原子力显微镜（SECM-AFM）对水中具有晶面结构的氧化亚铜纳米材料及纳米气泡进行电化学成像与测量。由于不同晶面具有独特的晶体学特征，因而呈现出不同的表面原子结构，并进一步决定其催化性能，因此具有晶面结构的纳米材料被广泛应用于清洁能源领域的金属氧化物催化剂中。此外，我们还对金基底表面纳米气泡（NBs）在液/气界面处的电化学行为进行了测量与比较。纳米气泡是指直径在 <1 μm（也称为超细气泡）⁴³，并引发多种有趣的特性^44,45，包括在溶液中较长的停留时间^46,47 和高 气体传质效率^46,48此外，空化泡的崩塌会产生冲击波以及羟基自由基（•OH）的形成^49,50,51,52我们测定了溶液中氧气纳米气泡的电化学反应活性，以更深入地理解纳米气泡的基本化学性质。

方案

1. 样品制备

1. 制备多面体铜₂O 纳米颗粒及其在硅基底上的沉积
   1. 溶解 0.175 g CuCl₂∙2H₂将99.9%的O溶于100 mL去离子水（DI水）中，制备10 mM CuCl的水溶液₂.
   2. 加入 10.0 mL 2.0 M NaOH 和 10 mL 0.6 M 抗坏血酸，逐滴加入 CuCl 中₂ 溶液
   3. 在55 °C水浴中，将溶液置于250 mL圆底烧瓶内，持续搅拌加热3 h。
   4. 通过离心收集所得沉淀（5,000 x g 15分钟），随后用去离子水洗涤3次，乙醇洗涤2次，以去除残留的无机离子和聚合物。
   5. 60 °C 真空干燥沉淀物 5 小时⁵³.
   6. 使用制备好的硅片作为基底沉积铜₂O纳米颗粒，如图所示 图1A 使用环氧树脂以确保测试的可靠性。
      注意：硅晶圆（Ø3” Silicon wafer, Type P/<111>) 被切割成一块 38 mm × 38 mm 的单片，随后用乙醇、甲醇和去离子水清洗，以去除有机和无机污染物。
   7. 使用移液枪头将10 µL环氧树脂直接滴加至经清洁的硅片上，并用洁净的玻璃盖片铺平。约5分钟后，滴加10 µL纳米颗粒/水悬浮液（10 mg L⁻¹）^-1在不同的环氧涂层硅晶片基底上分别进行。图中所示的四个不同红色斑点 图1B 指示沉积纳米颗粒的潜在位置。
   8. 在40 °C下真空干燥基底6 h。
   9. 将样品基底放入电化学样品池中（图4) 加入 1.8 mL 含 10 mM Ru(NH₃)₆³⁺ 的 0.1 M KCl 溶液₃)₆Cl₃(98%).
2. NBs 的制备
   1. 通过将压缩氧气（纯度99.999%）直接注入去离子水中，经由管状陶瓷膜（孔径100 nm，WFA0.1）生成氧纳米气泡。
      注意：气体在414 kPa的压力和0.45 L·m的流量下持续注入^-1 直至达到稳定的气泡尺寸分布，具体方法见其他文献报道⁵⁴.
   2. 在电化学样品池中加入1.8 mL的金基底纳米气泡水悬浮液，稳定10分钟。
      注意：使用新鲜的 40 mm × 40 mm 金片（Si 上的 Au）作为固定纳米体（NBs）的基底。
   3. 将 0.9 mL NB 悬液倾去，加入 0.9 mL 10 mM Ru(NH₃)₆Cl₃ 0.1 M KCl 溶液

2. 原子力显微镜-扫描电化学显微镜（AFM-SECM）的设置

注意：在本研究展示的原子力显微镜-扫描电化学显微镜（AFM-SECM）测量中使用了原子力显微镜（AFM）。为进行电化学（EC）分析，AFM 配备了双恒电位仪和 SECM 附件。如图 S1所示，双恒电位仪连接至 AFM 控制器，且恒电位仪与 AFM 均连接至同一台计算机。附件包括 SECM 卡盘、带保护套的 SECM 探针 holder，以及带有电阻选择器的应变释放模块（使用 10 MΩ 电阻）以限制最大电流流动⁵⁵。如图 2所示，AFM-SECM 探针的针尖半径为 25 nm，针尖高度为 215 nm。样品作为工作电极，与银丝电极（直径 25 mm）共用同一个伪参比电极，并以铂丝（直径 25 mm）作为对电极。探针与样品可相对于银丝伪参比电极施加不同的偏压，以实现不同的氧化还原反应。在本研究中，探针在相对于银丝伪参比电极为 -400 mV 的电位下将 [Ru(NH₃)₆]³⁺ 还原为 [Ru(NH₃)₆]²⁺。

1. 使用两个 M3 × 6 mm 内六角圆柱头螺钉和一把 2.5 mm 六角扳手，将现有的样品台更换为 SECM 样品台，并将样品台固定到位（图 3A）。
2. 将温度控制电缆连接至 SECM 样品台，并将低噪声 SECM 电缆按颜色对应连接至弹簧连接块和开关块（图 3B）。
   注意：SECM 测试期间，开关必须保持在右侧。
3. 将应变释放模块安装到 AFM 扫描器上，并使用延长电缆将其连接至弹簧连接块上的工作电极连接器（图 3C）。
4. 组装电化学样品池。
   1. 将插入件放置在上环上（图 4A）。
   2. 分别将两个 O 型圈安装到插入件的下凹槽和上凹槽中（图 4B 和 图 4C）。
   3. 将一块玻璃盖片放在上环顶部，然后用四个螺钉轻轻对角拧紧（图 4D）。
   4. 使用直径为 24 mm 的硬质尖锐金属丝（图 4E），通过上环塑料部件上的两个通道，在 O 型圈上穿出两个孔（图 4F）。
   5. 将银丝和铂丝分别穿过 O 型圈上的孔，并将铂丝在电化学样品池内弯成圆形，如 图 4G 所示。
   6. 为密封电化学样品池的上部，将组装好的电化学样品池向下压紧至电化学样品池底部，使 O 型圈与玻璃盖片完全接触（图 4H）。
   7. 将电化学样品池的上部倒置，使待测样品（或基底）朝下，确保弹簧加载针（pogo pin）接触样品表面，如 图 4I 和 图 4J 所示。待测样品应覆盖 O 型圈，以实现电化学样品池底部部分的密封。
   8. 将电化学样品池底部装上，并使用长度合适的螺钉对角拧紧（图 4K）。

3. 原子力显微镜-扫描电化学显微镜（AFM-SECM）的操作

1. AFM 与双恒电位仪仪器的初始化
   1. 双击两个软件图标，以初始化 AFM 系统和双恒电位仪控制界面。
2. 加载 SECM 探针
   1. 准备静电放电（ESD）现场服务包，包括防静电垫、静电放电（ESD）防护探针架、可穿戴防静电手套和腕带（图 5A）。图 5B 显示了 ESD 监测仪与腕带的连接方式。
      注意：当红色垫片接地时，ESD 监测仪会发出蜂鸣声；当使用者佩戴腕带后，蜂鸣声将停止。
   2. 为防止 AFM 扫描器接触液体，应在 AFM-SECM 测试期间使用保护套（图 6A）。将探针架放置在 ESD 防护探针架上（图 6B）。使用一对塑料镊子将保护套安装到探针尖端架上（图 6C）。然后，将保护套上的小切口对准探针架上的凹槽，如 图 6D 所示。
   3. 使用绿色尖端镊子夹住 AFM-SECM 探针盒（图 7A）中探针两侧的凹槽，打开探针盒（图 7B）。同时使用银色圆盘夹具固定支架上的探针架，并将探针导线插入支架孔中，然后将探针滑入探针架的插槽内（图 7C）。探针进入插槽后，使用镊子的平头端将其推紧，确保探针完全插入探针架内（图 7D）。
   4. 如 图 8A 所示，将整个探针架（包括支架和保护套）安装到扫描器上。
   5. 使用聚四氟乙烯尖端镊子夹住铜环下方的导线，并将其连接至模块（图 8B）。
   6. 将扫描器重新放回燕尾槽中。
3. 加载样品池
   1. 在完成第 2.4 节所述的测试样品（或基底）组装后，将电化学（EC）样品池放置在 SECM 卡盘的中心位置，并将伪参比电极（Ag 丝）以及对电极（Pt 丝）连接至弹簧连接块（图 3）。EC 样品池通过磁力固定在卡盘上。
4. 成像前的 SECM 软件准备
   1. 在 AFM-SECM 软件中，选择 SECM-PeakForce QNM 以加载工作区（图 S2）。
   2. 在 Setup 中加载 SECM 探针，然后使用对准站将激光对准探针尖端。
   3. 进入 Navigation（图 S3），缓慢向下移动扫描器以聚焦样品表面。轻微调整 EC 样品池的位置，确保扫描器移动时不会触碰到 EC 样品池的玻璃盖。聚焦样品后，点击 Update Blind Engage Position。
      注意：不同样品的高度不同，因此更换样品后必须更新盲进位置。
   4. 点击 Move to Add Fluid Position。
   5. 向 EC 样品池中加入约 1.8 mL 缓冲溶液，确保液面低于玻璃盖。若液面超过玻璃盖，液体可能爬升至扫描器，导致短路并损坏设备。等待 5 分钟后，使用移液器搅动溶液以去除气泡。
      注意：缓冲溶液（含 0.1 M KCl 支持电解质的 10 mM [Ru(NH₃)₆]³⁺）配制后应持续冷藏保存。使用孔径不超过 1 µm 的滤膜注射器过滤溶液后再使用。
   6. 点击 Move to Blind Engage Position，探针将重新进入缓冲溶液。轻微调整激光，确保其准确对准探针尖端。
   7. 打开 CHI 软件。如 图 S4 所示，点击工具栏上的 Technique 命令打开技术选择器，并选择 Open Circuit Potential – Time。使用默认设置（运行时间为 400 s）进行开路电位（OCP）测量并开始测试。
      注意：OCP 测试显示的电位应稳定接近于零。
   8. 再次点击 Technique 命令并运行 循环伏安法（CV），如 图 S5 和图 S6 所示。
      注意：参数设置如下。根据需要可将“sweep segments”设为较大数值。“init E/Final E”应与 OCP 测量所得电位值相同，“High E”和“Low E”可分别设为“init E/Final E”±0.3 V。此处以 0 V 作为初始电位和高电位，-0.4 V 作为低电位和终态电位。扫描速率为 0.05 V/s，灵敏度为 1e-009。运行 CV 测试时，10 mM [Ru(NH₃)₆]³⁺ 的最大电流（i）应在 0.3–1.2 nA 范围内。
5. SECM 成像
   1. 返回 AFM-SECM 软件。由于探针已处于液体中，点击 Engage。
   2. 扫描完成后，开启抬升模式（Lift by Sensor），设定抬升高度为 100 nm，并根据样品粗糙度调整抬升高度。
   3. 在 CHI 软件中运行计时安培法，参数如 图 S7 所示。设置初始电位为 -0.4 V，脉冲宽度为 1000 秒（系统允许的最大值），灵敏度与 CV 扫描相同。
      注意：由于所用双恒电位仪不支持安培 i-t 技术，因此选用计时安培法。
   4. 在 CHI 程序运行的同时，返回 AFM-SECM 软件，查看条形图上的实时读数，并点击 Start（图 S8）。读数将实时更新，随后形貌成像和电流成像过程将同时开始。在 AFM-SECM 软件中保存图像。
6. 检查逼近曲线
   1. 在样品或基底区域以 1 µm 的扫描尺寸使探针接触表面。
   2. 运行第 3.5.3 节所述的 计时安培法。
   3. 返回 AFM-SECM 软件，选择命令 Go To Ramp。
   4. 点击 Ramp，AFM-SECM 软件将记录一条逼近曲线。
7. 探针清洗
   1. 将 EC 样品池用作去离子水容器。使用导航面板中的盲进功能使探针反复进出液体。更换去离子水三次。完成三次清洗后，使用洁净擦拭布小心擦去探针架上的残留水分，并将探针放回探针盒中。
      注意：成像结束后，必须小心清洗 AFM-SECM 探针。切勿使用洗瓶喷出的水流清洗探针，因为静电可能损坏探针。

结果

利用原子力显微镜-扫描电化学显微镜对嗅鞘细胞进行形貌与电流成像

以往利用原子力显微镜（AFM）对纳米气泡（NBs）进行表征的研究仅报道了形貌图像，以揭示固定在固体基底上纳米气泡的尺寸和分布情况^56,57。本实验则同时获得了纳米气泡的形态学和电化学信息。在图9中可清晰识别出单个氧气纳米气泡（ONBs），该图提供了形貌以及探针电流映射或相关信息。探针电流由[Ru(NH₃)₆]³⁺的氧化还原反应产生，在-0.4 V偏压下，该物质在探针端被还原为[Ru(NH₃)₆]²⁺，如图9C所示。形貌图像与电流图像的对比显示，纳米气泡的位置与电流信号点之间具有良好的对应关系。该结果证实，当AFM-SECM...

讨论

本方案描述了一种结合原子力显微镜与扫描电化学显微镜（AFM-SECM）的技术，可实现高分辨率的多模式成像。该技术能够在单个纳米颗粒或纳米气泡上同时获取表面形貌信息以及所收集或映射的SECM电流。实验采用商用探针进行，这些探针设计用于在广泛的电化学环境中实现化学兼容性、优异的电化学性能、机械稳定性以及多次循环操作的耐久性¹⁸。然而，AFM-SECM探针的稳定性和耐久性对于可靠且高分辨率地测量电化学信息至关重要。因此，步骤3.2和3.7中所述的操作步骤对于防止AFM-SECM针尖因静电放电而损坏尤为关键。本文还对特定实验步骤的相关细节进行了详细讨论。

在步骤 3.4.5 中，所展示的测试使用了含 0.1 M KCl 支持电解质的 10 mM [Ru(NH₃)₆]³⁺。文献中通常采用 5–10 mM 的 [Ru(NH₃)₆]³⁺ 浓度以获得良好的电流信号³⁰。AF...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
原子力显微镜	Bruker, CA	Dimenison Icon
双恒电位仪	CH Instruments, Inc.	CHI 700E
材料
硅晶圆	TED PELLA, Inc.	16013
新鲜金片	Bruker, CA	model 119-017-307
PF-SECM-AFM 探针	Bruker, CA	990-050138
PF-SECM 应变释放模块	Bruker, CA	840-012-724
PF-SECM 探针夹持器	Bruker, CA	900-050121
PF-SECM 卡盘	Bruker, CA	PF-SECM Chuck
PF-SECM O型圈	Bruker, CA	598-000-106
PF-SECM 盖玻片，SECM 电解池	Bruker, CA	900-050137
EC 电解池组件	Bruker, CA	932-017-300
ESD 现场服务模块	Bruker, CA	490-000-066
PF-SECM 保护套	Bruker, CA	900-050136
弹簧连接块	Bruker, CA	900-050524
PF-SECM 镊子	Bruker, CA
SECM 探针模块电缆	Bruker, CA	468-050171
银丝	Bruker, CA	249-000-056
铂丝	Bruker, CA	248-000-004
硬质尖锐导线	Bruker, CA	TT-ECM10
管状陶瓷膜	Refracton	WFA0.1
化学品
二水合氯化铜(II)	ACROS Organics	AC315281000
氢氧化钠	Fisher Chemical	S318-100
抗坏血酸	Fisher Chemical	A61-25
环氧树脂	Loctite	Instant Mix
氯化钾	Fisher Chemical	P217-500
三氯六氨合钌(III)	ACROS Organics	AC363342500