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基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

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DOI：

10.3791/61146

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2020年5月13日

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

本文内容

摘要

本文介绍了一种灵敏的荧光检测方法，利用二酰基甘油肽和炔基磷脂作为底物，结合点击化学反应，用于监测载脂蛋白N-酰基转移酶的活性。

摘要

变形菌门细菌的脂蛋白在翻译后会被膜磷脂来源的脂肪酸通过三种整合膜酶的作用进行修饰，从而形成三酰基化蛋白。脂蛋白修饰途径的第一步是将磷脂酰甘油上的二酰基甘油基团转移至前体脂蛋白上，生成二酰基甘油前体脂蛋白。第二步中，前体脂蛋白的信号肽被切除，形成载脂蛋白，随后该载脂蛋白再被来自磷脂的第三条脂肪酸所修饰。最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）催化。该脂蛋白修饰途径在大多数γ-变形菌中至关重要，因此成为开发新型抗菌药物的潜在靶点。本文介绍了一种灵敏的Lnt检测方法，适用于对小型抑制分子进行高通量筛选。由于该酶及其底物均为膜结合分子，体外检测方法的建立并不简单，涉及在去垢剂存在条件下纯化有活性的酶、获取炔基磷脂和二酰基甘油肽底物，以及在混合胶束体系中优化反应条件。此外，为了将该活性检测用于高通量筛选（HTS）体系，优先采用对反应产物的直接检测，而非依赖偶联酶反应。在此荧光酶学检测法中，炔基三酰基化肽产物通过点击化学反应生成荧光信号，并在多孔板中进行检测。该方法也可应用于其他使用含脂肪酸底物（包括磷脂和酰基辅酶A）的酰基转移酶研究。

引言

细菌脂蛋白的特征是在其氨基末端通过共价结合的脂肪酸锚定在膜上1,2。蛋白质的成熟部分在结构和功能上具有高度多样性，从而解释了脂蛋白在细菌细胞包膜多种生物学过程中的作用。

脂蛋白在插入细胞质膜后，会被磷脂衍生的脂肪酸修饰。前体脂蛋白含有一个特征性基序——脂盒（lipobox），其中包含一个不变的半胱氨酸残基，该残基会被酰化，并成为成熟蛋白的第一个氨基酸。该途径的第一步由前体脂蛋白磷脂酰甘油：二酰基甘油转移酶（prolipoprotein phosphatidylglycerol::diacylglyceryl transferase, Lgt）催化，该酶将二酰基甘油基团从磷脂酰甘油转移至前体脂蛋白，通过二酰基甘油与半胱氨酸之间的硫醚键连接。信号肽酶II（signal peptidase II, Lsp）切割二酰基甘油修饰的前体脂蛋白的信号肽，产生一种通过其二酰基甘油部分锚定在膜中的载脂蛋白。第三步也是最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（apolipoprotein N-acyltransferase, Lnt）催化，该酶将一个脂肪酸从 sn磷脂的-1位点与载脂蛋白结合，形成三酰化成熟脂蛋白（图1)3Lnt反应是一种两步乒乓反应，反应过程中会形成稳定的硫酯酰基酶中间体。在反应的第二步，溶血磷脂副产物在载脂蛋白底物发生酰化之前即被释放。

磷脂底物特异性通过Lnt酶活性检测来确定，该检测基于N-酰基二酰基甘油肽在高浓度Tris-Tricine尿素SDS-PAGE凝胶中的迁移率变化4。具有小极性头部基团、饱和[sn-1]和非饱和[sn-2]链的磷脂是优选的底物4。凝胶迁移实验不适用于对载脂蛋白N-酰基转移酶进行深入的动力学研究，也不适用于高通量筛选以鉴定抑制性分子。利用炔基脂肪酸的点击化学已被成功用于研究细菌中的脂蛋白修饰5以及真核生物中的脂肪酸代谢6。最近，已有报道建立了一种体外Ras棕榈酰化检测方法用于筛选抑制剂7。

在本方法中，将去垢剂中的纯化活性Lnt与混合胶束中的底物共同孵育，生成炔基三酰化肽，随后通过荧光光谱法进行检测。

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方案

1. 酶和底物的制备

  1. 酶的纯化
    1. 按照先前所述方法4,8，从去垢剂溶解的膜中生产和纯化Lnt酶。简言之，在OD600为0.6时，加入无水四环素（200 ng/mL）于37 °C诱导表达编码带有C端Strep标签的Lnt的lnt-strep基因，持续16 h。
    2. 在4,000 x g条件下离心10 min收集细胞，弃去上清液。
    3. 将细胞沉淀重悬于缓冲液WA（20 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA）中，使浓度达到每毫升100 OD600单位。
    4. 使用法国压榨细胞破碎仪在10,000 psi压力下通过两次以破碎细胞。
    5. 在13,000 x g条件下离心20 min，去除未破碎的细胞和碎片，保留上清液并弃去沉淀。
    6. 将上清液在120,000 x g条件下离心60 min，收集膜囊泡（呈半透明棕色沉淀），弃去上清液。
    7. 用含1% (w/v) n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的缓冲液WA在室温（RT）下处理膜沉淀30 min，以溶解整合膜蛋白。在120,000 x g条件下离心30 min，去除不溶物。使用上清液部分进行纯化。
    8. 按照Nozeret等人的方法8，使用亲和层析柱（见材料表）和S400凝胶过滤柱（见材料表）纯化Lnt-strep。
    9. 将纯化的酶储存于含0.05% DDM和10%甘油的缓冲液WA中，置于-80 °C保存。
      注：该酶可稳定保存超过5年。
  2. 炔基磷脂和生物素化成纤维细胞刺激配体（FSL-1-biotin）底物的制备
    1. 将定制合成的炔基-POPE（1-十六碳-15-炔酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺，见材料表）氯仿溶液各100 µL分装至1.5 mL离心管中。
    2. 用注射器刺穿管盖，在室温（RT）下使用真空浓缩仪蒸发氯仿2 h。将干燥的磷脂样品储存于-20 °C。
    3. 使用前将炔基-POPE溶解于0.1% Triton X-100中，终浓度为500 µM。如有需要，可在室温下于超声水浴中进行3 min超声处理以助溶解。
    4. 将FSL-1-biotin以445 µM浓度溶于水中。
      注：两种溶液均可在-20 °C下储存至少2个月。

2. 试管实验

注意：第1天，在1.5 mL离心管中设置Lnt反应（步骤2.1），并用链霉亲和素包被96孔板（步骤2.2）。

  1. Lnt 反应试剂混合物的制备与酶促反应
    1. 在标准 Lnt 检测中，于 1.5 mL 离心管中，将炔基-POPE（终浓度 50 µM，来自 500 µM 储液）和 FSL-1-生物素（终浓度 50 µM，来自 445 µM 储液）加入 Lnt 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2、150 mM NaCl、0.1% Triton X-100 含 1% BSA）中，终体积为 18 µL。所有条件均设三个重复。
    2. 将步骤 2.1.1 中配制的底物混合物在超声水浴中处理 3 分钟，随后于 37 °C 预孵育 5 分钟，再加入 Lnt 酶（步骤 2.1.3）。
      注意：MTSES（钠 (2-磺酸乙基)甲基硫代磺酸盐）是一种巯基特异性试剂，可抑制 Lnt8。向用于阴性对照样品的反应管（步骤 2.1.1）中加入 10 mM MTSES（100 mM 储液溶于 100% DMSO）。调整 Lnt 反应缓冲液体积，使总体积为 18 µL。
    3. 加入有活性的 Lnt（1 ng/µL，相当于 17.2 nM）或无活性的 Lnt（C387S）（2 µL，10 ng/μL 储液溶于含 0.05% DDM 的 WA 缓冲液），通过移液器吹打混匀，与底物（步骤 2.1.2）混合。
    4. 将反应体系在带加热盖的恒温混匀仪中 37 °C 孵育 16 小时。
  2. 96 孔板的链霉亲和素包被
    1. 以 H2O 配制 2 mg/mL 的链霉亲和素储存液。
      注意：该溶液可在 -20 °C 保存长达 6 个月。
    2. 将储存液稀释，以水配制 10 µg/mL 的链霉亲和素工作液。每孔加入 100 µL 工作液至 96 孔板各孔。于 37 °C 孵育过夜，不加盖，使孔内液体自然风干，从而使链霉亲和素结合至板上。

注意：第2天进行点击化学反应（步骤2.3），将Lnt反应混合物结合到链霉亲和素包被的板上（步骤2.4），检测荧光并分析结果（步骤2.5）。

  1. 点击化学反应
    1. 配制以下储备液：叠氮-FAM（5 mM，溶于DMSO）、TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐；50 mM，溶于水）、TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺；2 mM，溶于叔丁醇:DMSO (4:1)）、CuSO4∙5H2O（50 mM，新鲜配制于H2O中）。
    2. 在步骤2.1.4制备的含Lnt反应混合物的1.5 mL离心管中，按以下顺序加入试剂进行点击化学反应：0.2 µL叠氮-FAM储备液（终浓度50 µM）、0.4 µL TCEP储备液（终浓度1 mM）、0.2 µL TBTA储备液（终浓度0.02 mM）。
    3. 涡旋混匀5秒，然后加入0.4 µL CuSO4储备液（终浓度1 mM），再次涡旋5秒。将样品避光于室温孵育1小时。
  2. 将Lnt反应混合物结合至链霉亲和素包被的板上
    1. 在完成步骤2.2.2的过夜孵育后，用200 µL PBS-T1（含0.05% Tween-20的PBS）对链霉亲和素包被板的孔进行3次洗涤。
      注：链霉亲和素板可立即使用，或干燥保存于4 °C。
    2. 从步骤2.3.3的点击化学反应混合物中取18 µL转移至96孔链霉亲和素包被板的一个孔中，并加入100 µL PBS-T1，使N-酰基-FSL-1-生物素-FAM产物结合至链霉亲和素板上。
    3. 使用生物素-荧光素（由DMSO中3.1 mM储备液稀释至0.26 µM）作为链霉亲和素结合和荧光检测的阳性对照。
    4. 将板置于恒温混匀仪中，避光、300 rpm振荡，室温孵育1小时。
    5. 使用多通道电子移液器手动洗涤96孔板，步骤如下：用200 µL PBS-T2（含1% Tween-20的PBS）洗涤6次，每次用移液器冲洗3次；再用200 µL PBS洗涤3次，每次同样冲洗3次。
  3. 荧光检测与分析
    1. 每孔加入200 µL PBS，使用荧光酶标仪在520 nm处记录荧光值，并将结果保存至电子表格软件中。
      注：使用0.26 µM生物素-荧光素作为链霉亲和素结合及520 nm荧光检测的阳性对照，预期可获得30,000–40,000 A.U.之间可重复的读数。所有样品（包括对照）均设三个重复孔进行分析。
    2. 使用统计学软件计算每个反应的标准差，并采用非配对t检验计算阴性对照与阳性样品之间的P值。

3. 多孔板检测

注意：第1天在384孔板中设置Lnt反应（步骤3.1），并用链霉亲和素包被384孔板（步骤3.2）。

  1. 试剂混合物的制备与酶促反应
    注意：与试管法相比，本方法减少了试剂和酶的用量，并直接在384孔板中进行Lnt反应。这使得材料使用量更少，步骤更简化，便于进一步自动化。
    1. 按如下方式混合底物：在384孔板中，每孔每反应加入13.5 µL反应体系，包含炔基-POPE（终浓度50 µM，来自500 µM储备液）和FSL-1-生物素（终浓度50 µM，来自500 µM储备液），溶于Lnt反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100，含1% BSA）。所有条件均设三个重复。根据所需反应总数计算所需试剂总量（例如，一个384孔板需要5,184 µL）。
    2. 将底物混合物在超声水浴中处理3分钟。
    3. 将13.5 µL底物混合物分装至384孔板的每个孔中。
      注意：作为阴性对照，可在每孔中加入10 mM MTSES（625 mM储备液溶于100% DMSO）。调整Lnt缓冲液体积（步骤3.1.1），使终反应体积为13.5 µL。
    4. 在加入Lnt酶（步骤3.1.5）前，于37 °C预孵育5分钟。
    5. 向含有步骤3.1.3所得反应混合物的各孔中，加入0.5 ng/µL（相当于8.6 nM）有活性的Lnt酶，或无活性突变体（C387S）（从含0.05% DDM的缓冲液WA中取1.5 µL，酶储备液浓度为5 ng/µL），溶于Lnt反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2，150 mM NaCl，0.1% Triton X-100，1% BSA）。通过移液上下吹打混合试剂。总反应体积为15 µL。
    6. 用多孔板专用塑料封板膜密封孔板。
    7. 在带加热盖的恒温混匀仪中，于37 °C孵育16小时。
  2. 链霉亲和素包被384孔板
    1. 取步骤2.2.2中制备的链霉亲和素溶液（10 µg/mL，溶于H2O）75 µL，用于包被384孔板的孔壁。将孔板置于37 °C孵育过夜，不加盖，使孔内液体自然风干，从而使链霉亲和素结合至孔板表面。

注意：第2天进行点击化学反应（步骤3.3），将Lnt反应混合物结合到链霉亲和素包被的板上（步骤3.4），检测荧光并分析结果（步骤3.5）。

  1. 点击化学反应
    1. 配制以下储备液：叠氮荧光素（Azido-FAM，1.2 mM，溶于DMSO）、TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐；24 mM，溶于H2O）、TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺；0.48 mM，溶于叔丁醇:DMSO (4:1)）和CuSO4∙5H2O（24 mM，新鲜配制于H2O中）。
    2. 混合三种点击化学试剂：将Azido-FAM（终浓度50 µM）、TCEP（终浓度1 mM）和TBTA（终浓度0.02 mM）按每种试剂各0.75 µL加入，使每孔总体积为2.25 µL。根据384孔板的使用孔数计算所需总体积（例如，若使用全部孔，则共需864 µL）。充分混匀。
    3. 将2.25 µL上述试剂溶液直接加入来自步骤3.1.7的已完成Lnt反应的384孔板各孔中。
    4. 使用多通道电子移液器反复吹打混匀。
    5. 加入CuSO4（从24 mM储备液中取0.75 µL，终浓度为1 mM），并用多通道电子移液器反复吹打混匀。
    6. 避光、室温孵育1小时。
  2. Lnt反应产物与链霉亲和素包被的384孔板的结合
    1. 在完成步骤3.2.1的过夜孵育后，用85 µL PBS-T1对链霉亲和素包被的孔板洗涤1次。
    2. 将来自步骤3.3.6孵育板中每孔11 µL的点击化学反应液转移至步骤3.4.1的链霉亲和素包被板中，使N-酰基-FSL-1-生物素-FAM产物结合至链霉亲和素板上。
    3. 加入64 µL PBS-T1缓冲液。
    4. 以生物素-荧光素（从DMSO中的3.1 mM储备液稀释至0.19 µM）作为对照，用于检测其在链霉亲和素包被孔中的结合情况。
    5. 将384孔板置于恒温混匀仪中，避光、室温孵育1小时，以300 rpm振荡。
    6. 使用自动洗板机进行洗涤：用85 µL PBS-T2洗涤10次，每次洗涤间振荡；再用85 µL PBS洗涤5次，每次洗涤间振荡。
  3. 荧光检测与分析
    1. 加入PBS（85 µL），并在荧光酶标仪中于535 nm波长下记录荧光信号。
    2. 按所述方法分析数据（步骤2.5.2）。

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结果

在Lnt反应中 sn-1 脂肪酸从磷脂转移至二酰基甘油肽，生成成熟的三酰基化肽8体外Lnt酶活性检测方法旨在利用含有炔基脂肪酸（alkyne-POPE）和FSL-1-biotin作为底物，生成炔基修饰的FSL-1-biotin（alkyne-FSL-1-biotin）。通过与叠氮标记的FAM（azido-FAM）发生点击化学反应后，该产物可被荧光标记，并通过荧光光谱法进行检测。图 2).

在酶浓度为1 ng/µL时，于酶标仪中在520 nm处获得最大荧光信号，反应条件已对此进行了优化。在此条件下，FSL-1-生物素被完全转化8（图3）。阴性对照包括无酶的反应、使用酶的无活性变体（活性位点突变体C387S）的反应，以及使用巯基特异性抑制剂MTSES的反应，这些均导致荧光信号检测值较低。生物素-荧光素可高效结合至链霉亲和素包被的微孔板，并用作最大荧光信号的...

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讨论

本文所述基于三酰化产物荧光检测的Lnt酶活性检测方法具有高灵敏度和良好的可重复性。生物素与链霉亲和素之间的特异性及高效结合是该检测方法的关键环节。Lnt反应完成后残留的炔基-POPE底物同样可被FAM荧光标记，但通过多次洗涤步骤，其在链霉亲和素包被的孔板上的结合物可被有效去除。此外，DMSO的加入不影响Lnt酶的活性，对检测体系亦无干扰。由于底物和酶均具有高度亲脂性，反应需在混合胶束体系中进行。依赖可溶性酶和底物进行产物检测的技术（如荧光偏振法）不适用于本实验8。该检测方法唯一的限制在于酶对炔基底物的兼容性，因为“点击化学”反应依赖于该化学基团的存在。

已有先前研究报道使用凝胶迁移实验分析Lnt活性并确定其底物特异性4。根据本实验方案，结合荧光光谱法，可通过凝胶内荧光检测来监测Lnt活性8，尽管该方法不适用于高通量筛选（HTS）。试管法对于Lnt突变体的动力学和比较研究尤为适用。可通过使用炔基脂肪酸（其具有不同的碳链长度和饱和度）对细菌进行...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢巴黎巴斯德研究所技术资源与研究中心（C2RT）化学生物学与生物筛选平台的 Fabrice Agou 和 Alix Boucharlat 对本实验方案提出的宝贵建议，感谢 BGPB 实验室全体成员的支持与科学讨论，以及 Simon Legood 对手稿的审阅。本工作由卡诺研究所传染病全球关怀计划和卡诺研究所微生物与健康计划（项目编号：15 CARN 0017-01 和 16 CARN 0023-01）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Äkta Purifier FPLC 系统GE HealthcareNA纯度：NA
Lnt 纯化
alkyne-POPEAvanti Polar Lipids900414P纯度：>99%
Lnt 底物
Azido-FAMLumiprobeA4130纯度：100%（纯品）
点击化学试剂
BioPhotometer PlusEppendorfN/A纯度：NA
OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select 酶标洗板机BioTekN° serie 115800，n° materiel 405 Select纯度：NA
洗涤步骤
生物素-荧光素Sigma53608纯度：≥90%
荧光对照
五水合硫酸铜(II)SigmaC3036纯度：≥98%
点击化学试剂
DDMAnatraceD310A纯度：≥ 99% β+α；< 15% α
Lnt 纯化用去垢剂
二甲基亚砜（DMSO）InvitrogenD12435纯度：无水
溶解用点击化学试剂
电子移液器 Voyager 8通道 0.5–12.5 µLINTEGRA4721纯度：NA
试剂操作
French 压力细胞N/AN/A纯度：NA
细胞破碎
FSL-1-生物素EMC microcollectionsL7030纯度：NA
Lnt 底物
Greiner Bio-One 384孔标准 CELLSTAR 聚苯乙烯微孔板Greiner781091纯度：NA
黑色，透明底（顶部或底部读数）
Greiner Bio-One 96孔无菌聚苯乙烯高结合力微孔板Greiner655097纯度：NA
黑色，透明底（顶部或底部读数）
微孔板读数仪 Infinite M1000 proTecanN/A纯度：NA
荧光检测
MTSES（2-磺酸乙基甲硫磺酸钠）AnatraceS110MT纯度：~100%
巯基特异性抑制剂
光学透明粘性密封膜Thermo ScientificAB-1170纯度：NA
用于密封多孔板的铝箔
Sephacryl S400 HR 16/60 凝胶过滤柱GE HealthcareGE28-9356-04纯度：NA
Lnt 纯化
StrepTactin Sepharose 50%IBA Biotechnology2-1201-010纯度：NA
Lnt 纯化
链霉亲和素SigmaS4762-1MG纯度：≥13 单位/mg 蛋白
生物素结合
TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺）Sigma678937纯度：97%
点击化学试剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）Sigma75259纯度：≥98%
点击化学试剂
TECAN Infinite F500TecanN/A纯度：NA
荧光检测
TECAN Infinite M1000 proTecanN/A纯度：NA
荧光检测
Thermomixer CEppendorf5382000015纯度：NA
加热盖
Triton X-100Sigma93443纯度：10% 水溶液
Lnt 反应缓冲液
超速离心机Beckman LCN/A纯度：NA
细胞组分分离

参考文献

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