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从大鼠心脏心室游离壁分离心内膜和冠状动脉内皮细胞

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DOI：

10.3791/61126

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2020年4月15日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, Stanford School of Medicine, 2Vera Moulton Wall Center for Pulmonary Vascular Disease, Stanford School of Medicine, 3Stanford Cardiovascular Institute, Stanford School of Medicine, 4Division of Pulmonary Biology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 5Center for Stem Cell and Organoid Medicine, CuSTOM, Division of Developmental Biology, and Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

本文内容

摘要

我们介绍一种从大鼠心脏中分离心内膜和冠状动脉内皮细胞的方案，该方案通过在消化缓冲液中进行连续的组织消化、反复离心循环收集细胞，以及使用抗大鼠CD31磁珠对细胞进行纯化。

摘要

研究表明，心内膜内皮细胞（EECs）与冠状动脉内皮细胞（CECs）在起源、发育、标志物及功能方面均存在差异。因此，这两类细胞群体在心脏疾病中发挥着各自独特的作用。目前涉及分离内皮细胞的研究通常包含EECs与CECs的混合细胞群体。本实验方案介绍了一种可独立分离这两种细胞群体的方法，以实现细胞特异性的表征分析。在获取左心室和右心室游离壁后，分别使用消化缓冲液从心肌组织的外表面和内表面释放内皮细胞。通过对外表面和内侧心内膜层进行顺序消化，可保持两类内皮细胞群体的分离状态。进一步通过鉴定各细胞群体特异性的标志物，验证EECs与CECs的独立分离效果。根据已发表的小鼠心脏单细胞RNA测序研究结果，Npr3、Hapln1 和 Cdh11 基因的表达为EECs所特有；而 Fabp4、Mgll 和 Cd36 基因的表达则为CECs所特有。qPCR数据表明，这些特征性标志物在其对应的样本中表达显著富集，说明EECs和CECs已成功分离，且细胞表型得以维持，从而为进一步的细胞特异性功能分析提供了基础。

引言

本文提供了一种从大鼠心脏中分离并随后纯化心内膜内皮细胞（EECs）和冠状动脉内皮细胞（CECs）的详细实验方案（改良自 Gladka 等人1）。能够独立研究这些细胞群体，将有助于探索多种心脏疾病中细胞类型特异性的潜在致病机制，并为治疗靶点的发现提供可能。然而，迄今为止，尚未有成功独立获取这两类细胞群体的方法被发表。

CECs 在心脏发育和疾病过程中的起源、标志物和功能方面与 EECs 不同1,2,3,4,5,6,7心内皮细胞起源于心脏中胚层的腹侧表面3。它们起源于Flk1+ 祖细胞在VEGF和HIF信号通路的调控下响应，形成发育中心脏三个 distinct 区域最内层的结构：心房、心室和静脉窦3,6遗传谱系示踪表明，静脉窦中的多能心内膜细胞衍生出静脉细胞，这些细胞迁移后形成心外膜下层3随后，心外膜下层分化为冠状动脉和静脉，包括心外膜下内皮细胞（CECs），这些细胞分布在心室游离壁的周边区域3,4该心内膜向内皮细胞的转化通路受VEGFC、ELA/APJ和SOX17信号通路的调控。3,4,6,8,9室间隔的心室心内膜通过一种未知机制衍生出较少的内皮细胞3随后，通过这两种细胞群体的特异性标志物来提示肠上皮细胞（EECs）与结肠上皮细胞（CECs）之间的局部化分化差异，包括 Mgll, Fabp4 和 Cd36 在CECs中的表达，或 Npr3，Cdh11 和 Hapln1 EECs中的表达3,5,10.

内皮细胞（EECs）和冠状动脉内皮细胞（CECs）在心脏功能中发挥不同的作用。心内膜向间充质转化、瓣膜形成、心腔成熟、流出道调控以及房室管发育均依赖于EECs6。相反，CECs则参与冠状动脉的血管张力调节和炎症反应11。这些功能上的差异导致它们在疾病发生发展中具有各自独特的作用4,12。例如，有证据表明，功能异常的EECs可能导致先天性瓣膜病6、心肌致密化不全6、房室间隔缺损6、心内膜纤维弹性组织增生13、左心发育不全综合征13、心室发育不全13以及心脏肥厚12。类似地，研究发现异常的CECs与冠状动脉疾病14和血栓形成11有关。

成功分离内胚层内皮细胞（EECs）和心外膜内皮细胞（CECs）对于全面了解这两种细胞群体至关重要，这些细胞可在科研和临床环境中加以利用。确定这些细胞群体的生长和分化因子将为诱导性多能干细胞（iPSCs）向内皮细胞亚型分化提供参考依据。此外，全面鉴定EECs与CECs在发育、调控及功能上的差异，对于以细胞类型特异性方式理解多种心脏疾病的基因组和表观基因组影响因素具有重要意义。本文概述了独立获取EECs和CECs的有效步骤，并通过检测细胞类型特异性标志物的基因表达水平，提供了细胞分离效果的验证证据。

方案

所有动物实验程序均经斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC31608）批准。

1. 缓冲液的配制

  1. 使用表1中列出的试剂配制消化缓冲液。
    1. 配制DNase I储存液：将DNase I溶于无RNase的水中，配制成2,000单位/mL（1 mg/mL）的储存液。分装后于-20 ˚C保存。
    2. 配制liberase溶液：将liberase溶于无RNase的水中，配制成5 mg/mL的储存液。在4 ˚C下于旋转仪上旋转30分钟。分装后于-20 ˚C保存。
  2. 通过将0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）和10%牛血清白蛋白（BSA）储存液用1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制分选缓冲液，终浓度为2 mM EDTA和0.5% BSA。

2. 心脏采集

注意：本方案使用了六只体重为 50–100 g 的 Sprague Dawley 大鼠。未观察到性别差异。

  1. 用 CO2 处死大鼠，并将其仰卧位放置于解剖平台上。固定四肢，并用 70% 乙醇对腹部和胸部进行消毒。
  2. 用剪刀打开腹部，将 21 G 针头插入位于肠道后方的下腔静脉部位。回拉注射器活塞，从静脉中抽吸血液，直至肝脏颜色变浅且无法再抽出血液，表明血液已充分清除。
  3. 使用剪刀小心打开胸腔，避免损伤肺和心脏。用镊子提起主动脉弓/心房，剪断主动脉、肺动脉、肺静脉和下腔静脉，以游离并取出心脏。
  4. 用 50 mL 冷的 1× Hanks' 平衡盐溶液（HBSS）缓冲液清洗心脏 3 次，以去除多余的血液。
  5. 在显微解剖镜下，将右心室游离壁分离至含有 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）的 5 mL 离心管中（图 1A、B）。
    1. 将心脏平放在较平坦的后侧面上，以辨认左侧和右侧。
    2. 找到肺动脉，即从心脏顶部发出的最靠前的血管，沿肺动脉向下剪至右心室腔。在心脏前表面沿室间隔剪至心尖。继续从心尖沿后侧室间隔向上剪，直至到达肺动脉与右心室腔的连接处（图 1A）。
    3. 从肺动脉与右心室的连接处开始，垂直于先前的切口方向，在心脏前侧和后侧分别向远离室间隔的方向剪开，直至完全游离右心室游离壁（图 1B）。
  6. 在显微解剖镜下，将左心室游离壁分离至含有 DMEM 的 5 mL 离心管中（图 1C、D）。
    1. 找到从心脏顶部发出、位于肺动脉后方的主动脉，重复步骤 2.5 中所述方法，切除左心室游离壁。

3. EEC 消化

  1. 将右心室和左心室游离壁组织置于60 cm培养皿中，使内表面平放朝下（图2）。
    注：内表面是指略呈凹形的心室内部表面，如图2A、C所示。
  2. 向培养皿中加入0.5–1 mL消化缓冲液，将移液器吸头直接置于组织下方，继续添加直至仅内表面浸没在液体中。
  3. 将培养皿置于含5% CO2、37 ˚C的培养箱中孵育5分钟。
  4. 向培养皿中加入EC培养基以终止消化反应。
    注：消化缓冲液与EC培养基的体积比应保持为1:5。
  5. 使用1 mL移液器用EC培养基冲洗心室内表面，并将流出液通过40 mm滤网收集至50 mL收集管中（图2E）。将收集物置于冰上，用于后续纯化。

4. CEC 消化

  1. 沿左心室外表面切割，避免来自内层的污染（图2B，D），并将每份组织分别放入含有1 mL消化缓冲液的5 mL离心管中。
    注意：左心室可识别为较厚的心室，其外表面为略呈凹面的心室外侧面。
  2. 使用解剖剪将心室壁剪切成约1 mm3大小的小块。
  3. 将离心管置于37 ˚C水浴中孵育约15–20分钟，每2–3分钟涡旋振荡一次。
  4. 用移液器向5 mL离心管中加入4 mL内皮细胞培养基以终止消化反应。
  5. 用5 mL血清移液管将溶液经40 mm滤网转移至50 mL离心管中（图2E）。将收集的细胞置于冰上，用于后续纯化。

5. 细胞收集

  1. 在室温（RT）下以 300 × g 离心 10 分钟，然后吸去上清液。
  2. 如果沉淀呈红色，则将沉淀重悬于 1–2 mL 的 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液中（图 2F）。
    注意：若无红细胞，请直接进行步骤 6。
  3. 将离心管置于 37 ˚C 水浴中孵育 5 分钟。
  4. 用移液器向 50 mL 离心管中加入 10 mL PBS 以终止裂解反应。
  5. 在室温（RT）下以 300 × g 离心 10 分钟，然后吸去上清液。

6. 内皮细胞分选

  1. 向50 mL离心管中加入90 μL分选缓冲液和10 μL抗CD31 PE抗体。
  2. 涡旋混匀管内液体，然后在4 ˚C冰箱中孵育10分钟。
  3. 向管中加入10 mL分选缓冲液，充分混匀，随后在室温下以300 × g离心10分钟。
  4. 吸除上清液，将沉淀重悬于80 µL分选缓冲液和20 µL抗PE磁珠中。
  5. 涡旋混匀管内液体，在4 ˚C下孵育15分钟。
  6. 通过向管中加入10 mL分选缓冲液洗涤细胞，充分混匀，然后在室温下以300 × g离心10分钟。
  7. 吸除上清液，将沉淀重悬于500 μL分选缓冲液中。
  8. 将含有超顺磁性微球的分选柱置于磁力分选器中，并用3 mL分选缓冲液冲洗分选柱。
  9. 当分选柱处于“流停”状态时，用移液器将500 μL细胞悬液加入分选柱中，然后用分选缓冲液洗涤分选柱。重复洗涤3次，每次使用3 mL分选缓冲液（图2G）。
  10. 从分选器上取下分选柱，放置于新的15 mL收集管上方。
  11. 用移液器向分选柱中加入5 mL内皮细胞培养基，并使用柱塞推动溶液通过分选柱。
  12. 在室温下以300 × g离心收集管10分钟，然后吸除上清液。
  13. 使用试剂盒按照制造商说明书从EEC和CEC样本的细胞沉淀中提取RNA。可获得至少500 ng的RNA。
    注意：RNA提取后，样本可在-80 ˚C保存。
  14. 使用随机引物和试剂盒，按照制造商说明书将500 ng RNA逆转录为cDNA。
  15. 进行定量PCR以验证心内膜和内皮细胞群体（图2H）。引物序列列于表2中。
    1. 将5 μL EEC或CEC cDNA（1 ng/μL）加入384孔qPCR板的孔中。为每种引物准备三个重复孔，因此需将EEC或CEC cDNA加入足够数量的孔中。
    2. 将6 μL 2× qPCR SYBR Green缓冲液与每种10 μM引物（包括正向和反向引物）各0.5 μL混合，然后加入对应每个候选基因的单个孔中。
    3. 用塑料封膜密封qPCR板，在室温下以300 × g离心1分钟。
    4. 将qPCR板放入qPCR仪中，启动程序：95 ˚C预变性3分钟，随后进行45个循环，每个循环包括95 ˚C变性15秒和55 ˚C退火延伸60秒。

结果

EEC 和 CEC 分离过程如图2所示。通过检测泛内皮细胞标志物以及两种亚型细胞特有标志物的存在情况，评估 EEC 和 CEC 分离是否成功。与预期一致，qPCR 结果显示，相对于β-actin，EEC 中心内膜标志物Npr3、Hapln1和Cdh11的表达水平高于 CEC（图3A）。同样，CEC 中冠状动脉标志物Fabp4、Mgll和Cd36的表达水平高于 EEC（图3B）。此外，EEC 和 CEC 均表达泛内皮细胞标志基因Cdh5，其中 CEC 中的表达水平略高（图3C）。


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图1：心脏解剖示意图。 (A) 第一切口，用于将右心室游离壁与室间隔分离。(B) 第二切口，用于完全游离右心室。(C) 第一切口，用于将左心室游离壁与室间隔分离。(D) 第二切口，用于完全游离左心室。请点击此处查看此图的放大版本。


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图2：CECs和EECs消化处理示意图及后续细胞分选流程。 （A）最内层游离心室壁和（B）最外层游离心室壁分别进行（C）浸入消化缓冲液或（D）在消化缓冲液中进行消化处理。（E）收集并过滤细胞悬液，随后进行（F）红细胞（RBC）裂解以及（G）使用CD31抗体的磁珠激活细胞分选（MACS）。（H）纯化后的内皮细胞用于通过qPCR进行基因表达验证。 请点击此处查看该图的放大版本。


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图3：qPCR 数据验证 CEC 和 EEC 的分离。 (A) 利用实时 PCR 定量检测 EEC 标记基因 Npr3、Cdh11 和 Hapln1 在 EEC 与 CEC 中的基因表达水平。(B) 利用实时 PCR 定量检测 CEC 标记基因 Mgll、Fabp4 和 Cd36 在 EEC 与 CEC 中的基因表达水平。(C) 利用实时 PCR 定量检测 EEC 与 CEC 中泛内皮细胞（pan-EC）标记基因 Cdh5 的表达。（每组 n = 3）。柱状图表示均值 ± 标准误（SEM）。*p < 0.05，**p < 0.01，与 EEC 比较，采用非配对 t 检验。 请点击此处查看本图的放大版本。

表1. 消化缓冲液（1.5 ml）
 储存浓度终浓度体积
Liberase TM5 mg/ml0.5 mg/ml150 ul
Dnase I1 mg/ml20 ug/ml30 ul
HEPES1 M10 mM15 ul
DMEM--1305 ul

表1：消化缓冲液配方。

表2. 引物序列
基因名称正向引物反向引物
Npr3TCCTTGCAAATCATGTGGCCTAGGAATCTTCCCGCAGCTCTC
Cdh11GTGAATGGGACTGGGACTGGGTAATTTCTGGGGCCCTTGC
Hapln1CCAGCTAAGTGGGACTCGAAGGGGCCATTTTCAGCTTGGATG
MgllCCCGGGGCCCAAAGACGAAGATGAGGGCCTTGGGTG
Fabp4AGAAGTGGGAGTTGGCTTCGACTCTCTGACCGGATGACGA
Cd36GCAAAACGACTGCAGGTCAACCCGGTCACTTGGTTTCTGA
Cdh5CCATTGAGACAGACCCCGACTGTGGAACGTGTACTGCTGG
B-actinTCTGTGTGGATTGGTGGCTCCGGACTCATCGTACTCCTGC

表2：引物序列

讨论

CEC 和 EEC 在来源、标志物和功能上存在差异，因此可能在发育和疾病中发挥独特作用。目前内皮细胞分离的现有方案仅限于大血管组织，忽略了 EEC 的获取，从而限制了对 CEC 和 EEC 特异性功能的研究。独立分离并研究这两类细胞群体至关重要，因为这将为诱导多能干细胞（iPSCs）向 CEC 和 EEC 分化的研究提供参考依据，并有助于探索这些细胞群体作为多种心脏疾病的潜在治疗靶点。本项新方案概述了一种从成年大鼠心室游离壁内表面分离 EEC 以及从外表面分离 CEC 的方法。

在本实验方案中，精确控制每一步的时间至关重要。由于大鼠心脏组织中的内皮细胞（EEC）数量非常有限，我们尽量缩短了心脏内层的消化时间，以防止细胞损伤，更重要的是避免心外膜成纤维细胞（CEC）的污染。及时加入内皮细胞培养基以终止酶反应，对于维持细胞的高存活率也极为重要。细胞收集后若出现红色沉淀，提示存在大量红细胞（RBC）。根据红细胞污染的程度，可加入 1–2 mL 红细胞裂解缓冲液以降解红细胞。孵育时间必须严格控制，以避免对细胞造成显著损伤，并需立即加入磷酸盐缓冲液（PBS）以终止反应。采用本实验方案，我们能够从六只大鼠心脏中分离出 105 个 EEC。这些细胞可接种于细胞培养皿中，用于进一步扩增和鉴定。

在准备采集心壁组织时，需用HBSS冲洗心脏以去除大部分残留的红细胞。推荐使用HBSS作为冲洗液，因其外观透明，便于观察残留的血细胞，而含有酚红的DMEM则不利于观察。消化缓冲液的成分配比可有效释放内皮细胞：其中Liberase消化酶可降解组织表面暴露的细胞，DNase I可降解死细胞释放的DNA，从而消除DNA黏附性对细胞解离的抑制作用；HEPES用于维持pH稳定；DMEM是一种改良的基础培养基，含有更高浓度的氨基酸和维生素，有利于细胞维持活性，并提供激活Liberase所必需的钙离子。

根据来自人类15和小鼠心脏10的单细胞RNA测序（scRNA-seq）结果，已报道了若干与特定内皮细胞（EC）群体相关的标志物。我们选取了一些表达最富集的基因，用于检测分离得到的内脏内皮细胞（EEC）（如Npr3、Cdh11和Hapln1）以及心内膜内皮细胞（CEC）（如Mgll、Fabp4和Cd36）的纯度。相对于β-Actin，Npr3、Cdh11和Hapln1在EEC中的表达水平高于CEC。同样，Mgll、Fabp4和Cd36在CEC中的表达水平也高于EEC。各样本中特异性表达的标志物分别与EEC和CEC的特征性标志物一致，表明分离成功。

然而，即使采用严格控制的连续消化步骤，当前方案仍无法完全排除两种内皮细胞群在分离过程中发生交叉污染的可能性。因此，可应用一些细胞表面标志物进行进一步纯化。例如，NPR3 通常标记心内膜细胞10，而 APJ 可标记大部分心外膜来源的内皮细胞（CEC）16。由于这两种标志物均表达于细胞表面，可用于荧光激活细胞分选（FACS），并利用相应抗体进一步纯化不同的内皮细胞群体。此外，人15和小鼠10心脏单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据可证实Npr3在心外膜内皮细胞（EEC）中的富集，而Cd36可能可用于 CEC 的纯化。

综上所述，本方案概述了从大鼠心脏中独立分离肠上皮细胞（EECs）和心内皮细胞（CECs）的方法。通过细胞分离实现的细胞特性全面鉴定，可用于重要的下游应用。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者非常感谢王玲丽博士在动物实验方案方面的帮助，以及斯坦福大学儿科系在基础设施方面提供的支持。本研究工作由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所资助项目 K99 HL135258（资助给 M.G.）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES)Gibco156300801M
15 ml 离心管Eppendorf0030122151
50 ml 离心管Nunc339652
5 ml 离心管Eppendorf30119401
ACK 溶血缓冲液GibcoA1049201
抗 CD31 PE 抗体Miltenyi Biotec130-115-505
抗 PE 磁珠Miltenyi Biotec130-048-801
牛血清白蛋白 (BSA)Miltenyi Biotec130-091-37610%
CFX384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统Bio-rad1855485用于 qPCR
DNase IWorthingtonLK 0031721 mg/mL 水溶液
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)Gibco10313021
内皮细胞生长培养基-2 (EGM-2)LonzaCC-3162EC 培养基
乙二胺四乙酸 (EDTA)Invitrogen155750200.5 M
汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) ×1Gibco14025092
硬壳 384 孔 PCR 板，薄壁，带裙边，透明/白色Bio-radHSP3805用于 qPCR
高容量 cDNA 反转录试剂盒Applied Biosystems4368813
Liberase TMSigma Aldrich54011190015 mg/mL
MACS LS 分离柱Miltenyi Biotec130-042-401用于内皮细胞分离
MACS 多功能支架Miltenyi Biotec130-042-302用于内皮细胞分离
Microseal 'B' PCR 板密封膜，带粘性，光学透明Bio-radMSB1001用于 qPCR
窄头镊子F.S.T11002-12用于心脏取材
尼龙无菌滤网Falcon35234040 mm
磷酸盐缓冲液 (PBS) ×1Gibco1001023
PowerUp SYBR Green 主混合液Applied BiosystemsA25780用于 qPCR
Quick-RNA 微量提取试剂盒Zymo ResearchR1050用于 RNA 提取
S&T 镊子 - SuperGrip 尖端F.S.T00632-11用于心脏取材
斜视剪刀 - 碳化钨尖端F.S.T14574-11用于心脏取材
Vannas 弹簧剪刀 - 微锯齿F.S.T15007-08用于心脏取材

参考文献

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CD31 qPCR

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