需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

3.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61112

⸱

2020年5月31日

 , 
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

本方案可在封闭环境中测定埃及伊蚊（Aedes aegypti）种群对特定病毒（如寨卡病毒）的传播能力。

摘要

本文所述方法介绍了一种在实验室条件下使埃及伊蚊（Aedes aegypti）感染寨卡病毒的通用实验流程，用于测定该蚊虫种群的感染率、播散性感染率以及病毒的潜在传播能力。这些方法在全球范围内的媒介传播能力评估中被广泛应用，并根据具体研究需求进行了多种改进。该方法对于确定特定蚊虫（即物种、种群或个体）在特定病原体传播过程中可能发挥的作用具有重要意义。

引言

媒介能力（vector competence）是指特定节肢动物（如蚊子、蜱或白蛉）在物种、种群甚至个体水平上，通过在节肢动物体内进行复制或发育，生物学性地获取并传播病原体的能力1,2。对于蚊子和节肢动物传播的病毒（即虫媒病毒，arboviruses），雌性蚊子从病毒血症宿主体内吸食摄入病毒。摄入后，病毒必须成功感染中肠上皮细胞中的少数细胞3，并克服多种生理障碍，例如消化酶引起的蛋白水解降解、肠道微生物群的存在（中肠感染屏障，MIB）以及分泌的围食膜基质。中肠上皮感染之后，病毒需进行复制，并最终从中肠逸出进入蚊子的开放式循环系统（即血淋巴），这一过程标志着弥散性感染的开始，并突破了中肠逸出屏障（MEB）。此时，病毒可感染次级组织（如神经、肌肉和脂肪体）并持续复制，尽管此类次级复制对于病毒感染唾液腺腺泡细胞（突破唾液腺感染屏障）并非绝对必要。病毒从唾液腺腺泡细胞释放至其顶端腔隙，再进入唾液导管，从而在蚊子叮咬后续宿主时将病毒 inoculate（接种）入新宿主体内，完成传播循环1,2,4,5,6,7。

鉴于蚊媒体内这一机制已被充分表征且在不同蚊种间普遍保守，实验室对媒介能力的评估通常在方法学上较为相似，尽管各研究间的具体方案仍存在差异1,2。通常情况下，在蚊子经口暴露于病毒后，需将其解剖，以便分别检测中肠、足、卵巢或唾液腺等组织中的病毒感染情况、扩散性感染、扩散性感染/潜在的经卵传播，以及扩散性感染/潜在的传播能力8。然而，仅在唾液腺中检测到病毒并不足以确证其具有传播能力，因为在某些媒介-病毒组合中存在唾液腺逃逸/释放屏障（SGEB）的证据1,2,4,5,7,9。目前证明传播能力的标准方法仍是通过蚊子将病毒传播给易感动物10,11,12。然而，对于许多节肢动物传播病毒而言，该方法需要使用免疫缺陷的小鼠模型13,14,15,16，因而往往成本过高而难以实施。一种常用的替代方法是收集蚊子的唾液，随后可通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或感染性检测来分析病毒基因组或感染性病毒颗粒的存在。需要注意的是，此类体外唾液收集方法可能高估12或低估17活体吸血过程中实际沉积的病毒量，表明对此类数据的解读必须谨慎。尽管如此，从唾液中病毒是否存在的角度分析，该体外方法仍具有重要价值，可用于指示传播潜力。

确定蚊媒在虫媒病毒病暴发中作用的主要方法有两种。第一种方法是现场监测，即在病毒活跃传播的背景下采集蚊虫样本18,19,20,21,22,23,24。然而，由于感染率通常极低（例如，在美国寨卡病毒（ZIKV）活跃传播地区，蚊虫的估计感染率为0.061%21），对潜在传播媒介种类的归因可能严重受到捕蚊方法25,26和随机因素的影响（例如，在1600只未感染个体中恰好采样到1只感染个体）21。考虑到这一点，某项研究可能在蚊虫数量总数或物种多样性方面均不足以充分代表参与传播的蚊虫群体。相比之下，媒介效能分析在实验室条件下进行，可严格控制口服接种剂量等参数。尽管此类实验尚不能完全模拟自然环境中蚊虫感染与传播能力的真实复杂性，但这些实验室评估仍是虫媒病毒学领域中的有力工具。

基于多种蚊媒种类、种群和方法对寨卡病毒（ZIKV）进行的媒介能力分析27,28,29,30,31,32，以及近期关于媒介能力评估的综述1，本文描述了典型媒介能力研究流程中的若干实验方案。在这些实验中，来自美洲地区的三个埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群（巴西萨尔瓦多市、多米尼加共和国以及美国德克萨斯州里奥格兰德河下游河谷地区）通过人工血餐暴露于单一ZIKV毒株（Mex 1-7，GenBank登录号：KX247632.1），感染剂量分别为4、5或6 log10 焦点形成单位（FFU）/mL。随后，在不同的外潜伏期（2、4、7、10和14天）后，通过组织解剖和基于细胞培养的感染性检测方法，分析蚊虫的感染证据、播散性感染以及传播能力。尽管当前的工作流程/方案针对ZIKV进行了优化，但其中许多环节可直接适用于其他在节肢动物防护与生物安全二级或三级（ACL/BSL2 或 ACL/BSL3）条件下研究的蚊媒虫媒病毒。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案中执行的所有操作均完全遵守由伽利略德克萨斯大学医学分部机构生物安全委员会和机构动物护理与使用委员会批准的规程 。

1. 在 Vero 细胞中扩增 ZIKV

  1. 在含有10% v/v热灭活胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素（分别为100 U/mL和100 μg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱内，将Vero细胞（CCL-81或VeroE6）培养至150 cm2组织培养瓶中细胞融合度达80−90%。
  2. 在生物安全柜（BSC）中，吸去培养基，并将其弃置于10%漂白剂或双季铵盐工作稀释液中（材料表）。立即接种1 mL病毒原液，使每个细胞感染0.1−1个感染性病毒颗粒。轻轻振荡培养瓶，确保接种物完全覆盖单层细胞。
  3. 用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM将培养基补足至5 mL体积。随后将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育60分钟。
  4. 从培养箱中取出培养瓶并移入生物安全柜（BSC）中。使用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM，将培养基补充至总体积15 mL。再将培养瓶放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续培养。
  5. 每日在相差显微镜下观察培养瓶，检查细胞病变效应（CPE）的出现。当单层细胞中约有40−50%的细胞仍存活时，进行病毒收获（步骤1.7），通常在感染后3−5天完成，具体时间取决于所使用的ZIKV毒株。
  6. 吸出上清液并转移至50 mL锥形管中。通过离心（3,500 x g，20分钟）去除细胞碎片，澄清上清液。
    注：若多个培养瓶以相同方式感染，可将多个培养瓶的上清液合并至50 mL锥形管中。
  7. 将50 mL锥形管中的上清液小心转移至新的离心管中，注意避免扰动沉淀。加入热灭活FBS使终浓度达到30%（v/v）。将此混合液分装至带螺旋盖的离心管中，于-80 °C冷冻保存，待后续使用。

2. 人工血餐的制备

  1. 在蚊虫暴露于感染性血餐的当天，在节肢动物 containment 设施中打开电源（材料表），确保在蚊虫准备就绪前，喂饲装置（材料表）已预热完毕。
  2. 采用以下方法之一制备人工血餐。
    1. 方法1：将商业购买的新鲜采集（一周内）的枸橼酸盐或肝素抗凝人血与病毒原液（按第1节所述方法制备）按1:1体积比混合。
      注：此方法的前提是血液中不存在针对该病毒或病毒科的任何抗体。
    2. 若无法确认无抗体存在，或已知血源曾暴露于黄病毒，需洗涤并手动浓缩红细胞。
      1. 在生物安全柜（BSC）内，将30 mL全人血加入50 mL锥形管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）补至50 mL。
      2. 以3,500 × g 离心20分钟。
      3. 通过轻轻倾倒至上层托盘（内含10%次氯酸钠或双季铵盐工作液）的方式吸除上清液，注意勿丢弃红细胞沉淀。
      4. 加入10 mL PBS，轻敲锥形管底部，使其紧贴生物安全柜底部，以重悬红细胞沉淀。再用PBS补至50 mL总体积，通过轻柔倒置混匀。
      5. 重复步骤2.2.2.1−2.2.2.4共4−6次，直至上清液澄清或仅微呈粉红色且不再浑浊。用移液管彻底移除所有上清液，将红细胞沉淀重悬于1−2 mL PBS中。
      6. 配制血餐：350 μL浓缩红细胞、100 μL 10%蔗糖、200 μL热灭活胎牛血清（FBS）、900 μM重组ATP，以及用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM稀释适量的病毒原液，总体积为2 mL。
  3. 用未感染小鼠的皮肤覆盖标准3 mL储液单元（材料表）（其他可选材料包括石蜡膜、胶原膜或香肠肠衣）。
  4. 将覆盖好的储液器置于白色纸巾上。每次加入约1 mL感染性血餐，分次共加入约2 mL。检查喂饲器下方纸巾是否有渗漏迹象。若发现渗漏，回收血餐并丢弃覆盖物。用塞子密封喂饲器，再次确认无渗漏。

3. 血餐回滴定/噬斑测定

  1. 使用已制备的血液餐剩余体积，用添加了2% v/v热灭活胎牛血清（FBS）和1% v/v青霉素-链霉素的DMEM培养基进行10倍系列稀释（即6个稀释度，从10倍稀释至1,000,000倍稀释）。
  2. 将稀释液从最稀释到最浓缩的顺序，每孔加入100 µL至24孔或12孔板的孔中。
  3. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。
  4. 1小时孵育结束后，将培养板移回生物安全柜（BSC），并分别向24孔板或12孔板中加入1 mL或2 mL甲基纤维素覆盖层。
  5. 将加有覆盖层的培养板放回37 °C、5% CO2培养箱中，孵育3−7天（取决于病毒株）。
  6. 孵育结束后，从培养箱中取出培养板并移入生物安全柜。将甲基纤维素覆盖层弃入含有10%漂白剂或双季铵盐消毒剂的托盘中。
  7. 用PBS洗涤每个孔2次，每次洗涤液均弃入含有10%漂白剂或双季铵盐的托盘中。
  8. 加入约1 mL甲醇:丙酮（1:1 v:v），在室温（RT）下的生物安全柜中固定细胞至少30分钟。根据机构对有机废弃物的处理政策丢弃甲醇:丙酮。
  9. 使用以下两种方法之一检测ZIKV。
    1. 去除甲醇:丙酮后，立即用结晶紫溶液（0.25% w/v溶于30%甲醇）染色5分钟。用自来水冲洗2次，晾干后直接肉眼观察是否存在噬斑或单层细胞破坏。
    2. 或者进行焦点形成实验。
      1. 让培养板自然风干，直至无有机固定剂残留。
        注：在生物安全柜外自然风干约需2−3小时，也可在生物安全柜或化学通风橱中加速风干。
      2. 在非无菌PBS（不含Mg2+和Ca2+）中，使用轨道摇床对每个孔洗涤3次，每次15分钟。吸去PBS后，每孔加入1 mL封闭液（PBS + 3% FBS），室温下摇动封闭15分钟。
      3. 每孔加入100 μL α-ZIKV或α-黄病毒属的一抗（例如黄病毒属广谱杂交瘤D1-4G2-4-15 [4G2]），用封闭液按1:2,000稀释。室温下轻轻摇动孵育至少4小时（建议过夜，但不超过18小时）。
      4. 吸去一抗，使用轨道摇床在PBS（不含Mg2+和Ca2+）中洗涤3次，每次15分钟。
      5. 每孔加入100 µL二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG），用封闭液按1:2,000稀释。室温下摇动孵育1小时。
      6. 使用轨道摇床在PBS（不含Mg2+和Ca2+）中洗涤3次，每次15分钟。
      7. 每孔加入100 µL底物显色试剂（材料表）。室温下轻轻摇动反应15分钟。
      8. 当焦点/噬斑显现后，立即移除底物，并用自来水冲洗培养板2次以终止反应。倒掉自来水后，将培养板风干，再进行定量分析。
      9. 计数病毒焦点，以确定给定样本中的FFU数量。

4. 血餐的给予

  1. 使用 埃及伊蚊 羽化后2−4天的蚊子。将雌蚊分选至带筛网盖的0.5 L纸板箱中，并停止供应糖源（通常在感染性血餐前36−48小时开始）。提供 随意摄取 通过水分饱和的棉球提供水分。
  2. 在蚊子将暴露于感染性血餐的当天早晨，移除已吸饱水的棉球。
  3. 将含有人工血餐的储液器连接到透明塑料手套箱内 feeding unit 的导管上。
  4. 在手套箱内放置一个带筛网盖的0.5 L纸板箱，其中装有50−100只饥饿的 埃及伊蚊 蚊子，位于连接储液器的饲喂装置下方。
    注意：适当饥饿的蚊虫通常会在20分钟内吸血。可根据需要延长喂血时间以增加较慢吸血种群的样本量，但总时长不应超过60分钟，因为约60分钟后喂血装置内的寨卡病毒（ZIKV）滴度可能下降。
  5. 喂食结束后，移除储液器并浸入新配制的10%次氯酸钠溶液中。
  6. 将蚊子置于-20 °C环境中孵育30秒，或在冰箱中孵育5分钟，以低温麻醉。
  7. 在手套箱内，将蚊子倒入置于冰上的培养皿中。计数并区分吸血完全的雌蚊与未吸血的蚊子。将未吸血的蚊子浸入装有70%乙醇的50 mL离心管中销毁。在蚊子仍处于麻醉状态时，将其倒回0.5 L纸箱中，并迅速盖上金属网和盖子。修剪纸箱上多余的金属网，用胶带固定网罩。
  8. 在每个纸盒的网罩内放入一个浸透无菌过滤10%蔗糖水溶液的棉球。将所有蚊虫纸盒置于一个较大的塑料次级容器中，并放入一块湿润的海绵以维持湿度。
  9. 将装有蚊虫纸盒的次级容器放入培养箱中，培养箱温度设置为 27 ± 1 °C（或根据目标地区条件适当调整），相对湿度为 80% ± 10%，光照周期为 16 小时光照：8 小时黑暗。保持蚊虫的饲养条件为 随意摄取 实验完成前可自由获取10%蔗糖溶液。

5. 样本采集与处理

  1. 在饲血后的指定天数，使用机械吸虫器在手套箱内从相应的纸盒中吸取预定数量的蚊虫。收集到所需数量的蚊虫后，用棉塞封住收集管管口。
  2. 将蚊虫置于 -20 °C 冷冻 30 秒，或置于 4 °C 冷却 5 分钟，以进行低温麻醉。
  3. 在手套箱内，将蚊虫倒入置于冰上的培养皿中。使用两对镊子，取下每只蚊虫的全部六条腿，并放入预先标记的含有灭菌不锈钢研磨珠（7/32”）和 500 μL 蚊虫收集液（MCM，由 DMEM、2% FBS、1% 青霉素-链霉素和 2.5 μg/mL 两性霉素 B 组成）的 2 mL 圆底微量离心管中。
  4. 将蚊虫轻轻放置于一滴矿物油中以固定，注意避免矿物油与蚊虫头部及喙部接触。
  5. 将蚊虫的喙插入装有 10 μL 热灭活 FBS 的 10 μL 移液器吸头中。
    注意：也可使用蔗糖、血液或矿物油填充移液器吸头。矿物油可使唾液气泡在光学显微镜下直接可视化。
  6. 让蚊虫唾液分泌 30 分钟。将含有 FBS 与唾液的微量移液器吸头弹入含有 100 μL MCM 的微量离心管中，然后将蚊虫尸体放入另一个含有灭菌钢珠和 500 μL MCM 的 2 mL 圆底微量离心管中。确保用于存放尸体、腿部和唾液的离心管均做好标记，以便明确三份样本均来自同一只蚊虫。
  7. 在蚊虫进行唾液分泌的同时，对剩余蚊虫执行步骤 5.3−5.5。
  8. 将装有尸体和腿部的离心管转移至生物安全柜内的珠磨组织匀浆仪中。在 26 Hz 条件下对所有尸体和腿部样本进行 5 分钟的匀浆处理，以释放病毒颗粒至上清液中。以 200 x g 离心 5 分钟，清除细胞碎片，获得澄清上清液。
    注意：此时样本可于 -80 °C 冻存，或立即进行检测。

6. 通过感染性实验检测寨卡病毒（ZIKV）

  1. 在生物安全柜中，于感染实验开始前24小时，准备含Vero细胞的24孔细胞培养板（每孔105个细胞）。为每孔标记单一蚊虫/样本的标识。
  2. 若样本曾于-80 °C冷冻保存，需使其完全解冻。
  3. 在接种样本前，逐板移除Vero细胞培养板中的培养基。
  4. 对于含有蚊虫体或足的样本，小心吸取100 μL澄清上清液加入各孔中，注意避免扰动沉淀中的蚊虫细胞碎片。
    注意：如需保留样本用于后续滴定，唾液样本可在接种前用MCM按1:1（v/v）稀释。
  5. 将培养板转移至37 °C、5% CO2的培养箱中，孵育1小时。
  6. 将培养板移回生物安全柜，向每孔加入约1 mL甲基纤维素覆盖层。将加有覆盖层的培养板重新放回37 °C、5% CO2培养箱中，孵育3−7天（根据病毒/毒株而定）。
  7. 按照步骤3.6−3.9所述进行固定和显色处理。
  8. 在进行焦点形成实验评分时，通过光学显微镜观察对阳性孔进行定量。若某孔中细胞出现胞质内染色，则表明存在病毒。样本仅被判定为焦点阳性或阴性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

来自美洲的三个埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群（巴西萨尔瓦多、多米尼加共和国以及美国德克萨斯州里奥格兰德河谷）被暴露于源自美洲的一株寨卡病毒（ZIKV Mex 1-7，墨西哥恰帕斯州，2015年）中，病毒通过以洗涤的人类红细胞为基础的人工血餐提供，血餐中的病毒滴度范围为4、5和6 log10 FFU/mL。在感染后的第2、4、7、10和14天，分别处理部分蚊虫样本，以测定感染率、扩散率以及潜在传播率。

当ZIKV Mex 1−7的血餐滴度为4 log10 FFU/mL时，来自巴西萨尔瓦多的埃及伊蚊（Ae. aegypti）在体外孵育4天和14天后的感染率分别为12.5%和11.1%，在检测的腿部样本中未发现扩散性感染的证据，唾液中也未检测到病毒（图1a）。将滴度提高至5 log10 FFU/mL后，感染率在感染后第4、10和14天分别为22.2%、33.3%和22.2%，感染性略有上升。与暴露于4 log1...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述方法提供了一种开展媒介效能分析的通用工作流程。作为一个通用框架，这些方法中的许多在现有文献中均被广泛采用。然而，该流程在实际应用中仍存在较大的修改空间（详见 Azar 和 Weaver1 的综述）。已知病毒因素（如病毒谱系、攻毒病毒的保存方式、病毒传代历史）、昆虫学因素（如蚊虫种群的实验室驯化、蚊虫先天免疫、蚊虫微生物组/病毒组）以及实验变量（如血餐成分、连续血饲、孵育温度）均会影响媒介效能。在寨卡病毒（ZIKV）暴发的背景下，媒介效能研究中方法学的差异性已带来显著问题，因其阻碍了系统性荟萃分析的开展1,33。

在该通用方法中，适当饥饿处理蚊虫以及血液餐成分的重要性再怎么强调也不为过。已知脱水会促使蚊虫在实验室范式中表现出吸血行为。34，强调了在提供感染性血餐前进行糖源和水源饥饿处理的重要性。尽管在接触血餐前对蚊虫进行36–48小时的糖源剥夺和2–4小时的水源剥夺...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何披露信息。

致谢

我们感谢世界新发病毒和节肢动物传播病毒参考中心（WRCEVA）的工作人员：Robert Tesh博士、Hilda Guzman、Kenneth Plante博士、Jessica Plante博士、Dionna Scharton和Divya Mirchandani，感谢他们为整理和提供用于本研究组及其他研究组媒介传播能力实验的多种病毒株所付出的不懈努力。本研究工作由McLaughlin博士后基金（SRA）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI120942和AI121452支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 mL 标准储液器R37P30Hemotek Ltd昆虫饲养设备
7/32" 不锈钢 440C 级钢珠4RJH9Grainger研磨介质
丙酮，组织学级，Fisher Chemicals，聚乙烯瓶装，4 L，每箱 4 瓶A16-P4FisherScientific固定剂
腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物，微生物来源，BioReagent，适用于细胞培养A6419-1GMilliporeSigma试剂
抗黄病毒属群特异性抗原抗体，克隆号 D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigma蚀斑形成实验用一抗
抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，经人血清吸附且辣根过氧化物酶标记，1.0 mL/瓶5450-0011KPL/Seracare蚀斑形成实验用二抗
次氯酸钠溶液（漂白剂）NC0427256FisherScientific去污消毒
Corning 细胞培养处理烧瓶，150 cm²，带透气盖，每箱 50 个10-126-34FisherScientific细胞培养耗材
Costar 细胞培养板，24 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning07-200-740FisherScientific细胞培养耗材
Costar 细胞培养板，96 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning07-200-91FisherScientific细胞培养耗材
结晶紫C0775-100GMilliporeSigma染色剂
Eppendorf Snap Cap 微量离心安全锁 2 mL 管，每箱 500 支05-402-7FisherScientific塑料耗材
Falcon 15 mL 圆锥形离心管14-959-70CFisherScientific塑料耗材
Falcon 50 mL 圆锥形离心管14-959-49AFisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，10 mL，每箱 200 支13-675-20FisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，1 mL，每箱 1000 支13-675-15BFisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，25 mL，每箱 200 支13-675-30FisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，5 mL，每箱 200 支13-675-22FisherScientific塑料耗材
Falcon 标准组织培养皿08-772BFisherScientific塑料耗材
胎牛血清-优质，500 mLS11150Atlanta Biologicals细胞培养试剂
Fisherbrand 经济型普通载玻片，玻璃材质12-550-A3FisherScientific蚊虫固定
FU1 饲喂装置FU1-0Hemotek Ltd昆虫饲养设备；饲喂单元
Gibco 含钙镁离子的 DPBS，10 × 500 mL 瓶装140-040-182FisherScientific细胞培养试剂
Gibco Fungizone（两性霉素 B），250μg/mL，50 mL/瓶15-290-026Fisher Scientific细胞培养试剂
Gibco 青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL），100 mL/瓶，每箱 20 瓶15-140-163FisherScientific细胞培养试剂
Gibco 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%），含酚红，20 × 100 mL 瓶装25-200-114FisherScientific细胞培养试剂
Gibco DMEM 培养基，高糖型，10 × 500 mL 瓶装11-965-118FisherScientific细胞培养试剂
人血，性别未指定，柠檬酸钠抗凝，1 单位7203706Lampire血液餐制备
InsectaVac 吸虫器2809BBioquip昆虫饲养设备
甲醇，ACS 认证级，Fisher Chemicals，琥珀色玻璃瓶装，4 L，每箱 4 瓶A412-4FisherScientific固定剂
甲基纤维素，黏度：3,500–5,600 cP，2% 水溶液（20 °C），250 g/瓶M0512-250GMilliporeSigma细胞培养试剂
Micro-chem Plus 消毒清洁剂C849T34Thomas Scientific去污消毒；双季铵盐类工作稀释液
矿物油，BioReagent，适用于分子生物学M5904-5X5MLMilliporeSigma蚊虫固定
O 型密封圈OR37-25Hemotek Ltd昆虫饲养设备
塑料塞PP5-250Hemotek Ltd昆虫饲养设备
PS6 电源装置（110–120 V）PS6120Hemotek Ltd昆虫饲养设备；电源
Rubis 镊子，偏移式刀片，超细尖端4525Bioquip昆虫饲养设备
Sarstedt 公司，2 mL 螺口微量离心管，锥底，带 O 型圈盖，无菌，每箱 1000 支50-809-242FisherScientific塑料耗材
蔗糖，BioUltra 级，适用于分子生物学84097-250GMilliporeSigma试剂
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，1000μL，每架 100 个，每包 8 架，每箱 4 包21-402-487FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，200μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-486FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，20μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-484FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附延长型移液枪头，10μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-482FisherScientific塑料耗材
TissueLyser II85300QIAGEN匀浆处理
TrueBlue 过氧化物酶底物试剂盒，200 mL5510-0030Seracare蚀斑形成实验显色液
VeroCCL-81American Type Culture Collection用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系
Vero C1008 [Vero 76, 克隆 E6, Vero E6]CRL-1586American Type Culture Collection用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系

参考文献

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661(2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072(2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434(2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

蚊虫感染弥散性感染病毒传播血液餐暴露Vero细胞检测焦点形成单位手套箱操作规程
媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。