小鼠完全横断型脊髓损伤的诱导

摘要

本方案描述了如何在小鼠模型中创建精确的椎板切除术，以诱导稳定的横断型脊髓损伤，同时最大限度地减少附带损伤，适用于脊髓损伤研究。

摘要

脊髓损伤（SCI）通常会导致不可逆且永久性的功能丧失，最常见原因是创伤。目前，研究人员正在探索多种治疗方法（例如细胞移植技术），以克服SCI引发的严重功能障碍。大多数临床前动物试验均采用啮齿类动物的SCI模型进行。尽管大鼠SCI模型已被广泛使用，但小鼠模型受到的关注相对较少，尽管小鼠模型在许多方面具有显著优势。小鼠体型较小，饲养成本低于大鼠，且存在大量可用的转基因小鼠模型，有利于多种类型的研究。在动物中诱导可重复且精确的损伤是SCI研究的主要挑战，在小型啮齿类动物中尤其需要高精度的外科手术。过去十年中，横断型损伤模型常被用于基于移植的治疗研究，但目前尚无标准化的方法用于在小鼠中诱导完全性横断型损伤。我们已建立一种外科手术方案，可在胸椎第10节段（T10）的C57BL/6小鼠中诱导完全性横断型损伤。该方法采用小头钻头代替咬骨钳，精确去除椎板，随后使用带有圆刃的薄刀片完成脊髓横断。该技术可在小型啮齿类动物中实现可重复的横断型损伤，同时最大限度减少周围肌肉和骨骼的附带损伤，从而降低混杂因素的影响，尤其适用于行为功能结果的分析。

引言

脊髓损伤（SCI）是一种复杂的医学问题，会导致健康状况和生活方式发生巨大变化。目前尚无治愈脊髓损伤的方法，且其病理生理机制尚未被充分阐明。动物脊髓损伤模型，尤其是啮齿类动物模型，为试验新疗法提供了宝贵的工具，并已被用于脊髓损伤研究数十年。迄今为止，在临床前脊髓损伤研究中，超过72%的研究采用了大鼠模型，而仅16%使用了小鼠模型¹。尽管由于大鼠体型较大，且其损伤后形成的空洞与人类脊髓损伤相似，传统上更倾向于选用大鼠作为研究新型治疗策略的模型动物，但如今小鼠（包括多种转基因小鼠模型）正被越来越多地用于研究脊髓损伤的细胞与分子机制²。相较于大鼠，小鼠模型在操作便利性、繁殖速度更快以及成本更低等方面具有额外优势；此外，小鼠与人类在基因组水平上具有高度相似性^1,2,3。小鼠模型的主要缺点在于其体型显著较小，这为建立和治疗脊髓损伤的外科手术操作带来了挑战^4,5。

现有文献中存在一个空白，凸显了建立一种稳定且可重复的小鼠脊髓损伤（SCI）手术方案的必要性。因此，本方案提供了一种新颖且精确的手术方法，以克服这些局限性。本方案详细阐述了在小鼠中诱导横断型损伤的操作指南，因为此类损伤已被公认为最适合研究损伤后再生与退行性变化⁶，以及神经可塑性、神经环路和组织工程策略⁷。我们选择在胸段下部诱导损伤，因为胸段水平的脊髓损伤在文献中应用最为广泛¹。

方案

所有操作均在澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的指导下，经格里菲斯大学动物伦理委员会（ESK/04/16 AEC 和 MSC/04/18 AEC）批准后进行。

1. 手术的动物准备步骤

1. 麻醉并固定动物。
   1. 使用8–10周龄的雌性C57BL/6小鼠。以1 L/min的氧气流速输送5%异氟烷进行麻醉诱导；维持麻醉时，使用1 L/min氧气流速下1.5–2%的异氟烷。通过检测尾部和后肢足垫无痛觉反射来确认麻醉深度。
2.  根据体重皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg体重）以提供镇痛，恩诺沙星（10 mg/kg体重）以提供抗生素覆盖。如需长期镇痛，可给予美洛昔康（2 mg/kg体重）。 
3. 使用加热垫将动物体温维持在37 °C
   1. 剃除背部毛发，暴露脊柱背侧的手术区域。在消毒切口部位前，清除手术区域内的剃除毛发。使用浸有聚维酮碘消毒液和外科酒精的无菌棉签对剃毛区域进行消毒。
4. 将小鼠的四肢用胶带固定于手术区域以稳定动物（图1A）。在小鼠体表覆盖椭圆形手术洞巾（图1B）。

2. 椎板切除术

1. 使用手术刀在 T10 椎体水平做一条垂直正中切口。
   1. 定位 T10 椎体的棘突以确定椎板切除术的位置。椎体位于棘突尖端稍偏头侧⁸（见图2）。棘突尖端大约位于 T11 椎体的中点位置⁸。
   2. 切口长度约为 2.5 cm，使 T10 椎体的棘突大致位于切口长度的中点。
2. 牵开皮肤并使用牵开器进行固定。
   1. 使用直镊提起皮肤与下方筋膜之间的组织，以创造空间放置牵开器；牵开器将保持手术视野开放。
3. 钝性分离皮下组织和筋膜，暴露棘突。
   1. 使用手术刀的钝缘在皮下组织及下方筋膜上做一小段正中切口，以暴露 T9–T11 椎体的棘突。使用细尖镊子（非锐性）进行钝性分离，并将筋膜向两侧牵开。
4. 劈开并分离椎旁肌，暴露椎板。
   1. 使用手术刀的钝头沿 T9–T11 椎体棘突纵向劈开背部躯干肌和椎旁肌。使用钝性细尖镊子逐层进行肌肉的钝性分离，暴露椎板。此操作应尽量减少出血。
      注意：若出现出血，使用预热的生理盐水（37 °C）冲洗，并用棉签控制出血并清除手术区域内的血液。
   2. 使用同一把镊子在 T10 椎体横突周围制作小的间隙。使用弯镊将其钳喙钩住横突下方的间隙，以稳定 T10 椎体（图1C）。
   3. 用温热的生理盐水彻底冲洗 T10 椎板，并用棉签轻轻擦拭干净，以清晰显露骨面。确保双侧骨面无肌肉或韧带附着残留。
5. 使用带有细头钻头（直径 0.55 mm，长度 7 mm）的钻具，在双侧椎板上打孔。
   1. 在未启动钻具的情况下，用钻头尖端沿双侧 T10 椎板从 T9–T10 椎间隙至 T10–T11 椎间隙划出一条垂直路径。此步骤旨在确保钻头不会钩住任何组织（图1D）。
   2. 随后启动钻具，缓慢而小心地在 T10 椎体右侧椎板上钻出一条垂直沟槽。该部分椎板切除操作应在骨质全层形成一条精确的直线手术缺损。操作过程中需保持弯镊的夹持，以稳定椎体。
6. 确保钻头尖端不穿透骨骼而损伤脊髓。在左侧椎板重复相同操作，同时用弯镊保持椎体稳定。使用温热生理盐水冲洗，清除残留的骨碎片。
7. 抬起并移除神经弓的后部结构（图1F）。
   1. 使用角度细尖镊夹住棘突，移除因双侧钻孔而分离的整个背侧椎板段。如有出血，再次冲洗并用棉签擦拭，以清晰显露椎板切除窗下暴露的脊髓（图1E）。

3. 切断

1. 通过刀片单次切割暴露的脊髓，诱导脊髓损伤。
   1. 使用窄而圆的锋利刀片，在椎板切除窗口的中心位置切割脊髓。务必扫过脊柱的侧方隐窝，以确保造成完全性横断损伤（图1G）。
2. 使用钝头精细镊子确认横断损伤的完全性，并清除横断部位任何残留的连接组织。
3. 在关闭手术切口前，如有出血，应予以控制。
4. 使用温盐水冲洗并清除横断脊髓残端发生的出血。必要时可用棉签轻轻加压以实现止血，注意避免压迫脊髓。

4. 关闭切口及术后即刻护理

1. 将肌肉组织对合并分层缝合。
   1. 当横断部位达到止血效果后，松开对T10椎骨的弯钳夹持。将分离的肌肉边缘沿中线对合，确保良好贴合。
   2. 使用5-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）可吸收缝线分层缝合肌肉。确保脊柱的自然曲度不会在缝合线处产生张力或导致缝线裂开，从而暴露椎板切除部位。
2. 缝合皮下组织和皮肤。
   1. 使用5-0不可吸收丝线缝合皮肤切口。缝合前应确认皮下无出血、血凝块或残留异物。此步骤中可能需要用温生理盐水进行最终冲洗。
3. 停止麻醉。观察动物10–30分钟直至其恢复意识。在此期间，动物应继续置于加热垫上。在笼内提供水分凝胶和湿润食物。
4. 术后护理包括在前两天预防性给予布托啡诺（每日两次）和恩诺沙星（每日一次）。此外，应根据动物伦理委员会的指导原则，每天至少手动排空膀胱两次。
   注意：本实验中的动物每日接受两次健康状况和福利评估，包括检查是否持续疼痛（必要时追加布托啡诺剂量）或感染（必要时追加恩诺沙星）、营养与水合状态（若脱水则给予注射用液体）以及是否存在自残行为（如发生轻微自残则进行伤口护理）。强烈建议，包括安乐死决策在内的各项术后护理措施，均应在机构动物伦理委员会的指导下确定。

5. 损伤模型的评估

1. 评估运动功能的丧失。
   1. 在损伤后第2、7、14、21和28天，使用Basso小鼠评分量表（BMS）在开放场地中评估受伤小鼠的运动行为，以确定功能丧失情况⁹（图3C–E）。
2. 组织学确认损伤
   1. 在安乐死（本实验中经动物伦理委员会批准，采用二氧化碳）后，连同椎骨组织一起取出受损的脊髓。
   2. 将组织在4%多聚甲醛中浸泡过夜以固定，并用20%乙二胺四乙酸（EDTA）处理3周进行脱钙，每48小时更换一次新鲜EDTA溶液。
   3. 将脱钙后的脊柱组织制备为冷冻切片样品，切成30 µm厚的切片。
   4. 将切片贴附于明胶包被的载玻片上，用于抗GFAP抗体和Hoechst 33342的免疫染色。
   5. 在荧光显微镜下观察切片（图3A），并使用图像分析软件（例如Nikon分析软件—NIS Elements [图3B]）测量损伤范围。

结果

如图所示的最终方法 图1，需要对小鼠进行充分的固定（图1A）以及对脊柱和椎旁组织的良好可视化（图1B）。棘突和椎板可在几乎不进行肌肉分离且出血极少的情况下清晰显像（图1C，高亮区域）。精细钻孔操作按图示进行 图1D，以创建一个如矩形所示的椎板切除窗。所形成的椎板切除窗清晰，可直接观察和接触到脊髓（图1E，高亮区域）。该过程的示意图概念在下文进行说明。 图1F狭窄的横切刀片可轻松穿过局限的椎板切除窗（图1G）并以平滑的滑动动作，可造成完全横断型损伤（图1H–I）。因此，该方法...

讨论

该方法可在小鼠T10椎体水平诱导完全横断型损伤，导致损伤平面以下动物出现完全性截瘫。总体而言，该方法出血极少，伴随损伤轻微，且可产生稳定、可重复的损伤模型。与先前报道的不进行椎板切除的横断方法相比¹⁰，本方法具有可在不干扰脊柱曲度的情况下直接观察损伤部位、更精确地控制损伤的完全性，以及更好地控制出血并实现止血等优势。该方法的优点在于，其操作方案可修改后应用于T10以外的其他椎体水平，也可用于实施其他类型的损伤，如半横断、部分背侧横断、背根撕脱、挤压伤和挫伤等。

该方案的一个主要组成部分是使用细尖钻头。尽管使用钻头可能需要较高的操作技能和更广泛的训练，但它能够实现干净且完整的椎板切除。另一个关键因素是使用窄刃刀具进行横断，而不是使用显微剪刀。与使用剪刀相比，这种方法可减少不必要的附带损伤。然而，相反地，如果施加过大的侧向压力，刀片可能会对椎体造成一定程度的损伤。所述方案可能需要术者进行一些问题排查。如果椎板切除操作不当，可能会残留骨刺，从而限制进入椎板切除窗。插入细尖镊子的一个齿尖可使术者夹住并折断任何残留的骨刺。但在此过程中必须注意避...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Baytril 注射液 50 mg/mL，50 mL	Provet	BAYT I	术后护理药物
碘伏 500 mL	Provet	BETA AS	耗材
Castroviejo 持针器，带锁扣	ProSciTech	T149C	可重复使用
陶瓷氧化锆刀片，圆形带锐边，单刃，带角度	ProSciTech	TXD101A-X	可重复使用
棉签（5支）	Multigate	21-893	耗材
Dremel Micro	DREMEL	8050-N/18	无线旋转工具
精细敷料镊	Multigate	06-306	一次性使用
钻头	Kemmer Präzision	SM 32 M 0550 070	可重复使用
Dumont #7b 镊子	Fine Science Tools	11270-20	可重复使用
Dumont 镊子，型号 5	ProSciTech	T05-822	可重复使用
毛发修剪器	WAHL	WA9884-312	零重叠毛发修剪器
虹膜剪，钛材质，尖端锋利，直型，90 mm	ProSciTech	TY-3032	可重复使用
异氟烷 Isothesia NXT 250	Provet	ISOF 00 HS	麻醉剂
Colibri 牵开器 - 4 cm	Fine Science Tools	17000-04	可重复使用
手术刀柄	ProSciTech	T133	可重复使用
Signature 乳胶外科手套，7.5 号	Medline	MSG5475	耗材
氯化钠 0.9%	STS	PHA19042005	耗材
无菌敷料包	Multigate	08-709	一次性使用
无菌防水手术巾 60x60 cm	Multigate	29-220	一次性使用
外科酒精 100 mL	Provet	# SURG SP	耗材
缝合材料 - 黑色丝线 45 cm 5/0 FS-2	Johnson & Johnson Medical	682G	丝线缝合线
缝合材料 - Vicryl 70 cm 5-0 S/A FS-2	Johnson & Johnson Medical	VCP421H	Vicryl 缝合线
镇痛新 0.3 mg/1 mL，5 支（S8 类药物）	Provet	TEMG I	术后护理药物