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利用实时细胞分析监测流感病毒在宿主外的存活情况

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DOI：

10.3791/61133

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2021年2月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Institut Pasteur, Unité Environnement et Risques Infectieux, Cellule d'Intervention Biologique d'Urgence (CIBU), 3Cellule Pasteur, Université de Paris

本文内容

摘要

本文报告了一种利用实时监测感染细胞的电学阻抗来定量具有感染性的病毒颗粒的实验方案。通过在模拟环境条件的不同理化参数下定量甲型流感病毒的衰减，展示了该方法的一个实际应用。

摘要

病毒颗粒定量方法是许多病毒学研究中的关键环节。尽管目前已存在多种可靠的检测技术，但这些方法往往耗时较长，或难以检测到微小的变化。本文介绍了一种通过实时分析感染细胞引起的电学阻抗变化来精确测定病毒滴度的实验方案。该方法利用位于微孔板底部、细胞下方的金微电极生物传感器测量细胞阻抗，其信号强度取决于细胞数量及其大小和形态。本方案可实现对细胞增殖、活性、形态和迁移的实时分析，并具有更高的灵敏度。文中还提供了一个实际应用示例，即通过该方法定量分析甲型流感病毒（IAV）在不同影响其感染性的理化因素（如温度、盐度和pH值）作用下随时间发生的失活过程。在此类应用中，该方案不仅减少了工作量，还能生成对感染性病毒颗粒的精确量化数据。此外，该方法可用于比较不同IAV毒株的失活斜率，从而反映其在特定环境中持续存在的能力。本方案操作简便、重复性高，适用于所有在细胞培养中可引起细胞病变效应的病毒。

引言

病毒的传播依赖于多种因素的共同作用。对于在环境中释放的病毒而言，其传播还取决于在宿主外环境中存活的能力。因此，研究病毒失活过程对于协助国家卫生机构和政策制定者实施控制措施和生物安全措施至关重要。

在过去十年中，关于病毒在自然环境和实验室条件下的持久性知识已显著增加。以甲型流感病毒（IAV）为例，其传播途径使病毒颗粒暴露于多种环境条件之下。具体而言，它们可通过以下途径传播：1）通过水体经粪口途径传播（即禽类病毒），或 2）通过被污染的媒介物、气溶胶和呼吸道飞沫进行直接或间接接触传播（即家禽和哺乳动物病毒）1。无论何种情况，IAV 均会受到多种理化参数（如 pH、盐度、温度和湿度）的影响，这些因素会不同程度地快速影响其感染性2,3,4,5,6,7,8,9。尤其对于人畜共患病毒和大流行病毒而言，评估环境因素对病毒传播动态、暴露风险以及跨物种传播可能性的影响具有重要意义。

迄今为止，传统病毒学技术（例如通过噬斑实验或50%组织培养感染剂量测定来确定病毒滴度）已被用于评估甲型流感病毒（IAV）随时间变化的感染能力；但这些技术耗时较长，且需要大量试剂和耗材10,11,12。利用微电极随时间测量感染细胞的阻抗，是一种监测IAV在不同环境条件下存活情况以及病毒总体失活过程的有效工具。该方法可提供客观的实时数据，取代对细胞病变效应的主观人工观察。该技术可用于确定病毒滴度，从而替代传统检测方法，获得更小的置信区间，并避免劳动密集型的终点测定实验。

通过细胞阻抗测量法与经典蚀斑实验或TCID50方法所获得的滴定结果之间存在线性相关性。因此，可通过病毒连续稀释建立标准曲线，将基于阻抗的滴定方法所得数据便捷地转换为TCID50或pfu值13,14,15,16,17。该实验方法还可用于检测、定量及评估血清样本中中和抗体的效价18,19。近年来，基于阻抗的细胞检测技术已被用于筛选和评价抗马属α疱疹病毒的抗病毒化合物20。

该技术已被用于评估甲型流感病毒（IAV）在不同温度的盐水中的存留能力，并鉴定出甲型流感病毒血凝素中可增强或减弱其在环境中存留能力的突变21。若采用传统的滴定方法，此类筛选将需要大量工作。然而，该方法可适用于任何对细胞形态、细胞数量及细胞表面附着强度产生影响的病毒。此外，该方法还可用于监测病毒在多种环境条件下的存留情况（例如，在空气、水体或物体表面中）。

本文所述方案以流感病毒（IAV）在水中的存活为例。人类流感病毒在长时间内会暴露于不同的理化参数下。根据先前的研究结果9，选择35 °C、盐度为35 g/L NaCl的盐水作为环境模型。通过细胞感染实验，在不同时间点定量检测暴露后病毒的残余感染性。将MDCK细胞（IAV扩增的参考细胞系）接种于16孔微孔板中，该微孔板表面涂有微电极传感器，并在接种24小时后用暴露过的病毒进行感染。每15分钟测量一次细胞阻抗，并以一个称为细胞指数（CI）的任意单位表示。流感病毒引起的细胞病变效应，其发生速率直接取决于接种到细胞培养物中的感染性病毒颗粒数量，从而导致CI值下降，该下降过程随后被量化为CIT50值。该值对应于从初始CI（即加病毒前）下降50%所需的时间。通过计算多个环境暴露时间下的CIT50值，可对CIT50值进行线性回归分析，从而推导出病毒的灭活斜率。

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方案

根据适当的生物安全等级要求（根据亚型确定为BSL-2或更高等级）操作所有流感病毒。使用低传代历史的甲型流感病毒（IAV）毒株（在MDCK细胞上传代少于5次），以确保实验间变异程度较低。

1. 试剂与起始材料的准备

  1. MDCK 细胞和无菌细胞培养基的制备
    1. 在添加了10%热灭活胎牛血清（FCS）以及抗生素（100 单位/mL 青霉素，100 mg/mL 链霉素）的改良伊格尔培养基（MEM）中培养 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞。
    2. 解冻后，感染前至少传代2次以确保细胞完全恢复（但传代次数少于30次，以避免细胞表型发生漂移）。
    3. 在含有30 mL无菌1×MEM的75 cm2组织培养瓶中接种7.5 × 106个MDCK细胞，并在37 °C、加湿、含5% CO2的培养箱中孵育。
  2. 阻抗监测设备的准备
    1. 将仪器置于35 °C的培养箱中，并预热至少2小时。
    2. 将其连接至放置在培养箱外的控制单元。
    3. 在开始实验其余步骤之前，按照制造商推荐的程序进行清洁。
  3. 在MDCK细胞上制备IAV病毒储备液
    1. 为扩增H1N1病毒，在两个75 cm2组织培养瓶中各接种7.5 × 106个MDCK细胞，并在37 °C孵育24小时，使其达到90%–100%汇合度。
    2. 从75 cm2培养瓶中的细胞单层上吸除细胞培养基，用5 mL无菌1×PBS洗涤细胞。
    3. 吸除PBS，再加入5 mL 1×PBS重复洗涤细胞一次。
    4. 标记其中一个培养瓶作为对照组，吸除PBS后，小心地在单层细胞上加入15 mL病毒增殖培养基（含0% FCS的1×MEM），并将该培养瓶置于35 °C、含5% CO2的培养箱中孵育，用于3天增殖后的比较。
    5. 在室温下解冻一管IAV储备病毒，在含有病毒增殖培养基（含0% FCS的1×MEM）的1.5 mL离心管中将其稀释至适当浓度。
    6. 吸除75 cm2培养瓶中的1×PBS，通过加入1 mL稀释后的病毒液，以每个细胞1 × 10-3或1 × 10-4斑块形成单位（pfu/cell）的感染复数（MOI）感染MDCK细胞。
    7. 在室温下吸附病毒45分钟，每隔15分钟轻轻摇动培养瓶一次，使病毒与MDCK细胞充分结合。
    8. 轻柔吸除接种物，每瓶加入含1 µg/mL TPCK-胰蛋白酶（胰蛋白酶/L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）的15 mL病毒增殖培养基，以将病毒血凝素HA0切割为HA1和HA2亚基（此过程为HA与内涵体膜融合并释放病毒基因组所必需）22。
    9. 将培养瓶置于35 °C、含5% CO2的培养箱中孵育至少3天，以实现病毒复制。
    10. 在40倍显微镜下观察MDCK细胞，并观察细胞病变效应（CPE）（与对照组培养瓶比较）。若CPE不完全（即约80%细胞从基质脱落），则将培养瓶放回培养箱继续孵育24小时。
    11. 当CPE完全时，吸除细胞培养上清液，并在300 x g下离心10分钟，以沉淀细胞碎片。
    12. 将澄清的上清液转移至15 mL离心管中，并将子代病毒分装至一次性无菌冻存管中。立即将冻存管置于-80 °C冷冻保存病毒储备液。

2. 确定感染细胞所需的合适细胞数量

注意：在所有实验过程中，始终将培养板置于非静电表面，例如包装用的纸张包裹物上。请遵循下文第2节，以确定接种到电子微孔板（设计为E-Plate）中的最适细胞浓度。

  1. 实验前24小时，在75 cm2 培养瓶中培养MDCK细胞，以获得刚传代的细胞（约80%融合度）。
  2. 用5 mL 1× PBS洗涤细胞，并加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱落。
  3. 加入7 mL新鲜细胞培养基，使用自动细胞计数仪结合台盼蓝染色对细胞进行计数。
  4. 用细胞培养基将细胞浓度调整为400,000个细胞/mL。在其他试管中进行连续两倍稀释，获得200,000；100,000；50,000；25,000；12,500；和6,250个细胞/mL的细胞密度。根据细胞类型及其生长特性，调整细胞的稀释范围。
  5. 将E-板（材料表）置于室温下数分钟，并使用多通道移液器向每孔加入100 µL细胞培养基。切勿触碰E-板上的电极。
  6. 解锁支架，将E-板前端插入阻抗测量仪（材料表）的支架槽中，关闭培养箱门。
  7. 打开软件。
    1. 在“默认实验模式设置”中，选择所需的支架，双击顶部页面，输入实验名称。点击“布局”，为板上每个选定孔输入必要的样品信息；完成后点击“应用”。点击“时间表” | “步骤” | “添加步骤”。软件将自动添加一个1秒的步骤，用于测量背景阻抗（CI）。
    2. 在“执行”选项卡中点击“开始/继续”。点击“绘图”，通过选择相应孔添加所有样品，并确保CI值在-0.1至0.1之间，然后进入下一步。
  8. 将E-板从支架中取出。
  9. 将步骤2.4中各细胞悬液各取100 µL，重复加入相应孔中；对照孔中加入100 µL细胞培养基。将E-板置于超净工作台中，室温静置30分钟，以使细胞在孔底均匀分布。
  10. 将E-板插入支架槽中。在软件中点击“时间表” | “添加步骤”，设置每30分钟监测一次细胞，共200次重复。然后选择“开始/继续”。
  11. 点击软件中的“绘图”按钮，查看并绘制CI数据。选择接种后24小时、即将进入平台期之前的细胞浓度，以确保在病毒感染时细胞仍处于生长期。当CI达到最大值时，即表示进入平台期。

3. CIT50 值与感染复数之间的相关性

  1. 在E-板的每个孔中加入100 µL无菌的1× MEM培养基。将E-板插入仪器的托架槽中，于35 °C条件下测量背景值，操作方法见步骤2.7。
  2. 将E-板从托架中取出。
  3. 在电子微孔板的每个孔中接种3 × 104个新分裂的MDCK细胞，并在35 °C、5% CO2条件下培养24小时，使细胞在感染IAV时处于增殖期。
  4. 使用已知滴度为6 log10 TCID50/mL的H1N1病毒进行10倍系列稀释，通过以下步骤采用反向移液法感染MDCK细胞，以确保实验可重复性：
    1. 用不含FCS的MEM培养基（病毒增殖培养基）清洗MDCK细胞两次，每次100 µL。注意第二次洗涤后需彻底去除所有培养基，以避免接种物被进一步稀释。
    2. 使用单通道移液器在每个孔中加入100 µL病毒悬液。为避免污染，操作时应从左至右、从上至下依次进行，并用盖子覆盖其余未操作的孔。
    3. 将E-板轻柔地插入仪器托架槽中，置于35 °C环境。操作时应轻缓，避免剧烈移动导致污染。
    4. 按照步骤2.10所述方法，开始每15分钟监测一次细胞阻抗，持续至少100小时。
    5. 完成两轮测量（即30分钟）后，点击“暂停”选项卡中的“暂停”按钮暂停仪器，然后将E-板从托架中取出。
    6. 向病毒增殖培养基中添加1 µg/mL TPCK-胰蛋白酶，以切割病毒血凝素。
    7. 向每个孔中加入含TPCK-胰蛋白酶的病毒增殖培养基100 µL，并将E-板重新插入托架槽中。
    8. 点击“执行”选项卡中的“开始/继续”按钮。
      注意：务必设置阴性对照，即用病毒增殖培养基替代病毒悬液处理细胞，以模拟未感染状态。

4. 流感病毒A的存活动力学

  1. 将IAV暴露于35 °C的生理蒸馏水中，并通过检测细胞阻抗的降低随时间变化来测定其感染性。
    1. 通过将NaCl加入蒸馏水中至终浓度为35 g/L，制备生理蒸馏水。将900 µL生理水加入2 mL冻存管中。
    2. 在生理水中加入100 µL病毒原液，将冻存管置于培养箱（35 °C，5% CO2）中孵育1 h、24 h或48 h。
    3. 在16孔微孔板中每孔接种100 µL（含3 × 104个）新传代的MDCK细胞，在37 °C和5% CO2条件下培养24 h。
    4. 使用反向移液法，将100 µL经暴露处理的病毒（先前用培养基稀释10倍）接种至细胞，通过重复第3.4节操作以确保可重复性。
  2. 每15分钟监测一次细胞阻抗，持续至少100小时。

5. 感染性丧失的评估

  1. 测定 CIT50 值，以量化由病毒诱导的细胞病变效应导致的 CI 降低，该值定义为 CIT50。
    1. 点击“绘图”，然后通过点击“全部添加”将所有样本加入。通过点击“导出实验信息”将结果导出至电子表格。将初始 CI 定义为病毒感染细胞后 5 小时测得的细胞阻抗值（即 MDCK 细胞接种于微孔 E-板后 24 小时）。
    2. 计算 CIT50 值，即从初始 CI 值下降 50% 所需的时间。为计算 CIT50 值，记录每个样本在 5 hpi（感染后 5 小时）的 CI 值，然后在电子表格中使用索引和匹配函数，找出 CI 值等于 5 hpi 时 CI 值一半的时间点。
  2. 平均灭活斜率的计算
    1. 针对不同暴露时间（以天为单位）的各病毒悬液，确定其对应的 CIT50 值。
    2. 根据绘制的 CIT50 值进行线性回归分析，所得斜率称为灭活斜率，单位为 CIT50.day-1。

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结果

接种不同浓度 MDCK 细胞（每孔 15,000 至 120,000 个细胞）培养 120 小时后获得的原始数据如图 1所示。培养 24 小时后，细胞指数（CI）检测结果显示，接种 30,000 个细胞的孔中细胞仍处于对数生长期，因此后续实验采用该细胞浓度。图 2展示了 CIT50 值与初始感染复数（MOI）之间的线性相关性。MDCK 细胞培养 24 小时后，用 A/Paris/2590/2009 H1N1 病毒株以不同感染复数进行感染，并在感染后 5 小时测定初始细胞指数。

图3 展示了我们在实验中采用的实验流程（图A）。图B显示了由于病毒引起的细胞病变效应导致细胞指数（CI）下降的典型结果。这些数据是软件处理后的原始数据。在将数据导出至电子表格后，计算得到CIT50值。在计算不同时间点的CIT50值后，通过线性回归分析确定斜率（图C）。...

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讨论

RTCA 是一种基于阻抗的技术，正越来越多地用于实时监测细胞特性，如细胞黏附、增殖、迁移和细胞毒性。本研究通过测量病毒失活斜率，展示了该技术评估流感病毒（IAV）在宿主外存活能力的应用。传统的繁琐技术，如 TCID50 和蚀斑实验，被对细胞活力的客观实时评估所取代，从而反映病毒诱导的细胞病变效应。与 TCID50 或蚀斑形成单位（pfu）类似，CIT50 也与感染复数呈线性相关（图 2）。该方法的局限性之一在于，无法精确监测感染了非致细胞病变性病毒的细胞。

例如，将新的突变引入病毒基因组可显著减弱病毒并降低其细胞病变效应。相比之下，此处计算的灭活斜率与病毒复制及潜在的病毒减毒无关，因为该斜率是基于同一病毒在不同灭活时间点测得的 CIT50 值得出的。因此，此处假设在此灭活程序后仍具有感染细胞能力的病毒颗粒，其复制表型与灭活前的病毒相同。

尽管成本较高，但采用该方法可显著降低工作量，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25%胰蛋白酶ThermoFisher25200056
75 cm2 组织培养瓶Falcon430641U
E-Plate 16（6块）ACEA Biosciences, Inc5469830001E-plates有不同包装规格可选
胎牛血清（FCS）Life technologies (gibco)10270-106
MEM 1XLife technologies (gibco)31095029
PBS 1XLife technologies (gibco)14040091
青霉素-链霉素Life technologies (gibco)11548876
TPCK处理的胰蛋白酶（TPCK-Trypsin）WorthingtonLS003740
xCELLigence 实时细胞分析仪 S16ACEA Biosciences, Inc380601310xCELLigence RTCA S16 仪器有多种规格可选（16孔、96孔、单板或多板）

参考文献

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