基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

摘要

本文介绍了一种灵敏的荧光检测方法，利用二酰基甘油肽和炔基磷脂作为底物，结合点击化学反应，用于监测载脂蛋白N-酰基转移酶的活性。

摘要

变形菌门细菌的脂蛋白在翻译后会被膜磷脂来源的脂肪酸通过三种整合膜酶的作用进行修饰，从而形成三酰基化蛋白。脂蛋白修饰途径的第一步是将磷脂酰甘油上的二酰基甘油基团转移至前体脂蛋白上，生成二酰基甘油前体脂蛋白。第二步中，前体脂蛋白的信号肽被切除，形成载脂蛋白，随后该载脂蛋白再被来自磷脂的第三条脂肪酸所修饰。最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（Lnt）催化。该脂蛋白修饰途径在大多数γ-变形菌中至关重要，因此成为开发新型抗菌药物的潜在靶点。本文介绍了一种灵敏的Lnt检测方法，适用于对小型抑制分子进行高通量筛选。由于该酶及其底物均为膜结合分子，体外检测方法的建立并不简单，涉及在去垢剂存在条件下纯化有活性的酶、获取炔基磷脂和二酰基甘油肽底物，以及在混合胶束体系中优化反应条件。此外，为了将该活性检测用于高通量筛选（HTS）体系，优先采用对反应产物的直接检测，而非依赖偶联酶反应。在此荧光酶学检测法中，炔基三酰基化肽产物通过点击化学反应生成荧光信号，并在多孔板中进行检测。该方法也可应用于其他使用含脂肪酸底物（包括磷脂和酰基辅酶A）的酰基转移酶研究。

引言

细菌脂蛋白的特征是在其氨基末端通过共价结合的脂肪酸锚定在膜上^1,2。蛋白质的成熟部分在结构和功能上具有高度多样性，从而解释了脂蛋白在细菌细胞包膜多种生物学过程中的作用。

脂蛋白在插入细胞质膜后，会被磷脂衍生的脂肪酸修饰。前体脂蛋白含有一个特征性基序——脂盒（lipobox），其中包含一个不变的半胱氨酸残基，该残基会被酰化，并成为成熟蛋白的第一个氨基酸。该途径的第一步由前体脂蛋白磷脂酰甘油：二酰基甘油转移酶（prolipoprotein phosphatidylglycerol::diacylglyceryl transferase, Lgt）催化，该酶将二酰基甘油基团从磷脂酰甘油转移至前体脂蛋白，通过二酰基甘油与半胱氨酸之间的硫醚键连接。信号肽酶II（signal peptidase II, Lsp）切割二酰基甘油修饰的前体脂蛋白的信号肽，产生一种通过其二酰基甘油部分锚定在膜中的载脂蛋白。第三步也是最后一步由载脂蛋白N-酰基转移酶（apolipoprotein N-acyltransferase, Lnt）催化，该酶将一个脂肪酸从 sn磷脂的-1位点与载脂蛋白结合，形成三酰化成熟脂蛋白（图1)³Lnt反应是一种两步乒乓反应，反应过程中会....

方案

1. 酶和底物的制备

1. 酶的纯化
   1. 按照先前所述方法^4,8，从去垢剂溶解的膜中生产和纯化Lnt酶。简言之，在OD₆₀₀为0.6时，加入无水四环素（200 ng/mL）于37 °C诱导表达编码带有C端Strep标签的Lnt的lnt-strep基因，持续16 h。
   2. 在4,000 x g条件下离心10 min收集细胞，弃去上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于缓冲液WA（20 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，0.5 mM EDTA）中，使浓度达到每毫升100 OD₆₀₀单位。
   4. 使用法国压榨细胞破碎仪在10,000 psi压力下通过两次以破碎细胞。
   5. 在13,000 x g条件下离心20 min，去除未破碎的细胞和碎片，保留上清液并弃去沉淀。
   6. 将上清液在120,000 x g条件下离心60 min，收集膜囊泡（呈半透明棕色沉淀），弃去上清液。
   7. 用含1% (w/v) n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的缓冲液WA在室温（RT）下处理膜沉淀30 min，以溶解整合膜蛋白。在120,000 ....

结果

在Lnt反应中 sn-1 脂肪酸从磷脂转移至二酰基甘油肽，生成成熟的三酰基化肽⁸体外Lnt酶活性检测方法旨在利用含有炔基脂肪酸（alkyne-POPE）和FSL-1-biotin作为底物，生成炔基修饰的FSL-1-biotin（alkyne-FSL-1-biotin）。通过与叠氮标记的FAM（azido-FAM）发生点击化学反应后，该产物可被荧光标记，并通过荧光光谱法进行检测。图 2).

在酶浓度为1 ng/µL时，于酶标仪中在520 nm处获得最大荧光信号，反应条件已对此进行了优化。在此条件下，FSL-1-生物素被完全转化⁸（图3）。阴性对照包括无酶的反应、使用酶的无活性变体（活性位点突变体C387S）的反应，以及使用巯基特异性抑制剂MTSES的反应，这些均导致荧光信号检测值较低。生物素-荧光素可高效结合至链霉亲和素包被的微孔板，并用作最大荧光信号的.......

讨论

本文所述基于三酰化产物荧光检测的Lnt酶活性检测方法具有高灵敏度和良好的可重复性。生物素与链霉亲和素之间的特异性及高效结合是该检测方法的关键环节。Lnt反应完成后残留的炔基-POPE底物同样可被FAM荧光标记，但通过多次洗涤步骤，其在链霉亲和素包被的孔板上的结合物可被有效去除。此外，DMSO的加入不影响Lnt酶的活性，对检测体系亦无干扰。由于底物和酶均具有高度亲脂性，反应需在混合胶束体系中进行。依赖可溶性酶和底物进行产物检测的技术（如荧光偏振法）不适用于本实验⁸。该检测方法唯一的限制在于酶对炔基底物的兼容性，因为“点击化学”反应依赖于该化学基团的存在。

已有先前研究报道使用凝胶迁移实验分析Lnt活性并确定其底物特异性⁴。根据本实验方案，结合荧光光谱法，可通过凝胶内荧光检测来监测Lnt活性⁸，尽管该方法不适用于高通量筛选（HTS）。试管法对于Lnt突变体的动力学和比较研究尤为适用。可通过使用炔基脂肪酸（其具有不同的碳链长度和饱和度）对细菌进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Äkta Purifier FPLC 系统	GE Healthcare	NA	纯度：NA Lnt 纯化
alkyne-POPE	Avanti Polar Lipids	900414P	纯度：>99% Lnt 底物
Azido-FAM	Lumiprobe	A4130	纯度：100%（纯品） 点击化学试剂
BioPhotometer Plus	Eppendorf	N/A	纯度：NA OD 600 nm
BioTek ELX 405 Select 酶标洗板机	BioTek	N° serie 115800，n° materiel 405 Select	纯度：NA 洗涤步骤
生物素-荧光素	Sigma	53608	纯度：≥90% 荧光对照
五水合硫酸铜(II)	Sigma	C3036	纯度：≥98% 点击化学试剂
DDM	Anatrace	D310A	纯度：≥ 99% β+α；< 15% α Lnt 纯化用去垢剂
二甲基亚砜（DMSO）	Invitrogen	D12435	纯度：无水 溶解用点击化学试剂
电子移液器 Voyager 8通道 0.5–12.5 µL	INTEGRA	4721	纯度：NA 试剂操作
French 压力细胞	N/A	N/A	纯度：NA 细胞破碎
FSL-1-生物素	EMC microcollections	L7030	纯度：NA Lnt 底物
Greiner Bio-One 384孔标准 CELLSTAR 聚苯乙烯微孔板	Greiner	781091	纯度：NA 黑色，透明底（顶部或底部读数）
Greiner Bio-One 96孔无菌聚苯乙烯高结合力微孔板	Greiner	655097	纯度：NA 黑色，透明底（顶部或底部读数）
微孔板读数仪 Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	纯度：NA 荧光检测
MTSES（2-磺酸乙基甲硫磺酸钠）	Anatrace	S110MT	纯度：~100% 巯基特异性抑制剂
光学透明粘性密封膜	Thermo Scientific	AB-1170	纯度：NA 用于密封多孔板的铝箔
Sephacryl S400 HR 16/60 凝胶过滤柱	GE Healthcare	GE28-9356-04	纯度：NA Lnt 纯化
StrepTactin Sepharose 50%	IBA Biotechnology	2-1201-010	纯度：NA Lnt 纯化
链霉亲和素	Sigma	S4762-1MG	纯度：≥13 单位/mg 蛋白 生物素结合
TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺）	Sigma	678937	纯度：97% 点击化学试剂
TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）	Sigma	75259	纯度：≥98% 点击化学试剂
TECAN Infinite F500	Tecan	N/A	纯度：NA 荧光检测
TECAN Infinite M1000 pro	Tecan	N/A	纯度：NA 荧光检测
Thermomixer C	Eppendorf	5382000015	纯度：NA 加热盖
Triton X-100	Sigma	93443	纯度：10% 水溶液 Lnt 反应缓冲液
超速离心机	Beckman LC	N/A	纯度：NA 细胞组分分离