小鼠足垫接种模型用于研究病毒诱导的神经炎症反应

摘要

足垫接种模型是体内表征病毒诱导的神经炎症反应的有力工具。特别是，该模型可清晰评估外周神经系统中启动的病毒动力学及相关的免疫病理过程。

摘要

本方案描述了一种用于研究甲型疱疹病毒（alphaherpesvirus）感染小鼠过程中神经炎症反应启动与发展机制的足垫接种模型。由于甲型疱疹病毒是外周神经系统（PNS）的主要侵袭性病原体，该模型适用于表征病毒复制的动力学特征、其从PNS向中枢神经系统（CNS）的传播过程以及相关的神经炎症反应。在足垫接种模型中，病毒颗粒从足垫表皮的初始感染部位扩散至支配表皮、汗腺和真皮的感觉神经与交感神经纤维。感染随后经坐骨神经传播至背根神经节（DRG），最终通过脊髓到达脑部。在此模型中，小鼠足垫接种伪狂犬病病毒（PRV），该病毒是一种与单纯疱疹病毒（HSV）和水痘-带状疱疹病毒（VZV）密切相关的甲型疱疹病毒。该模型显示，PRV感染可诱导严重的炎症反应，其特征为中性粒细胞在足垫和DRG中的浸润。通过ELISA可在组织匀浆中检测到高水平的炎症细胞因子。此外，在DRG中PRV基因和蛋白的表达（通过qPCR和免疫荧光染色检测）与促炎细胞因子的产生之间存在显著相关性。因此，足垫接种模型有助于深入理解甲型疱疹病毒诱导的神经病变的潜在机制，并可能推动创新治疗策略的开发。此外，该模型还可为多发性硬化等外周神经病变以及病毒诱导的PNS损伤相关研究提供指导。最终，该模型可作为一种经济高效的体内工具，用于药物研发。

引言

本研究描述了一种足垫接种模型，用于研究病毒从周围神经系统（PNS）向中枢神经系统（CNS）的复制与扩散过程，以及相关的神经炎症反应。该足垫接种模型已被广泛用于研究甲型疱疹病毒感染神经元的过程^1,2,3。此模型的主要目的是使嗜神经病毒在到达中枢神经系统之前，能够通过周围神经系统行进尽可能长的距离。本文中，该模型被用于深入探究伪狂犬病病毒（PRV）感染小鼠后特定神经病变（神经性瘙痒）的发展过程。

伪狂犬病毒（PRV）是一种α-疱疹病毒，与多种著名的病原体相关（例如单纯疱疹病毒1型和2型[HSV1和HSV2]以及水痘-带状疱疹病毒[VZV]），分别引起唇疱疹、生殖器病变和水痘⁴。这些病毒均具有泛嗜性，能够感染多种不同类型的细胞，而对特定组织类型无明显亲和性。然而，它们均表现出特征性的嗜神经性，可侵入宿主物种的周围神经系统（PNS），有时也会侵入中枢神经系统（CNS）。PRV的自然宿主是猪，但其可感染大多数哺乳动物。在非自然宿主中，PRV感染周围神经系统并引发一种严重的瘙痒症状，称为“狂痒症（mad itch）”，随后出现急性致死性病程^5,6

方案

所有动物实验均根据普林斯顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准的方案（编号 2083-16 和 2083-19）进行。本工作严格遵循生物安全二级（BSL-2）要求，在普林斯顿大学生物安全委员会批准的配备齐全的实验室中开展。小鼠足垫擦伤、病毒接种、小鼠解剖及组织采集等操作均在普林斯顿大学生物防护动物设施房间的生物安全柜（BSC）内进行。操作人员穿戴一次性防护服、头套、护目用具、无菌手套、外科口罩和鞋套。

1. 小鼠足垫擦伤

1. 使用异氟烷气体麻醉剂，通过小型麻醉系统（麻醉舱）以3%的剂量对一只5–7周龄的C57BL/6小鼠进行麻醉。
   1. 在接种前，将小鼠仰卧置于手术麻醉平面。将带有隔膜（切口大小应足以容纳动物口鼻）的鼻罩连接至小鼠，并以1.5%–2.0%的恒定剂量输送异氟烷气体麻醉剂。
   2. 使用镊子用力夹捏小鼠脚趾以产生疼痛刺激，密切监测小鼠是否出现反应。
2. 用平头镊子轻轻夹住一只后足垫。
   1. 在足跟与行走垫之间，使用砂板（粒度100–180）轻轻摩擦后足垫无毛皮肤约20次。避免因摩擦过于频繁或压力过大而导致出血。
   2. 使用精细镊子缓慢剥离因摩擦而松动的角质层，以暴露基底层。

2. 伪狂犬病毒足垫接种

1. ....

结果

小鼠足垫接种模型可用于在体内表征甲型疱疹病毒感染的免疫病理发生过程，包括病毒在接种足垫中的复制和向神经系统的扩散，以及特异性神经炎症反应的诱导。

在本研究中，我们首先对小鼠后足垫进行擦伤处理，随后对擦伤区域进行模拟接种或接种伪狂犬病毒强毒株（PRV-Becker）。在对照组足垫中，擦伤部位清晰可见。作为愈合过程的一部分，擦伤部位形成了痂皮（图1，黑色箭头）。相比之下，接种PRV的小鼠在人道终点（82 hpi）表现出严重的炎症反应，特征为足垫肿胀和发红。

在用强毒性的PRV-Becker毒株进行足垫接种后，小鼠于接种后72小时开始出现临床症状，表现为接种侧足垫肿胀及震颤频率逐渐增加。至接种后82小时，PRV-Becker感染小鼠出现持续性的接种侧后肢震颤以及典型的PRV症状，包括对接种足部的剧烈搔抓和啃咬行为。足垫部位还观察到严重的炎症反应。随后进一步表征了PRV感染过程中诱导的炎症反应，包括免疫细胞向组织中的浸润情况。

讨论

本文所述的足垫接种模型可用于研究α疱疹病毒感染过程中神经炎症反应的启动与发展。此外，该体内模型还可用于建立α疱疹病毒从周围神经系统（PNS）向中枢神经系统（CNS）复制与扩散的动力学过程。该模型是其他接种模型的替代方法，例如依赖深部真皮划痕的侧腹皮肤接种模型¹³，或直接将病毒引入中枢神经系统的颅内接种途径^14,15,16。因此，采用足垫模型可更详细地评估病毒复制与扩散的动力学特征，以及神经系统中相关的局部和远端免疫病理过程^11,12。

在本实验方案中，足垫的摩擦损伤及随后的病毒接种是关键步骤。实际上，必须在充分摩擦后完全去除角质层，以暴露基底层并使其接触病毒接种物，从而实现成功感染。然而，摩擦操作必须轻柔，且不能引起出血，以避免病毒进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗PRV gB抗体	Made by the lab		1/500 稀释
红色Aqua-hold2防溢笔	Fisher scientific	2886909
便携式指甲锉（24片装，100/180目）	Revlon
完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6小鼠（5-7周龄）	The Jackson Laboratories
DAPI溶液（1mg/ml）	Fisher scientific	62248	1/1000 稀释
一次性无菌聚苯乙烯培养皿（100 × 15 mm）	Sigma-Aldrich	P5731500
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
胎牛血清（FBS）	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
不锈钢精细弯剪	FST	14095-11
Fluoromount-G封片介质	Fisher scientific	0100-01
中性缓冲福尔马林溶液（10%）	Sigma-Aldrich	HT501128
异氟烷（Isothesia Isoflurane）	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
2 ml 微量离心管	Denville Scientific	1000945
1.5 ml 微量离心管	SARSTEDT	72692005
阴性山羊血清	Vector	S-1000
青霉素/链霉素	Gibco	154022
Precision Glide 针头（18G）	BD	305196
带钢背的剃须刀片	Personna	9412071
RNA裂解缓冲液（RLT）	Qiagen	79216
不锈钢珠，5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus显微载玻片	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT组织研磨仪	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT包埋剂	Sakura	4583
488标记山羊抗小鼠二抗	Life Technologies	A11029	1/2000 稀释