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媒介能力分析 埃及伊蚊 蚊子传播寨卡病毒

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DOI：

10.3791/61112

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2020年5月31日

 , 
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

本文内容

摘要

本方案可在封闭环境中测定埃及伊蚊（Aedes aegypti）种群对特定病毒（如寨卡病毒）的传播能力。

摘要

本文所述方法介绍了一种在实验室条件下使埃及伊蚊（Aedes aegypti）感染寨卡病毒的通用实验流程，用于测定该蚊虫种群的感染率、播散性感染率以及病毒的潜在传播能力。这些方法在全球范围内的媒介传播能力评估中被广泛应用，并根据具体研究需求进行了多种改进。该方法对于确定特定蚊虫（即物种、种群或个体）在特定病原体传播过程中可能发挥的作用具有重要意义。

引言

媒介能力（vector competence）是指特定节肢动物（如蚊子、蜱或白蛉）在物种、种群甚至个体水平上，通过在节肢动物体内进行复制或发育，生物学性地获取并传播病原体的能力1,2。对于蚊子和节肢动物传播的病毒（即虫媒病毒，arboviruses），雌性蚊子从病毒血症宿主体内吸食摄入病毒。摄入后，病毒必须成功感染中肠上皮细胞中的少数细胞3，并克服多种生理障碍，例如消化酶引起的蛋白水解降解、肠道微生物群的存在（中肠感染屏障，MIB）以及分泌的围食膜基质。中肠上皮感染之后，病毒需进行复制，并最终从中肠逸出进入蚊子的开放式循环系统（即血淋巴），这一过程标志着弥散性感染的开始，并突破了中肠逸出屏障（MEB）。此时，病毒可感染次级组织（如神经、肌肉和脂肪体）并持续复制，尽管此类次级复制对于病毒感染唾液腺腺泡细胞（突破唾液腺感染屏障）并非绝对必要。病毒从唾液腺腺泡细胞释放至其顶端腔隙，再进入唾液导管，从而在蚊子叮咬后续宿主时将病毒 inoculate（接种）入新宿主体内，完成传播循环1,2,4,5,

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方案

本方案中执行的所有操作均完全遵守由伽利略德克萨斯大学医学分部机构生物安全委员会和机构动物护理与使用委员会批准的规程 。

1. 在 Vero 细胞中扩增 ZIKV

  1. 在含有10% v/v热灭活胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素（分别为100 U/mL和100 μg/mL）的杜尔贝科改良伊格尔最低必需培养基（DMEM）中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱内，将Vero细胞（CCL-81或VeroE6）培养至150 cm2组织培养瓶中细胞融合度达80−90%。
  2. 在生物安全柜（BSC）中，吸去培养基，并将其弃置于10%漂白剂或双季铵盐工作稀释液中（材料表）。立即接种1 mL病毒原液，使每个细胞感染0.1−1个感染性病毒颗粒。轻轻振荡培养瓶，确保接种物完全覆盖单层细胞。
  3. 用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM将培养基补足至5 mL体积。随后将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育60分钟。
  4. 从培养箱中取出培养瓶并移入生物安全柜（BSC）中。使用补充了2% v/v热灭活FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的DMEM，将培养基补充至总体积15 mL。再将培养瓶放回37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续培养。<....

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结果

来自美洲的三个埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群（巴西萨尔瓦多、多米尼加共和国以及美国德克萨斯州里奥格兰德河谷）被暴露于源自美洲的一株寨卡病毒（ZIKV Mex 1-7，墨西哥恰帕斯州，2015年）中，病毒通过以洗涤的人类红细胞为基础的人工血餐提供，血餐中的病毒滴度范围为4、5和6 log10 FFU/mL。在感染后的第2、4、7、10和14天，分别处理部分蚊虫样本，以测定感染率、扩散率以及潜在传播率。

当ZIKV Mex 1−7的血餐滴度为4 log10 FFU/mL时，来自巴西萨尔瓦多的埃及伊蚊（Ae. aegypti）在体外孵育4天和14天后的感染率分别为12.5%和11.1%，在检测的腿部样本中未发现扩散性感染的证据，唾液中也未检测到病毒（图1a）。将滴度提高至5 log10 FFU/mL后，感染率在感染后第4、10和14天分别为22.2%、33.3%和22.2%，感染性略有上升。与暴露于4 log1.......

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讨论

本文所述方法提供了一种开展媒介效能分析的通用工作流程。作为一个通用框架，这些方法中的许多在现有文献中均被广泛采用。然而，该流程在实际应用中仍存在较大的修改空间（详见 Azar 和 Weaver1 的综述）。已知病毒因素（如病毒谱系、攻毒病毒的保存方式、病毒传代历史）、昆虫学因素（如蚊虫种群的实验室驯化、蚊虫先天免疫、蚊虫微生物组/病毒组）以及实验变量（如血餐成分、连续血饲、孵育温度）均会影响媒介效能。在寨卡病毒（ZIKV）暴发的背景下，媒介效能研究中方法学的差异性已带来显著问题，因其阻碍了系统性荟萃分析的开展1,33。

在该通用方法中，适当饥饿处理蚊虫以及血液餐成分的重要性再怎么强调也不为过。已知脱水会促使蚊虫在实验室范式中表现出吸血行为。34，强调了在提供感染性血餐前进行糖源和水源饥饿处理的重要性。尽管在接触血餐前对蚊虫进行36–48小时的糖源剥夺和2–4小时的水源剥夺.......

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

我们感谢世界新发病毒和节肢动物传播病毒参考中心（WRCEVA）的工作人员：Robert Tesh博士、Hilda Guzman、Kenneth Plante博士、Jessica Plante博士、Dionna Scharton和Divya Mirchandani，感谢他们为整理和提供用于本研究组及其他研究组媒介传播能力实验的多种病毒株所付出的不懈努力。本研究工作由McLaughlin博士后基金（SRA）以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI120942和AI121452支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 mL 标准储液器R37P30Hemotek Ltd昆虫饲养设备
7/32" 不锈钢 440C 级钢珠4RJH9Grainger研磨介质
丙酮，组织学级，Fisher Chemicals，聚乙烯瓶装，4 L，每箱 4 瓶A16-P4FisherScientific固定剂
腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物，微生物来源，BioReagent，适用于细胞培养A6419-1GMilliporeSigma试剂
抗黄病毒属群特异性抗原抗体，克隆号 D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigma蚀斑形成实验用一抗
抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，经人血清吸附且辣根过氧化物酶标记，1.0 mL/瓶5450-0011KPL/Seracare蚀斑形成实验用二抗
次氯酸钠溶液（漂白剂）NC0427256FisherScientific去污消毒
Corning 细胞培养处理烧瓶，150 cm²，带透气盖，每箱 50 个10-126-34FisherScientific细胞培养耗材
Costar 细胞培养板，24 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning07-200-740FisherScientific细胞培养耗材
Costar 细胞培养板，96 孔，每袋 5 块，每箱 100 块，Corning07-200-91FisherScientific细胞培养耗材
结晶紫C0775-100GMilliporeSigma染色剂
Eppendorf Snap Cap 微量离心安全锁 2 mL 管，每箱 500 支05-402-7FisherScientific塑料耗材
Falcon 15 mL 圆锥形离心管14-959-70CFisherScientific塑料耗材
Falcon 50 mL 圆锥形离心管14-959-49AFisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，10 mL，每箱 200 支13-675-20FisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，1 mL，每箱 1000 支13-675-15BFisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，25 mL，每箱 200 支13-675-30FisherScientific塑料耗材
Falcon 一次性聚苯乙烯移液管，5 mL，每箱 200 支13-675-22FisherScientific塑料耗材
Falcon 标准组织培养皿08-772BFisherScientific塑料耗材
胎牛血清-优质，500 mLS11150Atlanta Biologicals细胞培养试剂
Fisherbrand 经济型普通载玻片，玻璃材质12-550-A3FisherScientific蚊虫固定
FU1 饲喂装置FU1-0Hemotek Ltd昆虫饲养设备；饲喂单元
Gibco 含钙镁离子的 DPBS，10 × 500 mL 瓶装140-040-182FisherScientific细胞培养试剂
Gibco Fungizone（两性霉素 B），250μg/mL，50 mL/瓶15-290-026Fisher Scientific细胞培养试剂
Gibco 青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL），100 mL/瓶，每箱 20 瓶15-140-163FisherScientific细胞培养试剂
Gibco 胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%），含酚红，20 × 100 mL 瓶装25-200-114FisherScientific细胞培养试剂
Gibco DMEM 培养基，高糖型，10 × 500 mL 瓶装11-965-118FisherScientific细胞培养试剂
人血，性别未指定，柠檬酸钠抗凝，1 单位7203706Lampire血液餐制备
InsectaVac 吸虫器2809BBioquip昆虫饲养设备
甲醇，ACS 认证级，Fisher Chemicals，琥珀色玻璃瓶装，4 L，每箱 4 瓶A412-4FisherScientific固定剂
甲基纤维素，黏度：3,500–5,600 cP，2% 水溶液（20 °C），250 g/瓶M0512-250GMilliporeSigma细胞培养试剂
Micro-chem Plus 消毒清洁剂C849T34Thomas Scientific去污消毒；双季铵盐类工作稀释液
矿物油，BioReagent，适用于分子生物学M5904-5X5MLMilliporeSigma蚊虫固定
O 型密封圈OR37-25Hemotek Ltd昆虫饲养设备
塑料塞PP5-250Hemotek Ltd昆虫饲养设备
PS6 电源装置（110–120 V）PS6120Hemotek Ltd昆虫饲养设备；电源
Rubis 镊子，偏移式刀片，超细尖端4525Bioquip昆虫饲养设备
Sarstedt 公司，2 mL 螺口微量离心管，锥底，带 O 型圈盖，无菌，每箱 1000 支50-809-242FisherScientific塑料耗材
蔗糖，BioUltra 级，适用于分子生物学84097-250GMilliporeSigma试剂
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，1000μL，每架 100 个，每包 8 架，每箱 4 包21-402-487FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，200μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-486FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附移液枪头，20μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-484FisherScientific塑料耗材
ThermoScientific ART 防污染低吸附延长型移液枪头，10μL，每架 96 个，每包 10 架，每箱 5 包21-402-482FisherScientific塑料耗材
TissueLyser II85300QIAGEN匀浆处理
TrueBlue 过氧化物酶底物试剂盒，200 mL5510-0030Seracare蚀斑形成实验显色液
VeroCCL-81American Type Culture Collection用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系
Vero C1008 [Vero 76, 克隆 E6, Vero E6]CRL-1586American Type Culture Collection用于病毒扩增和感染性实验的哺乳动物细胞系

参考文献

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. ....

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标签

Vero

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